錢志瑤 周道堂 黃秀平 周鎂 陳祖云 覃容貴

（貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550004）

黔產(chǎn)寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

錢志瑤 周道堂 黃秀平 周鎂 陳祖云 覃容貴

（貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550004）

旨在建立穩(wěn)定、可靠的寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系。以10個(gè)水平單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，應(yīng)用L16（45）正交設(shè)計(jì)對(duì)反應(yīng)體系中4個(gè)主要因子在 4個(gè)水平上進(jìn)行組合優(yōu)化，并采用直觀法、極差法和方差法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析；利用優(yōu)化的反應(yīng)體系，篩選引物以及最佳退火溫度；同時(shí)，以9份不同產(chǎn)地寬葉纈草樣品對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。結(jié)果顯示，寬葉纈草25 μL ISSR最佳反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×Taq Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.75 U Taq DNA聚合酶，60 ng DNA 模板，ddH2O補(bǔ)齊；影響大小依次是：Mg2+＞引物＞dNTPs＞Taq DNA聚合酶；確定了各引物的最佳退火溫度以及篩選出擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定的17條ISSR引物；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，該體系穩(wěn)定可靠。優(yōu)化出寬葉纈草ISSR最佳反應(yīng)體系并篩選出理想的引物。

寬葉纈草；ISSR；單因素試驗(yàn)；正交設(shè)計(jì)；體系優(yōu)化

寬 葉 纈 草（Valeriana officinalis L.var. latifolia Miq）是敗醬科（Valerianaceae）纈草屬（Valeriana Linn）植物，具有安心神、祛風(fēng)濕、行氣血、止痛的功效，主治心神不安、心悸失眠、血狂、臟躁、風(fēng)濕痹痛、脘腹脹痛、痛經(jīng)、經(jīng)閉、跌打損傷等作用［1，2］。貴州地區(qū)山多，氣候溫和，山陰多潮濕，具有得天獨(dú)厚的區(qū)域優(yōu)勢(shì)和自然條件，是纈草生長(zhǎng)最好的地理環(huán)境［3］。貴州纈草產(chǎn)業(yè)的主打產(chǎn)品就是纈草油，寬葉纈草油利用價(jià)值高，用途廣，國(guó)外已有大面積栽培寬葉纈草［4，5］。近年來(lái)，由于野生寬葉纈草供不應(yīng)求，引種栽培成為市場(chǎng)上寬葉纈草的主要來(lái)源之一，但是，貴州纈草自人工栽培以來(lái)，普遍存在品種退化、產(chǎn)油率降低的問(wèn)題。在前期的黔產(chǎn)寬葉纈草RAPD遺傳多樣性的分析研究中，發(fā)現(xiàn)貴州省不同地域栽培的寬葉纈草與野生寬葉纈草基因組DNA之間具有明顯的差異，統(tǒng)計(jì)分析也表明黔產(chǎn)寬葉纈草的變異與地域有關(guān)，地域差異和生長(zhǎng)環(huán)境的不同，可能導(dǎo)致栽培寬葉纈草的遺傳信息發(fā)生了改變，最終導(dǎo)致其基因變異。

反向簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間多態(tài)性分子標(biāo)記（Intersimple sequence repeat，ISSR）是一種在微衛(wèi)星技術(shù)基礎(chǔ)上創(chuàng)建起來(lái)的簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性DNA分子標(biāo)記［6］。ISSR分子標(biāo)記產(chǎn)物的多態(tài)性遠(yuǎn)比SSR、RFLP、RAPD豐富，可以提供更加豐富的基因組信息，且精確度高、檢測(cè)非常方便、所需DNA模板的量少、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性較高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛適用于不同物種遺傳多樣性與親緣關(guān)系的研究［7，8］。為了保證引種栽培寬葉纈草的最佳質(zhì)量，探討其不同產(chǎn)地栽培與野生寬葉纈草遺傳相似性，為寬葉纈草資源開發(fā)和人工種植提供有參考價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本研究就ISSR分子標(biāo)記的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化與分析，旨在找到最佳適用于黔產(chǎn)寬葉纈草的ISSR反應(yīng)體系，為分析黔產(chǎn)寬葉纈草種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用寬葉纈草由貴州省江口苗藥生物科技有限公司提供，經(jīng)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院覃容貴教授鑒定為敗醬科纈草屬植物寬葉纈草。

DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker DL2000，北京天根生化科技有限公司提供；Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、GoldViewⅠ核酸染色劑、50×TAE緩沖液等，北京索萊寶公司提供；ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的引物序列，上海生工合成。

DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；BIOMATE 3S核酸蛋白分析儀，美國(guó)thermo Fisher Scientific；S1000PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)BIO-RAD；凝膠成像儀，香港Gene Company Limited。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測(cè) 以寬葉纈草嫩葉為材料，采用試劑盒法提取基因組DNA；核酸蛋白分析儀檢測(cè)純度及濃度；0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)完整性；提取原液-20℃保存，用于PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)［9，10］，確定寬葉纈草初始ISSR反應(yīng)體系：總體積25 μL，包含2.5 μL 10×Taq Buffer，1.5 mmol/L Mg2+，0.24 mmol/L dNTPs，0.5 μmol/L引物，1.25U Taq DNA聚合酶，60 ng DNA 模板，ddH2O補(bǔ)齊；單因素試驗(yàn)時(shí)，采用變化單一因素，其他因素不變的方法，以確定該因素對(duì)ISSR結(jié)果的影響［11］，每個(gè)因素設(shè)置10個(gè)梯度濃度水平，見表1。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；然后按94℃變性30 s，55.6℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；4℃保存。選擇預(yù)試驗(yàn)中擴(kuò)增效果較好的引物UBC807，對(duì)寬葉纈草基因組 DNA 進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠上，100 V恒壓電泳1 h，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

表1 ISSR單因素試驗(yàn)條件設(shè)計(jì)

1.2.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶為正交試驗(yàn)因子，并選擇各因素有效的擴(kuò)增范圍，采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以直觀法、極差法及方差法相結(jié)合的統(tǒng)計(jì)分析方式（表2）考察各因素間的相互作用對(duì)反應(yīng)體系的影響，確定寬葉纈草最佳ISSR反應(yīng)體系。反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序沿用單因素試驗(yàn)所用條件。

表2 ISSR正交試驗(yàn)水平

表3 ISSR正交試驗(yàn)計(jì)劃表

1.2.4 退火溫度及引物的篩選 以最佳ISSR反應(yīng)體系，引物Tm±5℃的梯度擴(kuò)增模式［12］，自動(dòng)生成以引物Tm值為中心的10個(gè)梯度退火溫度，從中確定最佳退火溫度。在對(duì)引物退火溫度篩選的同時(shí)，從50條候選ISSR引物中篩選出穩(wěn)定的、多態(tài)性好的寬葉纈草ISSR引物。

1.2.5 反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測(cè) 以最佳ISSR反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，采用UBC807引物對(duì)9份不同地區(qū)的寬葉纈草樣品進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA的質(zhì)量檢測(cè)

核酸蛋白分析儀檢測(cè)所提寬葉纈草基因組DNA，OD260/280比值在1.70-1.90之間，純度較好，濃度在50.00-85.00 μg/mL之間；瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，DNA的主帶清晰明亮，無(wú)降解現(xiàn)象，點(diǎn)樣孔無(wú)雜質(zhì)，即基因組DNA的完整性較好。結(jié)果說(shuō)明所提樣本DNA可用于ISSR體系的構(gòu)建及后續(xù)的試驗(yàn)。

圖1 DNA檢測(cè)電泳圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 DNA模板濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響 模板DNA的濃度設(shè)置在10-100 ng/25 μL，共10個(gè)梯度，從圖2可觀察，所擴(kuò)增出的條帶在清晰度與條帶數(shù)上達(dá)到一致，并無(wú)明顯的變化，即模板DNA的濃度在10-100 ng/25 μL之間時(shí)，對(duì)寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系無(wú)明顯影響，故DNA模版濃度的大小在正交試驗(yàn)中不予作為考察對(duì)象。

