王龍海楊澤偉朱莉黃大昉郎志宏

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

甜高粱琥珀酸半醛脫氫酶SbSSADH基因克隆及原核表達

王龍海1，2楊澤偉1，2朱莉2黃大昉2郎志宏2

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）代謝旁路是 TCA循環(huán)的一個代謝支路，廣泛存在于動植物和微生物中，植物GABA代謝旁路與植物生物和非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)。琥珀酸半醛脫氫酶（SSADH）是GABA旁路的一個關(guān)鍵酶，對GABA途徑在生物體內(nèi)發(fā)揮功能起著至關(guān)重要的作用。通過檢索MaizeGDB和Gramene數(shù)據(jù)庫獲得甜高粱SbSSADH基因信息，利用同源克隆的方法獲得了甜高粱SbSSADH基因。序列分析結(jié)果表明，SbSSADH基因與玉米、甘蔗在核酸序列的相似度為94.77%，但前端約200 bp的信號肽部分差異較大。通過以pET-28a為表達載體構(gòu)建SbSSADH原核表達系統(tǒng)，Rosetta菌株為表達菌，表達出約50 kD的SSADH蛋白，將純化的蛋白進行酶活分析，純化蛋白具有琥珀酸半醛脫氫酶活性，并且受酶抑制劑ATP和AMP的抑制。

甜高粱；SSADH；蛋白表達；酶活測定

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）代謝旁路是TCA循環(huán)的一個重要的旁路代謝途徑，廣泛存在于動植物及微生物中；該旁路起始于α-酮戊二酸，α-酮戊二酸經(jīng)脫羧后轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔欢劝彼徇M入線粒體后在谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）作用下生成GABA；GABA經(jīng)γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（γ-aminobutyric acid transaminase，GABA-T）催化反應(yīng)生成琥珀酸半醛（Succinic semialdehyde，SSA）；而琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脫氫酶SSADH作用后生成琥珀酸，直接回到TCA循環(huán)（圖1）［1-4］。GABA途徑與哺乳動物大腦神經(jīng)系統(tǒng)功能顯著相關(guān)［5-8］，該途徑也出現(xiàn)在非神經(jīng)元細胞、植物細胞、簡單真核細胞和原核細胞中［9-11］。植物GABA途徑可以增強其對生物和非生物逆境脅迫響應(yīng)的能力［12］。

圖1 GABA代謝途徑示意圖［10］

琥珀酸半醛脫氫酶（Succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH）是GABA代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶［10，13-15］。目前對于SSADH的研究多集中于擬南芥；研究表明擬南芥SSADH基因?qū)τ谠鰪姅M南芥響應(yīng)各種生物和非生物脅迫起著主要的作用。擬南芥SSADH基因的T-DNA插入突變導(dǎo)致植株矮小、葉片壞死以及對熱和UV-B敏感并且導(dǎo)致突變體中H2O2的積累；由于突變體表皮毛細胞對光照敏感，所以突變體暴露在高光照條件下，H2O2迅速積累并導(dǎo)致細胞死亡［12，14，16-18］；最新的研究表明擬南芥的SSADH基因還與擬南芥葉片的極性發(fā)育和伸長有關(guān)［19］。因此，有研究認為擬南芥SSADH基因的功能與防御環(huán)境脅迫，阻止活性氧自由基的積累有關(guān)。在水稻中SSADH（OsALDH5）基因在幼葉、幼根、莖和穗中的表達量低，但是在干旱脅迫下上調(diào)表達［20］。

SSADH基因是乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）超基因家族中的一員，屬于第五亞家族（ALDH5），是一類NAD（P）+依賴的酶類［21-25］；而AMP和ATP是SSADH酶的競爭性抑制劑；AMP和ATP進入反應(yīng)中與SSADH結(jié)合，隨即形成復(fù)合體，替代了NAD（P）+的位置，從而阻止反應(yīng)的發(fā)生［10，14，15，26］。

甜高粱（Sorghum bicolor L. Moench）是一種耐鹽堿、耐貧瘠、耐旱的作物；作為一種常見的C4能源植物，甜高粱具有廣闊的應(yīng)用前景。甜高粱生物產(chǎn)量高，每公頃甜高粱可以獲得籽粒2 250-4 500 kg，產(chǎn)糖大約75 t［27］；抗逆性強、適應(yīng)性廣，以耐受各種惡劣的氣候和土壤環(huán)境；用途廣且產(chǎn)品多，可用于生產(chǎn)糖漿、糧食、乙醇、飼料以及造紙業(yè)，在不同區(qū)域和不同條件下可以生產(chǎn)多種產(chǎn)品，實現(xiàn)甜高粱原料的多級利用［28］。高粱本身具有許多優(yōu)良的抗逆特性，然而GABA途徑在高粱的抗逆特性中所發(fā)揮的作用還不明確；SSADH這個關(guān)鍵酶所發(fā)揮的作用未見報道。因此，本實驗通過對甜高粱SbSSADH基因克隆、原核表達并測定其酶活，初步驗證甜高粱SSADH蛋白的功能，旨在為甜高粱SbSSADH基因在甜高粱的抗逆研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物品種 甜高粱品種Keller，由本實驗室保存，水培發(fā)芽。

