楊光勇

（新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所　新疆烏魯木齊　830004）

毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測定醫(yī)藥污水中氯霉素的含量

楊光勇

（新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所新疆烏魯木齊830004）

建立了毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測定醫(yī)藥污水中氯霉素（CAP）含量的方法。供試品經(jīng)離子化處理后用0.22μm微孔濾膜過濾，并用毛細(xì)管電泳儀直接對(duì)續(xù)濾液進(jìn)行測定；方法采用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)緩沖溶液pH值至6.0）作為分離緩沖液，未涂層毛細(xì)管柱（65 cm×75 μm，有效長度56 cm）作為分離柱，柱溫25℃，分離電壓25 KV，50 mbar壓力下進(jìn)樣10s，檢測波長為268 nm。結(jié)果表明：氯霉素平均回收率為98.1%（n=9），在5μg/mL～200μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r≥0.9991），檢出限≤0.2 μg/mL（S/N=3）。應(yīng)用此方法對(duì)6份供試品進(jìn)行檢測，有1份檢出氯霉素，其他各供試品均未檢出。此方法簡便、準(zhǔn)確且可靠，用于醫(yī)藥污水中氯霉素的測定，結(jié)果滿意。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳醫(yī)藥污水氯霉素

氯霉素屬于廣譜抑菌抗生素，是治療傷寒、副傷寒的首選藥，治療厭氧菌感染的特效藥物之一。但氯霉素可造成骨髓造血機(jī)能紊亂，導(dǎo)致嚴(yán)重的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，甚至引起可“灰嬰綜合征”。因此，監(jiān)測環(huán)境中殘留的氯霉素尤為重要。

目前，氯霉素的檢測方法主要有微生物法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等。但這些方法均操作繁瑣，涉及耗材價(jià)格昂貴，需消耗大量有毒有害試劑。毛細(xì)管電泳法是近年發(fā)展非常迅速的檢測手段，具有排放低、環(huán)境污染小、檢測成本低廉、樣品處理簡單快速、分析周期短等諸多優(yōu)勢。研究建立的方法兼具以上優(yōu)勢，準(zhǔn)確且可靠，為醫(yī)藥污水中氯霉素的檢測提供了經(jīng)濟(jì)高效的方法，同時(shí)為我國其他抗生素廢水的綜合治理，提供可借鑒的新思路和新方法。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1.儀器與試藥。7100高效毛細(xì)管電泳儀（美國Agilent公司，配備DAD檢測器），超純水儀（美國Millipore公司），pH計(jì)（瑞士Mettler-Toledo公司），針筒濾頭（0.22 μm，日本島津公司），玻璃微孔濾膜過濾器（北京鴻苑鑫儀科技有限公司），未涂層的彈性石英毛細(xì)管柱（65 cm×50 μm，有效長度56 cm，美國Agilent公司）。

氯霉素對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇（色譜純）購自Fisher公司，氫氧化鈉（分析純）、磷酸（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）購自西安化學(xué)試劑廠，醋酸鈉（分析純）、硼砂（優(yōu)級(jí)純）購自北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

2.方法。（1）儀器參數(shù)。配制10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)緩沖溶液pH值至6.0作為分離緩沖溶液；分離電壓為25 KV，柱溫為25℃，采集波長268 nm，壓力進(jìn)樣（50 mbar，10 s）。

（2）對(duì)照品溶液與供試品溶液的制備。精密稱取氯霉素對(duì)照品25 mg，置25 mL容量瓶中，加5 mL甲醇使溶解，用分離緩沖液稀釋至刻度作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。取儲(chǔ)備溶液1 mL加分離緩沖液稀釋至50 mL作為對(duì)照品溶液。

稱取適量磷酸二氫鈉，加污水制成10 mol/L的磷酸鹽溶液，并用0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)各溶液pH值至6.0，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

二、結(jié)果與討論

1.電泳條件的確定。

（1）緩沖體系pH值的選擇。氯霉素的等電點(diǎn)（pI）為7.5，分離緩沖體系的最佳pH值應(yīng)為6.5～8.5。配制20 mmol/L的磷酸二氫鈉溶液，用0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)pH值至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：隨著緩沖液pH值的增加，氯霉素遷移時(shí)間縮短，柱效升高，但堿性環(huán)境下氯霉素會(huì)迅速降解，因此，研究選擇pH值為6.0的緩沖體系進(jìn)行測定。緩沖體系pH值與各組分遷移時(shí)間的關(guān)系詳見圖1。

