龐志偉路旭胡江春陳曉琦王楠宋艷玲

（1.沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院，沈陽 110142；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽 110016；中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞氧爆發(fā)的海綿共附生真菌HMP-F66的篩選與鑒定

龐志偉1，2路旭2，3胡江春2陳曉琦2，3王楠2宋艷玲1

（1.沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院，沈陽 110142；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽 110016；中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

激發(fā)植物本身的天然免疫系統(tǒng)可作為防控植物病害的新途徑。以50株分離自繁茂膜海綿的真菌為受試菌株篩選具有誘導(dǎo)植物抗性活性的菌株及其代謝產(chǎn)物。采用基于H2DCF-DA的熒光酶標(biāo)法考察這些真菌的粗代謝物誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞產(chǎn)生氧爆發(fā)的活性，最終篩選到一株真菌HMP-F66能夠顯著誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧。根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征、特征性生理生化反應(yīng)以及基于rDNA ITS的分子生物學(xué)分析，推測該菌株為米曲霉（Aspergillus oryzae）。

米曲霉；黃曲霉；繁茂膜海綿；氧爆發(fā)；誘導(dǎo)抗性

曲霉屬（Aspergillus）真菌含有約300個(gè)種，是廣泛分布于各種氣候條件下的一類常見的絲狀真菌［1］。曲霉多易生長在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中，含淀粉豐富的食物尤其適合曲霉的生長［2］。其中黃曲霉（A. flavus）和米曲霉（A. oryzae）是最為人們所熟知的兩個(gè)曲霉，前者因產(chǎn)生強(qiáng)烈致癌物質(zhì)黃曲霉素而成為食品安全的重要威脅，后者則在食品釀造工業(yè)和酶工業(yè)中發(fā)揮著的不可替代的作用［2］。米曲霉在我國及日本、韓國應(yīng)用于酒類、醬油及食醋的釀造已經(jīng)有超過2 000年的歷史了。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)米曲霉的代謝物具有抗真菌［3］、細(xì)胞毒［4］等活性。但尚未見有關(guān)其代謝物誘導(dǎo)植物抗性的報(bào)道。

氧爆發(fā)（Oxidative burst）是植物免疫反應(yīng)中重要的早期事件［5-7］。植物細(xì)胞在遇到病原菌侵害、機(jī)械力損傷等情況下會(huì)快速地產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。ROS可以增強(qiáng)細(xì)胞壁交聯(lián)，激活防御相關(guān)的基因，并合成抗菌蛋白和植物抗毒素，乃至最終誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡［8］。在氧爆發(fā)過程中，植物細(xì)胞壁通過加強(qiáng)質(zhì)膜結(jié)合的NADPH氧化酶、細(xì)胞壁結(jié)合的過氧化物酶和質(zhì)外體中的氨氧化酶的活力，提高ROS的產(chǎn)量［9，10］。此外，H2O2也可能發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而激活水楊酸信號(hào)通路，通過水楊酸的積累，激活特異防御途徑，最終使植物體建立獲得性抗性［11］。因此可以通過激發(fā)植物自身的抗性這一途徑來實(shí)現(xiàn)對病蟲害的合理防控。由于激活植物抗性的激活劑作用于植物本身，毒性為這類新型農(nóng)藥的非必要特性，因此具有更佳的安全性。

本研究通過誘導(dǎo)氧爆發(fā)這一細(xì)胞反應(yīng)特征來發(fā)現(xiàn)具有潛在的誘導(dǎo)植物抗性反應(yīng)的先導(dǎo)化合物。以分離自大連凌水橋附近海域潮間帶繁茂膜海綿（Hymeniacidon perleve）的50株真菌為受試菌株，通過測試激活煙草植物細(xì)胞產(chǎn)生活性氧水平來篩選目標(biāo)菌株，并對這一菌株進(jìn)行菌種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 繁茂膜海綿（Hymeniacidon perleve）樣品采集自渤海灣大連淩水橋海域的潮間帶，從中分離得到50株真菌。所有菌株保藏于中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所農(nóng)業(yè)微生物組。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬丁培養(yǎng)基（酵母膏0.5 g，葡萄糖1.0 g，蛋白胨0.5 g，海鹽2.5 g，蒸餾水100 mL，pH7.0-7.2），用于菌株活化。察氏培養(yǎng)基（硝酸鈉0.3 g，磷酸氫二鉀0.1 g，硫酸鎂0.05 g，氯化鉀0.05 g，硫酸亞鐵0.001 g，蔗糖3.0 g，瓊脂2.3 g，蒸餾水100 mL）用于菌株的保存及鑒定。馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基（20%土豆浸出液100 mL，葡萄糖2 g，pH7.0-7.2），用于液態(tài)發(fā)酵時(shí)種子液的培養(yǎng)。

