江翱李偉，2

（1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，荊州 434025）

黃鱔轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1基因的克隆及表達(dá)分析

江翱1李偉1，2

（1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，荊州 434025）

旨在研究黃鱔轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1基因的功能及其組織表達(dá)特異性，采用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)從黃鱔肝臟中分離其轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1基因，用生物信息學(xué)方法對獲得的氨基酸序列進(jìn)行分析，用半定量RT-PCR技術(shù)研究各組織中TfR1表達(dá)水平。結(jié)果表明，克隆獲得黃鱔TfR1，GenBank注冊序列號為KF819396。該cDNA全長2 839 bp，5' UTR長134 bp，3' UTR長380 bp，編碼一個長774個氨基酸的多肽鏈。氨基酸多序列比對結(jié)果表明，黃鱔TfR1基因推斷的氨基酸序列同其他魚類的同源性較高，達(dá)55.68%-68.41%；而同哺乳動物的TfR1基因同源性較低。半定量RT-PCR分析表明，黃鱔TfR1基因轉(zhuǎn)錄本在不同組織表達(dá)量有明顯差異；在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，而在腎臟、脾臟和小腸中表達(dá)中等，在肝臟、胃、皮膚、腦、心臟和肌肉中表達(dá)量很低。

黃鱔；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1；RACE技術(shù)；RT-PCR技術(shù)

鐵離子代謝平衡對生命體至關(guān)重要，包括活性氧運(yùn)輸、電子傳遞和DNA合成等過程都離不開鐵離子的參與。游離鐵離子的濃度也是病原菌賴以生存及病感染機(jī)體造成危害的重要因素［1］。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）是一種細(xì)胞膜相關(guān)糖蛋白，是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鐵離子吸收的“開關(guān)”。盡管TfR分子不直接和細(xì)胞中的鐵離子結(jié)合，但卻可通過調(diào)控與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，Tf）的結(jié)合達(dá)到細(xì)胞內(nèi)鐵離子運(yùn)輸和存儲平衡［2］。目前，已知轉(zhuǎn)鐵蛋白受體有兩類（TfR1和TfR2），它們在分子結(jié)構(gòu)上比較相似，但表達(dá)調(diào)控模式和功能上有著較大差異［3］。TfR1分子幾乎可以在所有正常細(xì)胞中表達(dá)，但在成熟紅細(xì)胞及多能造血干細(xì)胞中很少或幾乎不表達(dá)［2］；TfR2分子則是一種特異性介導(dǎo)肝臟細(xì)胞鐵離子代謝的糖蛋白，主要在肝臟及十二指腸隱窩細(xì)胞中表達(dá)［4］。TfR1分子目前比較明確的作用就是調(diào)控細(xì)胞對鐵離子的吸收［2］，而TfR2分子對體內(nèi)鐵平衡的調(diào)節(jié)作用比它對鐵的攝取作用重要得多［5］。迄今為止，只有人類和小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因及其功能進(jìn)行了較為深入的研究。牛［6］、豬［7］、大菱鲆［8］和草魚［9］等少數(shù)物種上也已有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體分子被報道。有關(guān)于黃鱔轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因及其功能的研究國內(nèi)外尚無報道。黃鱔是我國及許多東南亞國家重要的淡水養(yǎng)殖種類，具有較高的食用和藥用價值?？寺〔⒀芯科滂F離子代謝相關(guān)功能基因有助于了解黃鱔抗細(xì)菌病的分子機(jī)制及促進(jìn)黃鱔健康養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本研究通過同源克隆結(jié)合RACE的方法從黃鱔肝臟cDNA中克隆了TfR1基因cDNA全長，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析并研究其組織表達(dá)特異性，旨在為深入了解魚類TfR1基因在鐵離子代謝中的作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成體黃鱔（體質(zhì)量75-110 g）購買于荊州市太湖水產(chǎn)市場。pMD18-T克隆載體、PrimeScript RT reagent試劑盒、DL2000 DNA Marker等購至大連TaKaRa公司；Trizol試劑購買于Invitrogen公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA凝膠回收試劑盒為北京全式金公司產(chǎn)品；Smart Race cDNA Amplification Kit試劑盒購買于Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取、引物設(shè)計及cDNA片段獲得隨機(jī)選取3條鱔魚進(jìn)行解剖取其血細(xì)胞、心臟、肝臟、脾臟、胃、腎臟、皮膚、肌肉、腸和腦等10種組織速凍于液氮中，保存于-80℃冰箱，用于RNA的提取?？俁NA提取采用Trizol試劑按照說明書進(jìn)行。cDNA合成用TaKaRa公司的PrimeScript RT regent試劑盒按照說明書進(jìn)行。根據(jù)GenBank上報道的豬（Sus scrofa，NP_999166.1）、普通狨（Callithrix jacchus，NP_001288776.1）、人（Homo sapiens，BAF84-412.1）、獰貓（Caracal caracal，AFM73555.1）、黃牛（Bos taurus，ADE09354.1）、 斑 馬 魚（Danio rerio，NP_001009917.1）、青鳉（Oryzias latipes，XP_0040-79020.1）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss，CDQ90669.1）和紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes，XP_003975880.1）的TfR1基因cDNA序列設(shè)計了簡并性引物de-F（5'-ccctcsttyaaycacacncagtt-3'）和de-R（5'-gccctggatgntccaggtggc-3'）用來擴(kuò)增肝臟cDNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)回收純化后克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑取3個陽性克隆送上海博尚生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.2 黃鱔TfR1基因cDNA全長的獲得 根據(jù)上述所得cDNA片段，設(shè)計基因特異性引物GSP5（5'-ga atgtgggtagccatgcctgctgtg-3'）和GSP3（5'-acatccagaacagcgacctg-3'）用來進(jìn)行RACE擴(kuò)增。RACE采用Smart Race cDNA Amplification Kit試劑盒說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑取3個陽性克隆送上海博尚生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。將上述所得5' UTR、3' UTR及中間cDNA片段進(jìn)行拼接后即得黃鱔TfR1基因cDNA全長。

