于亭 王春紅 張婷婷 汲添 武志海 楊美英

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118）

沙雷氏菌（Serratia marcescens）Yj1的分離鑒定及菌體有機磷降解酶的分離純化

于亭 王春紅 張婷婷 汲添 武志海 楊美英

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118）

從大豆土壤中分離純化得到一株具有卵磷脂和樂果降解能力的菌株Yj1，對該菌株進行鑒定、生長條件優(yōu)化、酶活性鑒定以及有機磷降解酶的分離純化。結(jié)果表明，Yj1與Serratia marcescens WW4（CP003959.1）的16S rDNA相似度為99%。正交試驗對所需培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到該菌株的最佳生長條件為甘露糖、蛋白胨和pH 8的組合。Yj1菌株在兩種磷源條件下，菌株生長量均很低，但72 h內(nèi)以大豆卵磷脂為磷源時的菌體生長情況優(yōu)于樂果。以大豆卵磷脂為磷源時酸性磷酸酶、堿性磷酸酶與有機磷降解酶活性明顯高于以樂果為磷源時的酶活，且72 h內(nèi)堿性磷酸酶活性一直都高于酸性磷酸酶和有機磷降解酶。硫酸銨沉淀法結(jié)合陽離子交換層析成功從Yj1菌體中分離純化了有機磷降解酶，SDS-PAGE結(jié)果顯示純化的蛋白為單一條帶。且陽離子交換層析的提純倍數(shù)是硫酸氨沉淀的5.303倍，硫酸氨沉淀為粗酶的1.416倍。

沙雷氏菌；Yj1；樂果；大豆卵磷脂；有機磷降解酶

磷是植物生長過程中的一種主要營養(yǎng)元素，在土壤中主要以難溶的礦物形態(tài)存在［1］。我國土壤全磷含量較高，耕地土壤一般為0.02%-0.11%［2］，但是能被植物直接吸收利用的有效磷含量一般不超過全磷量的5%［3］。大部分磷肥與土壤中的 Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+等結(jié)合，形成難溶性磷酸鹽，因此全國74%的耕地土壤缺磷，嚴重影響著植物生長。長期以來，為了提高農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量，人們大量使用化學(xué)肥料和農(nóng)藥，磷肥在施用后往往很快就被固定形成無效態(tài)磷［4，5］，造成了作物的低吸收和磷元素在土壤中的大量積累［6］。有機磷農(nóng)藥的有效利用率也僅為20%-30%，水田中施用的有機磷農(nóng)藥幾乎有90%左右都殘留在農(nóng)田中［7，8］，這些難溶或不溶性的有機磷化合物造成了嚴重的環(huán)境污染。

解磷菌能使土壤中難溶性或不溶性的磷轉(zhuǎn)化成易于被植物吸收利用的磷，從而提高土壤供磷水平［9］，同時還能促進農(nóng)作物對植物根系鋅、銅等其它營養(yǎng)元素的吸收、增強植物抗病能力，并減少環(huán)境污染［10］。目前報道的解磷菌主要有細菌［11］、真菌［12］和放線菌［13］，研究較多的是細菌。樂果（dimethoate）是廣泛使用的有機磷農(nóng)藥之一，為中等毒性、內(nèi)吸性有機磷類殺蟲劑、殺螨劑，在土壤中很容易沉降聚集，污染農(nóng)畜漁果產(chǎn)品，并通過食物鏈的富集作用轉(zhuǎn)移到人體，對人體產(chǎn)生危害［14］。目前分離到的樂果降解菌有蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）［15］，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［16］，即綠膿桿菌，不動菌屬（Acinetobacter）［17］，沙門氏菌、陰溝腸桿菌、枯草芽孢桿菌［18］等。