1.1.3 煙草細(xì)胞 煙草（Nicotiana tabacum）細(xì)胞用固態(tài)MS培養(yǎng)基（Murashige and Skoog medium）進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和繼代。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)采用pH5.75不含瓊脂的MS培養(yǎng)基在恒溫25℃條件下?lián)u瓶（110 r/min）暗培養(yǎng)。每周轉(zhuǎn)接4 mL 細(xì)胞懸液至100 mL 新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。檢測用細(xì)胞采用處于對數(shù)生長期（培養(yǎng)6-10 d）的煙草懸浮細(xì)胞。

1.1.4 試劑與溶液 蛋白酶K溶液：50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，10 mmol/L CaCl2，終濃度為20 mg/mL的蛋白酶K。TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0。1%瓊脂糖凝膠電泳試劑：瓊脂糖0.2 g，TAE緩沖液（pH7.6，4 mol/L Tris-HCl 2.5 mL加0.05 mol/L EDTA 5 mL，定容至250 mL）20 mL，核酸染料2 μL。

1.2 方法

1.2.1 菌株粗代謝產(chǎn)物的制備 將50株真菌分別接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中。每500 mL三角瓶裝100 mL液體培養(yǎng)基，并接種3塊直徑10 mm的長滿菌絲的固體培養(yǎng)基。28℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)8 d。發(fā)酵結(jié)束后，向過濾后的發(fā)酵液中加入3 g大孔吸附樹脂，110 r/min振蕩2 h。抽濾得樹脂，先用純水洗樹脂2次，再用甲醇解吸附3次。甲醇溶液減壓濃縮并冷凍干燥得粗代謝產(chǎn)物。

1.2.2 激活氧爆發(fā)活性篩選［12，13］煙草懸浮細(xì)胞在25℃、110 r/min、暗條件下培養(yǎng)8 d。向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入溶解于DMSO中的H2DCF-DA，使得其終濃度為10 μmol/L，在28℃暗條件下孵育30 min。檢測時(shí)取的細(xì)胞懸浮液于96孔板中（150 μL/孔），以水楊酸為陽性對照（SA，400 μmol/L）。加入50 μL濃度為1 mg/mL試驗(yàn)樣品進(jìn)行處理。應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀Synergy HT檢測H2O2產(chǎn)量，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為528 nm。各處理重復(fù)3次。

1.2.3 菌株的培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)觀察 培養(yǎng)特征：將菌株接種于查氏培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4-10 d，并記錄菌株的菌落顏色、邊緣、質(zhì)地及色素產(chǎn)生情況等特征。形態(tài)特征：采用插片培養(yǎng)法28℃培養(yǎng)4 d后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，在電子顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)特征。

1.2.4 菌株的生理生化特征 氫醌染色實(shí)驗(yàn)：用10 mg/mL的氫醌溶液噴于菌落上，繼續(xù)培養(yǎng)1-2 d，觀察菌落邊緣的顏色。茴香醛染色實(shí)驗(yàn)：用含0.05%的茴香醛的查氏培養(yǎng)基斜面30℃培養(yǎng)菌株一個(gè)月，觀察孢子是否變?yōu)榉凵?。大米褐變?shí)驗(yàn)：將10 g米飯置于100 mL的錐形瓶中，接種菌株并在34℃培養(yǎng)40 h。加入50 mL蒸餾水并過濾。室溫放置，觀察大米褐變情況。黃曲霉素產(chǎn)生情況：用大米作為培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株。用MeOH-H2O（55∶45，V/V）超聲提取30 min，提取液用正己烷萃取2次，下層繼續(xù)用CH2Cl2萃取。CH2Cl2層回收溶劑后用丙酮-CH2Cl2（3∶7，V/V）進(jìn)行TLC（GF254）展板，在365 nm下觀察熒光斑點(diǎn)。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定 菌株HMP-F66搖床培養(yǎng)2 d后收集菌體，利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取HMP-F66的DNA。50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中包括10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，ITS1和ITS4引物各1 μL，Taq酶0.5 μL，模板1 μL，最后加重蒸水補(bǔ)足至50 μL。以ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）為引物，擴(kuò)增菌株的rDNA ITS（Internal Transcribed Spacer）序列。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；56℃退火40 s；72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行純化和序列測定。序列通過BLAST進(jìn)行同源性比對后，利用MEGA 6.06進(jìn)行多序列比對，最終用Maximum likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 篩選結(jié)果