1.2.3 黃鱔TfR1基因序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建 利用SignalP 4.1軟 件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）對黃鱔TfR1基因推斷的氨基酸序列進(jìn)行信號肽預(yù)測。采用蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析軟件prosite（http：prosite.expasy.org/cg-bin/prosite/）對其進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)的分析。采用SMART軟件對其進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析（http：//smart.emblheidelberg.de/）。用DNAMAN軟件對不同物種的TfR1基因進(jìn)行多序列比對。采用MEGA4.0軟件中的N-J法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.2.4 黃鱔TfR1基因組織表達(dá)分析 將各組織總RNA用無RNAase的DNase I消化后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一條鏈。采用基因特異性引物rt-F1（5'-gtccatgatcatctattgcggat-3'）和rt-R1（5'- gtactccaccttcatgatgc-3'）檢測各組織中TfR1基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量，以β-actin基因的表達(dá)量為內(nèi)參，設(shè)計的β-actin的引物為actin-F1（5'-gctgtgctgtccctgta-3'）和actin-R1（5'-gagtagccacgctctgtc-3'）。

2 結(jié)果

2.1 黃鱔TfR1基因cDNA序列分析

以簡并引物de-F/de-R和黃鱔肝臟cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得了1條約長1 300 bp的條帶，經(jīng)序列測定后認(rèn)為是TfR1基因的cDNA片段。經(jīng)過5' RACE和3' RACE擴(kuò)增分別獲得了該基因的5' UTR區(qū)域和3' UTR區(qū)域，序列拼接后得到了全長cDNA序列（GenBank登錄號：KF819396）。序列分析（圖1）表明，黃鱔TfR1基因cDNA全長2 839 bp，5' UTR長134 bp，3' UTR長380 bp，編碼一個長774個氨基酸的多肽鏈，還包含一個15 bp的poly（A）尾巴。