1.1.2 菌株與載體 pEASY-Blunt載體購自Trans Gene公司；pET-28a載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所林敏實驗室惠贈；TOP10感受態(tài)細胞購自康為世紀生物科技有限公司；Rosetta感受態(tài)細胞為本實驗室保存。

1.1.3 試劑 Trizol溶液購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher公司；高保真聚合酶KOD plus購自TOYOBO公司；dNTP和限制性內(nèi)切酶BamH I、Hind Ⅲ、Xba I購自TaKaRa公司；2×Taq Mix購自康為世紀生物科技有限公司；T4 Ligase購自Progema公司；IPTG購自北京普博欣生物科技有限公司；其余常規(guī)生化試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 引物合成和測序 由北京諾賽基因組研究中心公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第1鏈的合成 取100 mg甜高粱新鮮葉片液氮中研磨后，采用Trizol法提取總RNA［29］。按照Thermo Fisher公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；總反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)體系及過程：甜高粱總RNA 5 μL，Oligo dT Primer 1 μL、dNTP 1 μL、RNase free ddH2O 5 μL，65℃處理5 min，冰上放置2 min；再向上述體系中依次加入：5×M-MLV Buffer 4 μL、RNase inhibitor 1 μL、dNTP 2 μL、M-MLV 1 μL，42℃處理1 h，70℃處理5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 全長基因的獲得 根據(jù)從MaizeGDB和Gramene數(shù)據(jù)庫獲得的序列信息，以Primer Premier 5.0設(shè)計一對引物ssadh 1F和ssadh 1R。ssadh 1F：5'-ATGGCGATGGCGATGATGAC-3'；ssadh 1R：5'-TCAACCCAAGTTTCCCATGC-3'。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，ssadh1F和ssadh 1R引物擴增獲得目的片段；PCR擴增條件：94℃ 2 min；94℃ 15 s，55℃ 30 s，68℃ 2 min，35個循環(huán)；68℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收；連接pEASY-Blunt載體，并命名為SSADHBlunt載體并測序。

1.2.3 表達載體引物設(shè)計及SSADH序列PCR擴增 根據(jù)獲得SSADH基因序列，以信號肽預(yù)測網(wǎng)站SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Sig nalP/）預(yù)測SSADH基因信號肽，信號肽部分198 bp。用Primer Premier 5.0設(shè)計一對原核表達載體引物 PeSSADH 1F和PeSSADH 1R，該引物設(shè)計未帶信號肽。PeSSADH 1F：5'-GGATCCGACGGGAAGACCATCGAGGT-3'和 PeSSADH 1R 5'-AAGCTTTCAA CCCAAGTTTCCCATGC-3'，下劃線分別為BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點。以SSADH-Blunt質(zhì)粒為模板，用引物PeSSADH 1F、PeSSADH 1R擴增PeSSADH基因片段。PCR擴增條件：94℃ 2 min；94℃ 15 s，56℃ 30 s，68℃ 2 min，35個循環(huán)；68℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的片段。

1.2.4 原核表達載體pET-28（a）-SSADH的構(gòu)建用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切pET-28a vector和 PeSSADH PCR擴增產(chǎn)物；雙酶切產(chǎn)物經(jīng)回收后用T4連接酶16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)。取200 μL轉(zhuǎn)化菌液涂布于Kan+濃度為50 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上并37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落進行PCR檢測及酶切驗證。將驗證正確的質(zhì)粒送測序?qū)y序驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，并鑒定陽性克隆。

1.2.5 目的蛋白表達、純化 取驗證正確的菌株于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600=0.5時加入IPTG（終濃度為0.25 mmol/L）誘導(dǎo)表達8 h。50 mL體系培養(yǎng)菌液并收集表達菌株細胞，以15 mL的PBS緩沖液（含2 mmol/L的PMSF）重懸。然后超聲破碎，離心收集上清液和沉淀。通過Ni-NTA柱純化目的蛋白。用考馬斯亮藍G250測蛋白濃度，-80℃保存蛋白樣品。