圖1　pH值對(duì)遷移時(shí)間的影響

（2）緩沖體系及濃度的選擇。配制硼砂溶液（40 mmol/L）、醋酸鈉溶液（20 mmol/L）、磷酸二氫鈉（20 mmol/L）溶液，并用0.2 mol/L磷酸溶液、0.2 mol/L氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)各溶液pH值至6.0進(jìn)行測定，結(jié)果顯示磷酸鹽體系和硼酸鹽體系均呈現(xiàn)良好的測定效果?？紤]到硼酸鹽對(duì)人體危害較大，因此實(shí)驗(yàn)采用磷酸鹽體系進(jìn)行測定。

分別配制5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L的磷酸鹽溶液，用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)磷酸鹽溶液pH值至6.0進(jìn)行測定。結(jié)果表明，隨著磷酸鹽濃度增加，電滲流減小，遷移時(shí)間延長；當(dāng)磷酸鹽濃度過小時(shí)，供試品液中氯霉素基質(zhì)干擾嚴(yán)重，而濃度較大時(shí)，焦耳熱明顯增加。緩沖體系濃度與氯霉素遷移時(shí)間的關(guān)系詳見圖2。綜合考慮，研究選取10 mmol/L磷酸鹽溶液進(jìn)行測定。

圖2　緩沖體系濃度對(duì)測定的影響

（3）進(jìn)樣時(shí)間的選擇。研究考查了進(jìn)樣時(shí)間對(duì)測定的影響。結(jié)果表明，待測組分峰高、峰面積和峰寬均隨進(jìn)樣時(shí)間的增加而增加，同時(shí)柱效降低；進(jìn)樣時(shí)間過長分離柱表現(xiàn)出過載現(xiàn)象，進(jìn)樣時(shí)間過短則會(huì)影響方法的靈敏度，因此研究選用的進(jìn)樣時(shí)間為10S。

（4）分離電壓的選擇。將分離電壓分別設(shè)置為15 kV、20 kV、25 kV、30 kV進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，隨著分離電壓的升高，電流亦隨之升高，待測組分遷移時(shí)間縮短，但焦耳熱明顯增加。綜合考慮，研究選取25 kV作為分離電壓。

在上述最佳分離條件下測定對(duì)照品溶液，得到電泳圖見圖3。

圖3　對(duì)照品溶液毛細(xì)管電泳圖

2.方法驗(yàn)證。

（1）線性范圍。向1號(hào)供試品中添加適量對(duì)照品溶液，制成待測組分質(zhì)量濃度分別為5 μg/ml，20 μg/ml，40 μg/ml，80 μg/ml，150 μg/m、200 μg/ml的梯度溶液進(jìn)行測定，圖4為1號(hào)供試品及其加標(biāo)后的電泳圖。

圖4　4號(hào)樣品（a）及加標(biāo)后（b）的電泳圖

以待測組分的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。結(jié)果表明：氯霉素在5 μg/ml～200 μg/ml濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好，且未見明顯的干擾峰。回歸方程見表1。

表1　氯霉素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率及檢出限

（2）檢出限和回收率。向1號(hào)供試品中添加適量對(duì)照品溶液，制成待測組分質(zhì)量濃度分別為10 μg/ml、80 μg/ml、150 μg/ml的溶液，每個(gè)加標(biāo)濃度各3份，在最佳條件下進(jìn)行測定，計(jì)算CAP的平均回收率（n=9）；同法測定方法檢出限，調(diào)節(jié)溶液中各組分濃度使信噪比為3，計(jì)算CAP的檢出限（S/N=3），結(jié)果見表1。

3.供試品的測定。供試品來源不同，基質(zhì)影響也不同。為此，方法采用DAD檢測器對(duì)供試品中各組分峰進(jìn)行紫外光譜掃描（190 nm～400 nm），再與對(duì)照品峰的紫外光譜圖進(jìn)行比對(duì)，并根據(jù)光譜純度閾值判定是否存在基質(zhì)干擾，有效避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

隨機(jī)選取烏市某街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站1家、醫(yī)院配液中心2家、醫(yī)院制劑室1家，制藥廠2家，在其工作場所的污水排放口量取適量污水，按1.2.2處理后進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。圖5為4號(hào)陽性檢出供試品的毛細(xì)管電泳圖。

表2　供試品中抗生素的測定結(jié)果（μg/mL）

圖5　4號(hào)供試品溶液毛細(xì)管電泳圖

三、結(jié)論

研究建立的方法豐富了醫(yī)藥污水中氯霉素的檢測手段，考察了分離緩沖液組成、pH值、分離電壓等因素對(duì)CAP測定的影響。該方法回收率及檢出限均能滿足一般分析要求；采用DAD檢測器作為輔助定性手段能有效避免假陽性結(jié)果出現(xiàn)，并能用于分析基質(zhì)的干擾。該方法具有成本低廉，樣品處理簡單，污染物排放低等優(yōu)點(diǎn)，用于廢水中氯霉素的測定，結(jié)果令人滿意；同時(shí)方法也可用于其他類型樣品中氯霉素的測定。

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