圖1 黃鱔TfR1基因全長cDNA及推斷的氨基酸序列

二級結(jié)構(gòu)分析表明，該TfR1基因推斷的氨基酸序列沒有信號肽序列；在開放閱讀框內(nèi)可能存在著4個N-糖基化位點(diǎn)和2個O-糖基化位點(diǎn)（S107和S108）（圖1）；跨膜區(qū)（TM）位于L77和H99之間，將TfR1基因分成短的N端和長的C端。C端含有完整的TFR_dimer域、肽酶M28 結(jié)構(gòu)域、PA 結(jié)構(gòu)域和一個小的SCOP 結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖2 黃鱔TfR1基因功能結(jié)構(gòu)域

將黃鱔TfR1基因推斷的氨基酸序列與其他物種的TfR1基因用DNAMAN軟件比對（圖3）發(fā)現(xiàn)，同其他物種TfR1基因相比，黃鱔TfR1基因與紅鰭東方鲀、青鳉、虹鱒、斑馬魚的同源性較高，分別達(dá)到了68.41%、67.65%、58.90%和55.68%；而與人、豬、獰貓和狨等脊椎動物的同源性較低。基于MEGA4.0軟件的N-J法構(gòu)建的分子進(jìn)化樹（圖4）表明，黃鱔與其他魚類的TfR1聚于一個分支，同人、豬等其他脊椎動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 黃鱔TfR1基因組織特異性表分析

用RT-CR法對黃鱔的10種組織進(jìn)行TfR1基因轉(zhuǎn)錄本的檢測分析，結(jié)果（圖5）顯示，在所檢測到的10種組織里，TfR1基因表達(dá)量有明顯差異；在血細(xì)胞（Bc）中表達(dá)量最高，在腎臟（K）、脾臟（Sp）、小腸（I）中表達(dá)量中等，在皮膚（S）、胃（St）、肝臟（L）、肌肉（M）、心臟（H）和腦（B）中表達(dá)量較低。

3 討論

鐵離子對生命體至關(guān)重要，Tf-TfR復(fù)合物不僅在調(diào)控細(xì)胞鐵離子代謝吸收平衡及降低Fe3+離子轉(zhuǎn)化為Fe2+造成的細(xì)胞毒性過程中具有重要的作用，而且在機(jī)體系統(tǒng)性免疫機(jī)制激活中也具有重要作用［10］。當(dāng)病原細(xì)菌入侵細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)外由于大部分鐵離子（Fe3+）被Tf分子結(jié)合從而導(dǎo)致病原細(xì)菌因缺乏足夠游離鐵而不能生存；這些過量被Tf飽和的鐵會通過形成Tf-2Fe-TfR復(fù)合物的形式通過內(nèi)噬作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參與細(xì)胞代謝［11］。

不同物種來源的TfR1基因往往具有相類似的基因結(jié)構(gòu)和功能域［6，12］；相同物種的TfR1和TfR2基因之間在結(jié)構(gòu)和功能域之間也相對保守［6］，不同之處在于TfR2基因3' UTR區(qū)域往往缺少鐵反應(yīng)元件（IREs）表達(dá)不受鐵狀態(tài)調(diào)節(jié)［13］。這為采用同源克隆的方法克隆TfR基因提供了便利條件。本研究就是根據(jù)不同物種TfR1功能保守區(qū)設(shè)計簡并引物獲得的黃鱔TfR1片段，進(jìn)而獲得全長cDNA。人類的TfR1分子是一個同源二聚體分子，每個單體包含有1個760個氨基酸長的多肽。每個多肽由1個長671個氨基酸的胞外C端、1個61個氨基酸長的胞內(nèi)N端區(qū)域和1個28個氨基酸長的跨膜區(qū)3個部分組成。牛的TfR2和TfR1基因結(jié)構(gòu)域非常保守，唯一的區(qū)別在于TfR1基因C端含有一個小的SCOP區(qū)，類似結(jié)構(gòu)也在人的TfR1基因上被發(fā)現(xiàn)［6］。本研究發(fā)現(xiàn)黃鱔TfR1基因結(jié)構(gòu)上可分為3個主要的功能區(qū)域，C端長675個氨基酸，N端長76個氨基酸，跨膜區(qū)長22個氨基酸，在M129和E186間也存在一個長58個氨基酸的SCOP區(qū)域。另外，人的TfR1的胞外區(qū)存在3個N-糖基化位點(diǎn)和1個O-糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)是TfR執(zhí)行功能必須的位點(diǎn)［14］。本實(shí)驗(yàn)也在黃鱔TfR1分子C端發(fā)現(xiàn)了4個N-糖基化位點(diǎn)和2個O-糖基化位點(diǎn)，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于所使用分析軟件不同的算法造成的。