有機磷降解菌不僅種類繁多，并且對于不同的土壤、水域和植物的類型，解磷機制也不盡相同［19，20］。有機磷降解酶主要是水解酶類，通過切斷有機磷化合物中如：P-O鍵、P-F 鍵、P-S 鍵、P-CN等分子鍵，使之成為無毒的、溶于水的小分子，而且一種有機磷降解酶往往能降解多種有機磷化合物［21］。本研究從大豆土壤中分離到一株可降解卵磷脂的有機磷解磷菌，命名為Yj1，經(jīng)過16S rDNA鑒定后對其生物學(xué)特性進行研究時發(fā)現(xiàn)，該菌株還可以有效降解樂果。進一步對該菌株降解卵磷脂和樂果的特性進行研究，以期為土壤中有機磷化合物的有效利用以及有機磷農(nóng)藥的降解提供有效菌源，并為有機磷解磷菌劑的開發(fā)與應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤大豆根際土壤于2013年2月，從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆試驗田（經(jīng)度12519'、緯度4343'）進行采集，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選與純化 取1 g土壤樣品，加入100 mL滅菌的有機磷液體培養(yǎng)基，30℃，135 r/min搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后，取1 mL懸濁液逐級稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分別取以上各濃度樣品100 μL涂布于以卵磷脂為有機磷源的固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24-48 h。選擇有較大溶磷圈的單菌落，反復(fù)純化4次，直至形成均一的菌落，將其轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)至菌苔長出，置于4℃保存。

1.2.2 菌株鑒定 將純化后的有機磷解磷菌單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，135 r/min，30℃恒溫培養(yǎng)過夜，12 000 r/min、4℃離心10 min，收集菌體。進行細菌總DNA的提取，具體方法參照薩姆克魯斯J 拉塞爾［22］的方法。以菌株總DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR，引物序列：R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'，F(xiàn)：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸2 min，33個循環(huán)；后延伸7 min，4℃保存。反應(yīng)體系為：模板0.2 μL，上下游引物F、R各0.2 μL，LA Taq buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，eTaq聚合酶0.2 μL，無菌去離子水補至20 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。同時將產(chǎn)物純化回收后，送上海生物工程有限公司進行測序。測序序列與GenBank進行BLAST同源性比較，并利用Mega5.10軟件與相關(guān)菌株的16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株生長條件的優(yōu)化 以有機磷培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對碳源、氮源及pH值進行優(yōu)化，采用L933正交設(shè)計試驗優(yōu)化，供試因素及水平見表1。挑取Yj1單菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，OD600=0.6時，種子液按1%接種量接種于以大豆卵磷脂為有機磷源的培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min培養(yǎng)72 h，每隔6 h取樣，利用分光光度計測定OD600的吸光值。并對36 h生長量數(shù)據(jù)采用SPSS16. 0統(tǒng)計軟件和Excel進行方差的分析，進而確定碳源、氮源及pH值的最佳組合。

表1 正交試驗供試因子及水平

1.2.4 不同有機磷源中菌體生長曲線的測定 以正交試驗中確定的最佳培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，以大豆卵磷脂、樂果為有機磷源的未接菌培養(yǎng)基為對照。另取150 μL 種子液（種子液的制備同上）分別接入150 mL兩種磷源的有機磷培養(yǎng)基，30℃，150 r/min進行培養(yǎng)，每12 h取樣一次，測定OD600的吸光值。

1.2.5 酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性的測定 該酶活測定按照伊鋆［23］的方法進行。酶活測定菌體培養(yǎng)同上，每隔12 h吸取1 mL發(fā)酵液，加入pH值為6.5的MUB試劑，再加0.025 mol/L對硝基苯磷酸二鈉溶液1 mL，震蕩10 s。37℃反應(yīng)1 h后，加入1 mL 0.5 mol/L氯化鈣溶液和4 mL 0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液，震蕩并過濾懸液。將濾液在420 nm處比色，此為酸性磷酸酶活性測定方法；堿性磷酸酶時所用MUB試劑pH為8.0，其它步驟同酸性磷酸酶測定方法。酸性、堿性磷酸酶時以A420/min光吸收值增加0.001為一個酶活力單位。

1.2.6 有機磷降解酶活性的測定 該酶活測定按照金彬明［24］的方法進行。菌液的培養(yǎng)同上，每隔12 h取菌液0.9 mL，8 000 r/min 離心2 min，去上清，用0.9 mL pH 7.5的20 mmol/L的Tris-HCl懸起，為粗酶液。

取0.1 mL的0.05 mol/L樂果溶液、0.9 mL的粗酶液與比色管中，25℃下反應(yīng)45 min，加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，在加入1 mL 10%碳酸鈉溶液顯色，測定A405光吸收值。有機磷降解酶時以A405/min光吸收值增加0.001為一個酶活力單位。