圖2 DNA濃度對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

2.2.2 Mg2+濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響 由圖3可知，在Mg2+濃度小于1.75 mmol/L時(shí)，所擴(kuò)增的條帶數(shù)較少；Mg2+濃度在1.75-2.5 mmol/L時(shí)，大部分?jǐn)U增條帶穩(wěn)定、清晰、明亮；在Mg2+濃度大于2.75 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶變少，且不穩(wěn)定，不清晰。Mg2+作為ISSR反應(yīng)中的一個(gè)主要因素，不僅會(huì)影響Taq DNA聚合酶的活性，還能與反應(yīng)體系中的dNTPs、模板DNA及引物結(jié)合，影響引物與模板的結(jié)合率，同時(shí)Mg2+濃度太高或太低都可能導(dǎo)致擴(kuò)增不完全或無(wú)擴(kuò)增。由結(jié)果可知，寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系中Mg2+的濃度在1.75-2.5 mmol/L時(shí)為最佳擴(kuò)增濃度范圍。

圖3 Mg2+濃度對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

2.2.3 dNTPs濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響 對(duì)dNTPs的10個(gè)不同濃度分別進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，如圖4所示，dNTPs在低濃度為0.12、0.16 mmol/L時(shí)，PCR的產(chǎn)率低，條帶亮度不足；而dNTPs的濃度在0.20-0.28 mmol/L時(shí)，條帶明亮，清晰且穩(wěn)定；當(dāng)dNTPs的濃度較高為0.32-0.48 mmol/L時(shí)，未得到有效擴(kuò)增，條帶少，甚至無(wú)條帶。dNTPs是ISSR擴(kuò)增的原料，其濃度直接影響擴(kuò)增產(chǎn)物的生成，dNTPs濃度不足時(shí)，DNA合成速率低，dNTPs過(guò)早耗盡而使產(chǎn)物單鏈化，擴(kuò)增效果差；dNTPs濃度過(guò)高時(shí)，容易與Mg2+結(jié)合而降低游離Mg2+濃度，從而影響Taq DNA聚合酶的活性。dNTPs的濃度過(guò)低或過(guò)高都不能得到有效的擴(kuò)增。因此，dNTPs的濃度在0.20-0.28 mmol/L為寬葉纈草ISSR反應(yīng)的有效擴(kuò)增濃度。

圖4 dNTP濃度對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

2.2.4 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響 對(duì)ISSR的Taq DNA聚合酶濃度這一單因子進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果（圖5）顯示，當(dāng)Taq DNA聚合酶的濃度在0.5 U/25 μL時(shí)，擴(kuò)增出的條帶弱且少；當(dāng)濃度為0.75-1.750 U時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)增加，條帶清晰；Taq DNA聚合酶的濃度繼續(xù)增大時(shí)，擴(kuò)增條帶變得模糊，不易區(qū)分。Taq DNA聚合酶是ISSR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，用量過(guò)多時(shí)會(huì)引起非特異性擴(kuò)增，有時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)比較重的背景，影響擴(kuò)增結(jié)果，用量過(guò)少導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物減少；同時(shí)，它還受Mg2+濃度及dNTPs濃度大小的綜合影響。故本試驗(yàn)將0.75-1.750 U/25 μL Taq DNA聚合酶濃度定為寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系的有效擴(kuò)增濃度。