圖3 黃鱔TfR1基因推斷的氨基酸序列與其他物種的比較

圖4 基于N-J法構(gòu)建的分子遺傳進(jìn)化樹

圖5 黃鱔TfR1基因的組織表達(dá)分析

人類的TfR1基因在除了一些成熟的紅細(xì)胞和已終止分化的細(xì)胞外的細(xì)胞中都可表達(dá)，但表達(dá)量會有很大差異［2］。處于不斷增值的如腫瘤細(xì)胞其TfR1的基因表達(dá)量會很高，這可能是因?yàn)榧?xì)胞對鐵的需求量增加的原因［15］。人類TfR2分子的表達(dá)特征與TfR1也有不同；TfR1在肝臟中表達(dá)較低，而TfR2在肝臟中高表達(dá)，胃中低表達(dá)，其他組織TfR2表達(dá)量十分低［12］。林亞秋等［9］的研究表明草魚的TfR1基因轉(zhuǎn)錄本可在12種健康組織中檢測到，但腦和鰭中的表達(dá)量最高，肝臟等組織表達(dá)量中等，而黏液與魚鰾中的表達(dá)量最低。張立春等［6］發(fā)現(xiàn)牛的TfR2基因主要在肝臟組織中表達(dá)，其他器官如脾臟、心臟和腸道也有少量表達(dá)，這個結(jié)果與人的組織分布規(guī)律基本一致，從而在一定程度上證明了不同物種TfR基因功能的保守性。本研究發(fā)現(xiàn)，在黃鱔的10種健康組織里，血細(xì)胞的表達(dá)量最高，而肝臟、脾臟、心臟、肌肉、腎臟和小腸等組織里TfR1基因轉(zhuǎn)錄本都較低的表達(dá)；這也與人類和草魚TfR1基因表達(dá)情況類似；在血細(xì)胞里的表達(dá)量比較高的原因可能是血細(xì)胞形成需要更大量的鐵，因?yàn)檠t素細(xì)胞鐵的含量占成體鐵含量總量比重較高［2］。

4 結(jié)論

本研究通過同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到了黃鱔TfR1類分子全長cDNA序列，該基因與已知魚類TfR1基因具有較高的同源性，具有其他物種TfR1基因相類似的結(jié)構(gòu)功能區(qū)域和糖基化位點(diǎn)，是脊椎動物TfR家族中一個新成員。該基因在黃鱔不同健康組織里具有不同的表達(dá)水平，血細(xì)胞中表達(dá)量最高，而在肝臟、脾臟和小腸等組織里表達(dá)量較低。

［1］ Wally J， Buchanan SK. A structural comparison of human serum transferrin and human lactoferrin［J］. Biometals， 2007， 20：249-262.

［2］ Ponka P， Lok CN. The transferrin receptor：role in health and disease［J］. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology， 1999， 31：1111-1137.

［3］ Smilevska T， Stamatopoulos K， Samra M， et al. Transferrin receptor-1 and 2 expression in chronic lymphocytic leukemia［J］. Leukemia Research， 2006， 30：183-189.

［4］ Kawabata H， Yang R， Hirama T， et al. Molecular cloning of transferrin receptor 2. A new member of the transferrin receptorlike family［J］. Journal of Biology Chemistry， 1999， 274（30）：20826-20832.