1.2.7 有機磷降解酶的純化 將OD600=0.6 的Yj1種子液以1‰的量接入1 L 卵磷脂為磷源的有機磷培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min，培養(yǎng)48 h后4℃、4 000 r/min離心30 min離心收集菌體。每克菌以15 mL 20 mmol/L的Tris-HCl（pH7.5）緩沖液懸起，每毫升溶液加入1 mg溶菌酶充分攪拌后4℃靜置30 min，冰浴超聲波破碎（1 400 W、工作5 s、間歇9 s、50次循環(huán)）。4℃下10 000 r/min離心20 min。取上清逐步進行10%、20%、40%和65%的硫酸銨沉淀。沉淀用40 mL的Tris- HCl（20 mmol/L pH7.5）緩沖液懸起后，進行Sephadex G-25 Fine層析柱脫鹽，取流川液再進行陽離子交換層析（SP Sepharose Fast Flow），分別以含有0.1 mol/L、0.2 mol/L和0.5 mol/L三個濃度NaCl的Tris-HCl（20 mmol/L，pH7.5）進行階段洗脫；利用層析系統(tǒng)（AKTAPRIME）檢測流出組分。取流川及出峰時的流出液體進行有機磷降解酶活力測定，酶活測定方法同上。其中0.2 mol/L NaCl的Tris-HCl洗脫液的流出組分具有有機磷降解酶活性，SDS-PAGE檢測分離結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 有機磷解磷菌的分離與純化

以大豆卵磷脂為磷源，從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆試驗田土壤中分離到一株具有明顯解磷效果的菌株，將該菌株命名為Yj1。在以大豆卵磷脂（圖1-A）和樂果（圖1-B）為有機磷源的固體培養(yǎng)基中生長時，均有明顯透明圈。對該菌株的降解穩(wěn)定性進行實驗，經(jīng)過多次的連續(xù)傳代實驗，菌株遺傳特性比較穩(wěn)定。

圖1 大豆卵磷脂和樂果為磷源Yj1溶磷效果

2.2 細菌16S rDNA鑒定和及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以菌株Yj1的基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA引物進行PCR擴增，得到長度約為1.5 kb的擴增產(chǎn)物。對其進行回收，并測序。將測序序列利用GenBank DNA 數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比較，結(jié)果表明該菌株基因序列與Serratia marcescens WW4（CP003959.1）有較高的同源性，相似度為99%，因此該菌株被鑒定為沙雷氏菌（Serratia marcescens）。

圖2 Yj1系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用Mega5.10構(gòu)建了Yj1與文獻中相關(guān)有機磷農(nóng)藥降解細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2可知，31株溶磷菌的16SrDNA序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中主要分為兩個大的分支。其中，構(gòu)成第一個分支的菌以芽孢桿菌屬為主體；第二個分支菌株以假單胞菌屬為主體。Yj1屬于第一個分支，與芽孢桿菌屬和假單胞菌屬形成一簇。

2.3 Yj1菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

對Yj1菌株生長條件中pH值、碳源、氮源進行3因素、3水平的正交試驗，結(jié)果如表2，對所得結(jié)果進行方差分析（表3）。從表2看出，pH值、碳源、氮源對Yj1的生長均有影響。培養(yǎng)基的初始pH值在一定程度上影響菌株的生長量，pH值為8時菌株生長量最大。在以甘露糖為碳源時，菌株生長量最大，葡萄糖和蔗糖為碳源時菌株生長量較低。氮源不同菌株的生長量明顯不同，菌株在以蛋白胨為氮源時生長量最高，硝酸銨、硫酸銨為氮源時生長量低于前者。綜合正交試驗結(jié)果與方差分析結(jié)果表明，影響供試菌株生長量的主次順序為碳源＞ pH值＞氮源，本試驗的最優(yōu)組合為A2B2C1，即為甘露糖、pH8、蛋白胨。

2.4 不同磷源條件下Yj1生長曲線的測定

以大豆卵磷脂和樂果分別為磷源時，Yj1的生長曲線見圖3。從圖3可以看出，在以兩種有機磷化合物為磷源的培養(yǎng)基中生長時，菌體生長曲線均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。大豆卵磷脂為磷源時，24 h菌體生長進入平臺期。在開始的48 h菌體生長量達到最大。樂果為磷源時，菌體初期生長率要明顯低于大豆卵磷脂中的生長率，60 h菌體生長量達到最大值，之后呈現(xiàn)下降趨勢。兩種磷源條件下，菌株生長量均很低，OD600值不超過0.4。但是72 h內(nèi)以大豆卵磷脂為磷源時的菌體生長情況優(yōu)于樂果。