圖5 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

2.2.5 引物濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響 由圖6可知，當(dāng)引物濃度為0.20-0.40 μmol/L間時(shí)，為有效擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶多且清晰，反之，當(dāng)引物濃度過(guò)高時(shí)，擴(kuò)增條帶不穩(wěn)定，條帶變模糊。實(shí)驗(yàn)在確保PCR產(chǎn)率的前提下，確定較低引物濃度0.20-0.40 μmol/L為有效擴(kuò)增引物濃度，其結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 正交直觀分析 根據(jù)5因素4水平正交設(shè)計(jì)，共有16個(gè)試驗(yàn)組合，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3，16個(gè)組合間存在明顯差異，14號(hào)組合效果最差，沒(méi)有擴(kuò)增出條帶；6號(hào)、9號(hào)和15號(hào)組合擴(kuò)增出少量條帶，但部分條帶帶型不完整，不易識(shí)別，清晰度差；2號(hào)，3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、13號(hào)以及16號(hào)組合擴(kuò)增條帶數(shù)相對(duì)多，但條帶清晰度不高，其中2號(hào)、7號(hào)和13號(hào)組合的背景彌散嚴(yán)重；1號(hào)、8號(hào)和12號(hào)組合擴(kuò)增效果相近，擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，清晰，宜于區(qū)分，但又以8號(hào)組合效果最好，條帶較其余組合明亮。綜合以上分析，確定選用8號(hào)為最佳組合，即25 μL總體積，包含2.5 μL 10×Taq Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，1.75 U Taq DNA聚合酶，0.3 μmol/L引物，60 ng DNA 模板，ddH2O補(bǔ)齊。

圖6 引物濃度對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

圖7 正交試驗(yàn)PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3.2 正交極差分析 在對(duì)L16（45）正交試驗(yàn)的16個(gè)組合進(jìn)行直觀觀察時(shí)，并根據(jù)擴(kuò)增條帶的多少及強(qiáng)弱、清晰度及背景強(qiáng)度4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)分，每項(xiàng)4分共計(jì)16分。對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，極差用R值表示，R值越大，反應(yīng)因素對(duì)體系的影響就越大。根據(jù)表3的R值判斷4個(gè)因素對(duì)黔產(chǎn)寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系的影響大小順序?yàn)椋篗g2+＞引物＞dNTPs＞Taq DNA聚合酶；最佳因素水平組合為：Mg2+k2（2.0 mmol/L）、dNTPs k4（0.28 mmol/L）、Taq DNA聚合酶k2（1.25 U）、引物k2（0.3 μmol/L）。

2.3.3 正交方差分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0進(jìn)行方差分析，表4所示，由F值大小可知影響寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系的大小次序?yàn)椋篗g2+＞引物＞dNTPs＞Taq DNA聚合酶，與極差分析的結(jié)果相一致，其中Taq DNA聚合酶的濃度大小對(duì)反應(yīng)體系的影響最小。在α=0.05水平各因素水平間的差異對(duì)擴(kuò)增結(jié)果沒(méi)有達(dá)到顯著水平。

表4 寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系各因素方差分析

綜合直觀分析、極差分析與方差分析的結(jié)果，確定寬葉纈草ISSR最佳反應(yīng)體系組合為正交試驗(yàn)8號(hào)：2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.75 U Taq DNA聚合酶。

2.4 退火溫度及引物的篩選

50個(gè)候選ISSR引物以10個(gè)梯度Tm±5℃退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果（表5）表明，不同退火溫度的擴(kuò)增帶型間具有差異，選擇重復(fù)性好、擴(kuò)增條帶清晰的退火溫度為最佳退火溫度。

2.5 ISSR體系穩(wěn)定性檢測(cè)

通過(guò)對(duì)9份不同產(chǎn)地寬葉纈草樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖8）顯示，9份樣品均得到有效擴(kuò)增，擴(kuò)增所得條帶清晰，即所建立的黔產(chǎn)寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系穩(wěn)定。