［5］ Camaschella C， Roetto A， Cali A， et al. The gene TFR2 is mutated in a new type of haemochromatosis mapping to 7q22［J］. Nat Genet，2000， 25（1）：14-15.

［6］ 張立春， 金海國， 李趙志， 等. 延邊黃牛轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2 基因克隆與序列分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 45（10）：2022-2030.

［7］ Ricard MA， Archibald FS， Niven DF. Isolation and identification of a putative porcine transferrin receptor from Actinobacillus pleuropneumoniae biotype 1［J］. J Gen Microbiol， 1991， 137（12）：2733-2740.

［8］ Yang CG， Liu SS， Sun B， et al. Iron-metabolic function and potential antibacterial role of Hepcidin and its correlated genes（Ferroportin 1 and Transferrin Receptor）in Turbot（Scophthalmus maximus）［J］. Fish & Shellfish Immunology， 2013， 34：744-755.

［9］ 林亞秋， 鄭玉才， 吉紅， 等. 草魚轉(zhuǎn)鐵蛋白受體cDNA序列克隆及其組織表達(dá)差異［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 48（6）：1289-1292.

［10］ Brandsma ME， Jevnikar AM， Ma S. Recombinant human transferrin：Beyond iron binding and transport［J］. Biotechnology advances， 2011， 29：230-238.

［11］ Qian ZM， Li H， Sun HZ， et al. Targeted drug delivery via the transferrin receptor mediated endocytosis pathway［J］. Pharmacol Rev， 2002， 54：561-587.

［12］ 常彥忠， 段相林， 錢忠明. 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2及其功能與相關(guān)疾?。跩］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2003， 30（4）：533-536.

［13］ Hentze MW， Muckenthaler MU， Andrews NC. Balancing acts：molecular control of mammalian iron metabolism［J］. Cell， 2004，117（3）：285-297.

［14］ Williams AM， Enns CA. Mutated transferrin receptor lacking asparagine-linked glycoprotein sites shows reduced functionality and an association with binding immunoglobulin protein［J］. Journal of Biological Chemistry， 1991， 266：17648-17654.

［15］ Prutki M， Poljak-Blazi M， Jakopovic M， et al. Altered iron metabolism， transferrin receptor 1 and ferritin in patients with colon cancer［J］. Cancer Lett， 2006， 238（2）：188-196.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of a Transferrin Receptor 1 Gene from Swamp Eel，Monopterus albus

Jiang Ao1Li Wei1，2
（1. College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou 434025；2. Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland，Ministry of Education，Jingzhou 434025）

For investigating the function and tissue expression specificity of transferrin receptor 1 gene（TfR1）from swamp eel， TfR1 gene was isolated from the liver of swamp eel using homologous cloning and RACE techniques， the bioinformatics method was used to analyze the putative amino acid sequence， and semi-quantitative RT-PCR was used to study the expression of TfR1 gene in different tissues. The results showed that the full length of cDNA（GenBank accession number：KF819396）was 2 839 bp including a 134 bp 5' un-translated region（UTR）and a 380 bp 3' UTR， and it encoded a polypeptide of 774 amino acids. Sequence alignment by amino acid indicated that the inferred amino acid sequence of TfR1 from swamp eel shared high identity with those of other teleosts in 55.68%-68.41%. Semi-quantitative RT-PCR analyses demonstrated that the TfR1 transcripts were significantly varied in different tissues， the highest in blood cells， moderate in kidney， spleen and intestine， and little in liver， stomach， skin， brain， heart and muscle.

swamp eel；transferrin receptor 1（TfR1）；RACE；RT-PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.019

2014-11-12

湖北省教育廳基金項(xiàng)目（Q20131206），濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放課題（2013A011），國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目（104892014032）

江翱，男，研究方向：生物技術(shù)制藥；E-mail：1362541137@qq.com

李偉，男，博士，副教授，研究方向：魚類分子生物學(xué)；E-mail：wetli@yangtzeu.edu.cn