表2 L933正交實驗結(jié)果

表3 正交結(jié)果方差分析

圖3 不同磷源時菌株Yj1生長曲線

2.5 不同磷源條件下Yj1菌株解磷過程中酶活性的測定

當以大豆卵磷脂為磷源測定酸性磷酸酶、堿性磷酸酶與有機磷降解酶活性時，酶活性均呈先增長后下降的趨勢（圖4），酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和有機磷降解酶分別在36、12和48 h出現(xiàn)峰值，酶活分別為948 IU、694 IU和301 IU。72 h內(nèi)有機磷降解酶活性低于酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性。

當以樂果為磷源時，酸性磷酸酶活性最大值出現(xiàn)的時間與大豆卵磷脂為磷源時相同。而堿性磷酸酶和有機磷降解酶活性出峰時間與大豆卵磷脂明顯不同，分別是60 h和12 h。72 h內(nèi)堿性磷酸酶活性一直都依次高于酸性磷酸酶和有機磷降解酶。而且從圖4可看出，72 h內(nèi)以大豆卵磷脂為磷源時的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性與有機磷降解酶活性明顯高于以樂果為磷源時的酶活。

2.6 有機磷降解酶的純化及酶活分析

為了進一步明確Yj1菌株中有機磷降解酶的特性，收集以大豆卵磷脂為磷源、生長48 h Yj1所有菌體，超聲波破碎后進行硫酸氨沉淀以及陽離子交換層析分離純化，并對有機磷降解酶活性進行測定。結(jié)果（圖5）表明，在65%硫酸銨的沉淀中測得有機磷降解酶的活性，過G-25脫鹽柱后在陽離子交換層析過程中，0.2 mol氯化鈉洗脫液中酶活較強。以SDS-PAGE檢測蛋白結(jié)果顯示純化的蛋白為單一條帶。

對分級純化的酶液進行酶活測定，結(jié)果見表4。粗酶、硫酸銨沉淀以及陽離子交換洗脫液有機磷降解酶的比活力分別為57.270、81.100和430.107。提純倍數(shù)相比，陽離子交換層析是硫酸氨沉淀的5.303倍，硫酸氨沉淀僅為粗酶的1.416倍。

3 討論

田間長期施用磷肥及農(nóng)藥在造成土壤中磷素積累的同時，對環(huán)境也造成了極大的污染。解磷微生物可以有效的分解土壤中的無效態(tài)磷，釋放植物可以吸收利用的磷素［25］。研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）LPx［26］和副球菌屬（Paracoccus sp.）L3［13］能夠降解樂果；降解毒死蜱的有人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi）CP1［27］、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）CP6［27］和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia sp.）CP7［27］；生絲微菌屬（Hyphomicrobium sp.）MAP-1［27］和甲基桿菌屬（Methylobacterium sp.）MAP-2［28］能夠降解甲胺磷；寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas sp.）PF32［29］能夠降解甲基對硫磷， 黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens strain）HL1［30］、DAP33［30］和B4［30］等。本實驗從大豆根際土壤中分離得到的沙雷氏菌（Serratia marcescens）Yj1除了能夠降解大豆卵磷脂之外，對有機磷農(nóng)藥樂果也具有一定的降解能力。

圖4 大豆卵磷脂（A）和樂果（B）分別為磷源時Yj1的酶活性測定

圖5 純化得到的有機磷降解酶電泳圖

表4 酶活力損失表

碳源，氮源和pH值在一定程度上影響著微生物的生長。趙小蓉［31］研究發(fā)現(xiàn)，曲霉 2TCiF2 在蔗糖為碳源時溶磷活力最高，節(jié)桿菌1TCRi7 只有在葡萄糖為碳源時才具有溶磷能力。陳燕飛［32］研究顯示，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均在pH為7的條件下生長情況最佳。本實驗以碳源、氮源和pH值為因素進行了三因素三水平的正交試驗，對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。得出影響供試菌株生長量的主次順序為碳源＞ pH值＞氮源。這與曲霉 2TCiF2的碳源生長條件實驗結(jié)果一致。