1.2.6 酶活的測定 參考Hillel Fromm等的酶活測定方法，以琥珀酸半醛（SSA）和NADP為反應(yīng)底物，以100 mmol/L的焦磷酸鉀和100 mmol/L的β-巰基乙醇為反應(yīng)緩沖液。加入酶液測定其10 min內(nèi)A340nm的吸光度值的變化，并根據(jù)吸光度值的變化量計算酶活［26］。酶活計算公式：units/mL enzyme=（△A340nmTest-△A340nmBlank）×3/（6.22×0.1）及units/mg protein=（units/mL enzyme）/（mg protein/ mg enzyme）。

2 結(jié)果

圖1 PeSSADH PCR產(chǎn)物電泳檢查

2.1 甜高粱SSADH基因片段的獲得

以甜高粱葉片cDNA為模板，利用引物ssadh 1F和ssadh 1R PCR擴增目的片段，PCR產(chǎn)物大小為1.6 kb左右，符合預(yù)期設(shè)計片段大?。▓D1）。測序結(jié)果顯示，該片段大小1 584 bp，編碼527個氨基酸，同時分析發(fā)現(xiàn)，N端有66個氨基酸是線粒體信號肽序列。與其他物種SSADH基因的核酸序列比對結(jié)果（圖2）表明，與玉米的SSADH基因相似性為 90.76%-95.33%，與甘蔗的SSADH基因相似性為97.6%，但是不同物種SSADH基因前端的信號肽序列差異較大。

圖2 高粱SSADH基因cDNA序列與其他物種序列的比對結(jié)果

2.2 重組表達載體pET-28a-SSADH的構(gòu)建及鑒定

當以全長基因構(gòu)建至pET-28a時，未誘導(dǎo)出目的蛋白；后將去除信號肽的SbSSADH基因（1 386 bp）連接至原核表達載體pET-28a，構(gòu)建得到重組表達載體pET-28a-SSADH，質(zhì)粒鑒定結(jié)果（圖3）顯示，重組質(zhì)粒用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示可以得到1.4 kb片段。

圖3 重組質(zhì)粒酶切鑒定圖

2.3 SSADH蛋白的誘導(dǎo)表達

將重組質(zhì)粒pET-28a-SSADH轉(zhuǎn)化表達菌株Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達。分別選取IPTG濃度為0.25、0.5、0.75和1 mmol/L四個梯度，誘導(dǎo)時間4、8、16和24 h四個時間點，SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達，結(jié)果（圖4）顯示，在0.5 mmol/L的IPTG濃度、24℃誘導(dǎo)8 h的條件下目的蛋白表達達到峰值。

圖4 不同濃度IPTG誘導(dǎo)SSADH的表達情況

2.4 甜高粱SSADH蛋白的純化

原核表達的蛋白融合了6個組氨酸標簽His6，采用Ni-NTA柱親和層析方法純化可溶性蛋白中的目標蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測。如圖4所示，經(jīng)不同的咪唑洗脫后，在60 mmol/L和100 mmol/L可以獲得洗脫的純化蛋白，SDS-PAGE結(jié)果（圖5）顯示，純化的蛋白約在50 kD處，與理論值49.1 kD基本相符。利用考馬斯亮藍G250法測定表達的可溶性蛋白和純化蛋白的濃度，分別為9.628 mg/mL和1.972 mg/mL。

圖5 SDS-PAGE檢測SSADH蛋白的表達及純化情況

2.5 SSADH蛋白的酶活鑒定

檢測可溶性總蛋白和純化蛋白的酶活，可溶性總蛋白和純化蛋白均檢測到琥珀酸半醛脫氫酶的活性，通過計算可以看出可溶性總蛋白的酶活是0.122 U/mL，根據(jù)蛋白濃度計算，酶活為0.013 3 U/mg蛋白；純化蛋白的酶活是0.083 U/mL，與純化蛋白的濃度相除，得到酶活為0.042 U/mg蛋白，為了進一步檢測測量酶活的準確性，加入酶抑制劑AMP和ATP后琥珀酸半醛脫氫酶的酶活被完全抑制（圖6），進一步證明了純化蛋白具有琥珀酸半醛脫氫酶的活性。

3 討論

GABA途徑是TCA循環(huán)的一個重要支路，與動植物的生長發(fā)育密切相關(guān)。SSADH是其中的一個關(guān)鍵酶，催化琥珀酸半醛SSA形成琥珀酸并進入TCA循環(huán)。在動植物中，一旦缺乏SSADH會對生長發(fā)育造成很大的影響，研究表明，在小鼠中缺乏SSADH導(dǎo)致產(chǎn)生氧化應(yīng)激、線粒體病變、低谷胱甘肽水平；而人缺乏SSADH導(dǎo)致智力發(fā)育障礙、語言能力低下、癲癇、共濟失調(diào)、睡眠障礙、精神紊亂［30-37］。目前，研究植物GABA代謝途徑與植物抗逆的關(guān)系主要集中在谷氨酸脫羧酶GAD和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶GABA-T，而對于SSADH與植物抗逆的研究還處于較為基礎(chǔ)的階段。目前關(guān)于SSADH的研究較多的是擬南芥；研究表明擬南芥的SSADH基因的T-DNA插入突變體表現(xiàn)為植株矮小、葉片壞死、葉面積指數(shù)下降且對熱脅迫和UV-B敏感［10，12，15］。關(guān)于甜高粱SbSSADH基因的研究以及功能解析還未見報道。