活性篩選結(jié)果（圖1）表明，在當(dāng)前測試濃度下菌株HMP-F66在100 min內(nèi)能夠誘導(dǎo)煙草細(xì)胞持續(xù)性地產(chǎn)生過氧化氫。其誘導(dǎo)煙草細(xì)胞氧爆發(fā)的活性極顯著地（P＜0.01）高于陽性對照水楊酸（400 μmol/L）的活性，說明HMP-F66的代謝物能夠顯著地誘導(dǎo)煙草細(xì)胞產(chǎn)生氧爆發(fā)反應(yīng)。

圖1 菌株HMP-F66的粗代謝物誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞持續(xù)性產(chǎn)生過氧化氫（RHP∶H2O2相對產(chǎn)量）

2.2 菌株的培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)

如圖2所示，HMP-F66生長迅速，菌落最初呈白色，逐漸變?yōu)辄S色或者黃色稍含淺綠色，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長綠色逐漸加深，但仍以黃色為主；邊緣呈白色，整齊；中心圓形區(qū)域微隆起；質(zhì)地疏松；無滲出物；背面黃棕色，培養(yǎng)約7 d后出現(xiàn)近圓形（還可見同心圓伴隨輻射狀）褶皺；無菌核產(chǎn)生。光學(xué)顯微鏡下可見菌絲有隔膜，為多細(xì)胞霉菌。菌絲體產(chǎn)生大量分生孢子梗，孢子梗很長，表面粗糙。分生孢子梗頂端膨大成燒瓶狀頂囊，分生孢子頭可見球形放射狀和類掃帚狀兩種。頂端著生成串的球形分生孢子，分生孢子呈黃棕色。在電子顯微鏡下可見分生孢子呈球形或者近球形，直徑約4.0 μm，表面粗糙，具褶皺狀紋理，無小刺。

圖2 HMP-F66菌落形態(tài)和顯微形態(tài)

2.3 菌株的生理生化特征

氫醌染色實(shí)驗(yàn)：噴灑氫醌溶液的菌落的邊緣呈現(xiàn)紅褐色；茴香醛染色實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)1個(gè)月的菌株未出現(xiàn)粉色孢子的產(chǎn)生；大米培養(yǎng)基在褐變實(shí)驗(yàn)中逐漸變黃；在TLC薄層板上未觀察到黃曲霉素特征性熒光斑點(diǎn)。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

將菌株HMP-F66 的DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行測序，得到長度為525 bp 的序列，將該序列（GenBank登錄號(hào)KP171697）與GenBank核酸序列庫的相關(guān)菌株進(jìn)行相似性比對，選取12 株同源性高的模式菌株，利用MEGA6.06 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，菌株HMP-F66 與菌株Aspergillus oryzae TUHT 114以及Aspergillus flavus TUHT189在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支，同源性達(dá)100%。

圖3 真菌HMP-F66基于rDNA ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 菌種鑒定結(jié)果

HMP-F66的菌落特征、顯微形態(tài)、特征生化反應(yīng)等均表明該菌株應(yīng)為與黃曲霉類似的曲霉菌，進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明該菌株為米曲霉或者黃曲霉。米曲霉和黃曲霉的形態(tài)學(xué)特征及培養(yǎng)特征非常相似，但一般來說，米曲霉通常具有較長的分生孢子梗，而黃曲霉的孢子梗通常較短［14，15］。米曲霉的分生孢子顏色為黃色或者棕黃色（Strawcolored），而黃曲霉的分生孢子顏色則通常為綠色［16］。與米曲霉相比，黃曲霉更容易形成菌核［15］。此外，孢子不能在含茴香醛的培養(yǎng)基上變?yōu)榉凵渤Ｗ鳛閰^(qū)分曲霉的依據(jù)［14，15］，但這一判斷方法的可靠性并沒有得到驗(yàn)證。米曲霉作為食品發(fā)酵用菌株具有長期的安全應(yīng)用歷史，因此是否產(chǎn)生黃曲霉素也是判別二者的依據(jù)［15］。綜上，HMP-F66具有較長的分生孢子梗、分生孢子呈棕黃色、不產(chǎn)生菌核、TLC檢測未見黃曲霉素特征性熒光斑點(diǎn)，這些特征更支持該菌株為米曲霉而非黃曲霉。因此，我們推測HMP-F66為米曲霉（A. oryzae）。