鐘傳青等［33］研究表明，解磷微生物產(chǎn)生的植酸酶、核酸酶和磷酸酶等加速了植酸、核酸、磷脂等含磷有機化合物的分解，促進磷素釋放，可以提高植物磷素營養(yǎng)，且貧磷條件可以促進酸性和堿性磷酸酶活性的增加。目前，關(guān)于酸性磷酸酶與堿性磷酸酶特性的研究較多［34］。本實驗對大豆卵磷脂和樂果為磷源時的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶與有機磷降解酶的活性進行了測定。結(jié)果表明，兩種磷源條件下0-72 h內(nèi)，有機磷降解酶的活性低于酸性磷酸酶和堿性磷酸酶，在48 h，大豆卵磷脂為磷源時的有機磷降解酶活性高是樂果為磷源時的6倍。

劉玉煥等［35］從曲霉菌中分離純化出有機磷農(nóng)藥降解酶，此酶對有機磷農(nóng)藥樂果具有較好降解作用。金彬明等［24］從海洋微生物 M-1 中分離純化出有機磷降解酶，最適pH7.5。Munnecke［36］發(fā)現(xiàn)有機磷農(nóng)藥降解酶的降解效果遠遠勝于微生物本身，特別是對低濃度的農(nóng)藥。因此，有機磷農(nóng)藥降解酶目前已被公認為是消除農(nóng)藥殘留的最有潛力的新方法。所以本實驗以大豆卵磷脂為磷源，通過硫酸銨沉淀法和陽離子交換層析法對有機磷降解酶進行了純化，提純后的酶活分別為粗酶活的1.416和7.510倍。與金彬明所純化出的能夠降解甲基對硫磷的有機磷降解酶不同，本實驗所純化出的能夠降解樂果的有機磷降解酶與陽離子交換柱結(jié)合，帶正電荷，且此蛋白對有機農(nóng)藥樂果有較好的降解作用。

4 結(jié)論

本實驗從大豆土壤中篩選并純化得到了一株具有穩(wěn)定降解有機磷的沙雷氏菌（Serratia marcescens）Yj1。該菌株的最佳培養(yǎng)條件為：pH8，以甘露糖為碳源，以蛋白胨為氮源。以大豆卵磷脂為有機磷源時菌體生長良好。堿性磷酸酶的活性優(yōu)于酸性磷酸酶以及有機磷降解酶的活性。通過硫酸銨沉淀法和陽離子交換層析法，從Yj1菌體純化獲得了單一條帶的有機磷降解酶。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Isolation and Identification of Serratia marcescens Yj1，and Separation and Purification of Organophosphate Degrading Enzymes

Yu Ting Wang Chunhong Zhang Tingting Ji Tian Wu Zhihai Yang Meiying
（Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

The strain Yj1 isolated and purified from the soybean soil could degrade soy lecithin and dimethoate. The 16S rDNA identification of the strain， optimization of growth conditions and examination of enzyme activities were performed and organophosphate degradation enzyme from Yj1 was separated and purified. The results revealed that the similarity of 16S rDNA in Yj1 and Serratia marcescens WW4（CP003959. 1）was 99%. The orthogonal experiment for the culture medium demonstrated that the optimal growth condition of Yj1 was the combination of mannose， peptone and pH8. The growth rate of Yj1 was poor in either of 2 phosphorus sources；however， the growth rate in soy lecithin was better than that in the dimethoate within 72 h. Moreover， the activities of acid phosphatase， alkaline phosphatase and organophosphate degrading enzyme（ODE）were higher when the soybean lecithin as the sole phosphorus source than those of dimethoate， and the activity of alkaline phosphatase was obviously greater than that of acid phosphatase and ODE within 72 h. ODE was successfully purified from Yj1 by combining ammonium sulfate precipitation and SP Sepharose Fast Flow. SDS-PAGE results showed that the purified protein was in a single band. The purified multiple by SP Sepharose Fast Flow was 5. 303 times as many by ammonium sulfate precipitation， and by the latter 1. 416 times as many by crude enzyme.

Serratia marcescens；Yj1；dimethoate；soy lecithin；organophosphate degrading enzyme

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.027

2014-11-17

國家自然科學(xué)基金（31201687）

于亭，女，研究方向：生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能；E-mail：m18643173059@163.com

楊美英，女，副教授，研究方向：土壤解磷微生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：jlaumeiying@163.com