圖6 重組SSADH蛋白酶反應(yīng)動力學(xué)

本研究從甜高粱品種Keller中克隆得到SSADH基因，序列比對分析表明甜高粱SbSSADH基因與擬南芥、甘蔗、水稻和玉米等基因序列相似度達80%-95%，而截掉信號肽的部分的相似度高達95%，僅有個別堿基的差異，說明SSADH基因在高等植物中還是比較保守的。有文獻［4］報道，真核生物蛋白在原核系統(tǒng)中表達時，由于信號肽的存在容易導(dǎo)致原核表達蛋白的失敗，所以本實驗選擇表達的蛋白是去掉信號肽。前期研究表明SSADH蛋白在線粒體中發(fā)揮功能，我們根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測SSADH蛋白的亞細胞定位信號也表明在線粒體中。我們分析了幾種植物的信號肽序列，信號肽序列表現(xiàn)出了物種特異性：在單子葉植物中，包括玉米、高粱、甘蔗等的信號肽部分（G+C）的含量達到72.8%，而雙子葉植物包括番茄、煙草信號肽部分（G+C）的含量僅有46.5%，明顯低于單子葉植物，這種特殊的高（G+C）含量的結(jié)構(gòu)是否與基因功能的發(fā)揮有一定的聯(lián)系，目前還無相關(guān)的研究報道，有待進一步的深入研究。

4 結(jié)論

本研究表達獲得的可溶性總蛋白和純化后的蛋白均表現(xiàn)出琥珀酸半醛脫氫酶的活性，并且純化后的蛋白活性有大幅度的提高，加入AMP和ATP酶抑制劑后酶活完全被抑制，這與此前關(guān)于這一酶類的報道相吻合。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Prokaryotic Expression of Sweet Sorghum Succinic Semialdehyde Dehydrogenase SbSSADH

Wang Longhai1，2Yang Zewei1，2Zhu Li2Huang Dafang2Lang Zhihong2
（1. Southwest University of Science and Technology，School of Life Science and Engineering，Mianyang 621010；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agriculture of Science，Beijing 100081）

Gamma-aminobutyric acid（GABA）shunt is a metabolism bypass of tricarboxylic acid cycle（TCA）and widely existed in animals， plants and micro-organism. The activity of the GABA shunt is drastically enhanced in response to biotic and abiotic stress. Succinic semialdehyde dehydrogenase（SSADH）， which can oxidize succinic semialdhyde into succinate， is one kind of key enzymes in the metabolic pathway of the γ-aminobutyric acid（GABA）shunt， and plays an important role in biological functioned of GABA shunt in organisms. Objective：This study aimed to construct the prokaryotic expression vector of Sweet Sorghum SSADH and express the soluble protein in E.coli. With the primers designed according to the homologous genes sequence provided by MaizeGDB and Gramene databases and mRNA from sweet sorghum as a template， SSADH gene cDNA was cloned with RT-PCR. Sequence analysis showed that SbSSADH gene have 94.77% similarity with Corn and Sugarcane SSADH gene， but the forward 200 bp signal peptide sequence of SSADH gene are different. The construct harboring the truncated SSADH gene fragment without the signal peptide sequence of SbSSADH were transformed into E. coli Rosetta cell， respectively. The expression and purification of proteins were detected with SDS-PAGE， and the enzyme activity of soluble protein SSADH was analyzed with enzymatic dynamics analysis. Results showed that we cloned the cDNA of SSADH from sweet sorghum， constructed the pET-28a-SSADH prokaryotic expression vector， and obtained the soluble protein：the result of enzymatic kinetics analysis indicated that the expressed protein has activity of Succinic semialdehyde dehydrogenase and activity have been inhibited by AMP and ATP. In this study the SSADH prokaryotic expression vector was constructed successfully and recombinant expression soluble protein of SSADH has Succinic semialdehyde dehydrogenase activity.

Sweet Sorghum；SSADH；protein expression；enzyme assay

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.013

2015-03-24

國家自然科學(xué)基金項目（31271790，31471558）

王龍海，男，碩士，研究方向：甜高粱分子遺傳育種；E-mail：kdswanglonghai@163.com

朱莉，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)；E-mail：zhuli01@caas.cn