3 討論

米曲霉和黃曲霉均屬于曲霉屬環(huán)繞亞屬（Circumdati）黃綠組（Flavi），前者不產(chǎn)生黃曲霉素，在東亞國家的食品發(fā)酵中具有較長的應(yīng)用歷史。研究表明，米曲霉應(yīng)是在長期的食品發(fā)酵過程中通過水平基因轉(zhuǎn)移，從黃曲霉的一個(gè)類群（Group I）進(jìn)化/馴化而來［17，18］，因此二者在分類學(xué)上的關(guān)系非常接近，它們具有近乎一致的DNA/DNA雜交，其形態(tài)學(xué)差別也很微小。實(shí)際上，近年來的全基因組研究更支持將米曲霉和黃曲霉歸屬于同一個(gè)種而非兩個(gè)獨(dú)立的種［17，19，20］。因此，目前對于二者的區(qū)分更多地依賴于形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征等鑒別手段而不是其遺傳學(xué)特征［21，22］。Murakami［15］通過對406株曲霉的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征以及生理生化反應(yīng)等多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行基于主成分分析后歸納出了不同曲霉的分類學(xué)判定方法。Christensen［16］依據(jù)頂囊、孢子頭、孢子梗、孢子及菌核形態(tài)給出了黃曲霉類真菌的檢索表。雖然如此，黃曲霉和米曲霉的形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征仍然具有很大重疊性［15，16］。需要指出的是，雖然現(xiàn)有的證據(jù)更支持HMP-F66為米曲霉，但我們對于該菌株的鑒別仍有不足的地方：首先，菌核的產(chǎn)生與否會(huì)受到培養(yǎng)條件的影響，實(shí)際上菌核本身的形態(tài)更具有判別價(jià)值［16］。由于我們尚未觀察到HMP-F66產(chǎn)生的菌核，因此無法根據(jù)這個(gè)特征來判別。其次，Murakami［15］認(rèn)為單層或者雙層產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與分生孢子的尺寸之間的關(guān)系可以在一定程度上區(qū)別黃曲霉和米曲霉，但受限于目前的條件，我們未能區(qū)分該菌株是單層或者雙層產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。此外，黃曲霉素的產(chǎn)生與否是判別米曲霉的必要但非充分條件，我們認(rèn)為采用基于LC-MS等更加精確的手段檢測黃曲霉素也可作為輔助性的判別方法。

米曲霉是重要食品發(fā)酵工業(yè)和酶工業(yè)生產(chǎn)菌株。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)米曲霉可以合成新型環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid，CPA）類化合物，這種化合物對植物根系的生長具顯著的影響［23］。因此推測，該化合物可能因?yàn)槠渑c生長素（IAA）相似的結(jié)構(gòu)母核而成為IAA的類似物，競爭性地拮抗IAA與受體的結(jié)合，從而抑制IAA的作用。又因?yàn)镮AA可降低植物抗病性［24］，而阻滯IAA則可以提高植物的抗病性［25，26］，因此認(rèn)為CPA類化合物是潛在的植物抗性誘導(dǎo)劑。HMP-F66表現(xiàn)出了顯著的誘導(dǎo)煙草細(xì)胞產(chǎn)生氧爆發(fā)的活性，這可能與米曲霉基因組中的CPA合成基因表達(dá)合成CPA有關(guān)。因此，尚需進(jìn)一步闡明該菌株誘導(dǎo)氧爆發(fā)活性的代謝產(chǎn)物是否與CPA的合成有關(guān)。

4 結(jié)論

從50株繁茂膜海綿共附生真菌中篩選出一株可顯著誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞產(chǎn)生氧爆發(fā)的菌株。通過形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征性反應(yīng)、分子生物學(xué)等方法推測菌株為米曲霉（A. oryzae）。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening and Identification of a Sponge-associated Fungus HMP-F66 Inducing Oxidative Burst in Tobacco Cell Suspensions

Pang Zhiwei1，2Lu Xu2，3Hu Jiangchun2Cheng Xiaoqi2，3Wang Nan2Song Yanling1
（1. College of Pharmaceutical and Biological Engineering，Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang 110142；2. Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016；3. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049）

The plant innate immune system provides an alternative way for crop protection， and the plant immunity triggers have been an important source of biorational pesticide leads. In order to find new plant resistance inducers， fifty sponge-associated fungal isolates were screened for their ability to induce oxidative burst in the tobacco suspensions using the H2DCF-DA fluorescence assay. Strain HMP-F66 showed significant activity in inducing H2O2 production in tobacco suspensions. HMP-F66 was assumed to be Aspergillus oryzae by its morphological，physiological， cultural characters， and rDNA ITS sequence analysis.

Aspergillus oryzae；Aspergillus flavus；Hymeniacidon perleve；oxidative burst；induced resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.026

2014-12-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471814）

龐志偉，男，碩士研究生，研究方向：海洋微生物活性代謝物；E-mail：503492138@qq.com

王楠，男，副研究員，研究方向：微生物活性代謝物，E-mail：wangn@iae.ac.cn；宋艷玲，女，副教授，研究方向：新藥中間體研究，E-mail：yanlingsong521@126.com