3 討論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立在PCR的基礎(chǔ)上，受模板DNA、Taq DNA 聚合酶、引物、Mg2+和dNTPs5個(gè)因素的影響［13，14］。任偉等［11］通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了朝鮮堿茅的最佳ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系，但I(xiàn)SSR反應(yīng)體系是一個(gè)因素間相互效應(yīng)的組合，僅通過(guò)單因素試驗(yàn)直觀確定最佳反應(yīng)體系，具有一定的不穩(wěn)定性。包蕊等［15］、歐立軍等［16］、代文娟等［17］利用正交設(shè)計(jì)分別確定了華扁穗草、天門冬及廣西火桐的ISSR最佳反應(yīng)體系，正交設(shè)計(jì)可以使各因素快速的組合，確定最佳反應(yīng)體系，但在因素水平的選取上存在一定的不確定性。本研究采用單因素試驗(yàn)，首先確定各個(gè)因素的有效擴(kuò)增濃度范圍，再通過(guò)正交試驗(yàn)確定因素最佳水平組合，這種單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，不僅可以克服正交試驗(yàn)因素水平的難以確定問(wèn)題，還可以避免單因素試驗(yàn)顧此失彼的缺點(diǎn)，明確、均衡、綜合性的確定各個(gè)試驗(yàn)因素，以最有效的方式在最短的時(shí)間內(nèi)找到最優(yōu)的試驗(yàn)水平組合。目前，兩面針［14］、鎖陽(yáng)［18］、陽(yáng)春砂［19］等多種藥用植物利用單因素與正交設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法，優(yōu)化得到準(zhǔn)確穩(wěn)定的ISSR反應(yīng)體系。

表5 備選的ISSR引物

圖8 9份不同產(chǎn)地寬葉纈草樣品擴(kuò)增結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)中，盡管正交設(shè)計(jì)的各因素的水平都是基于單因素的有效擴(kuò)增濃度范圍內(nèi)，但不同的組合對(duì)寬葉纈草的ISSR擴(kuò)增結(jié)果影響也是比較大的，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增譜圖的直觀分析以及統(tǒng)計(jì)學(xué)的極差分析與方差分析，使分析結(jié)果相對(duì)以往的PCR反應(yīng)體系優(yōu)化更科學(xué)、完善。極差分析中所確立的最佳ISSR反應(yīng)體系組合，與直觀分析中所確立的最佳水平組合僅Taq DNA聚合酶的濃度不一致，但極差分析與方差分析的結(jié)果顯示，Taq DNA聚合酶濃度并不是反應(yīng)體系的主要影響因素。方差分析結(jié)果顯示，各個(gè)影響因素的P值都大于0.05，說(shuō)明各影響因素在水平范圍內(nèi)對(duì)反應(yīng)體系都存在不顯著影響，這可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)單因素試驗(yàn)確立了各因素有效擴(kuò)增的濃度范圍的原因。

ISSR分子標(biāo)記適用于物種的遺傳多樣性分析，但不同的物種其ISSR體系也有一定的差異。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，模板DNA濃度大小對(duì)黔產(chǎn)寬葉纈草ISSR的擴(kuò)增影響不明顯，DNA的濃度對(duì)擴(kuò)增的效果不顯著，這與吳鳴謙［20］建立的擬莖點(diǎn)霉最佳ISSR反應(yīng)體系的結(jié)論相似。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，黔產(chǎn)寬葉纈草ISSR擴(kuò)增的因素影響大小依次是：Mg2+＞引物＞dNTPs＞Taq DNA聚合酶，而在節(jié)瓜［9］的ISSR體系研究中，認(rèn)為因素dNTPs是影響最大的因子；而薰衣草［21］的ISSR優(yōu)化體系的相對(duì)影響程度從大到小依次為：Mg2+、dNTPs、引物和 DNA 濃度。基于研究結(jié)果，表明優(yōu)化黔產(chǎn)寬葉纈草的ISSR反應(yīng)體系是十分必要的，不僅建立了專屬于黔產(chǎn)寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系，同時(shí)也為同種、其他來(lái)源的寬葉纈草的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在進(jìn)行某物種的ISSR分子標(biāo)記研究時(shí)，一個(gè)穩(wěn)定、有效的擴(kuò)增體系是基礎(chǔ)，而適合該物種的ISSR引物就是研究的前提［16，22］。在篩選引物的工作中，退火溫度能明顯地影響擴(kuò)增條帶的特異性［23］，甚至是條帶的有無(wú)，不同引物有著各自的退火溫度，因此，對(duì)不同引物退火溫度的優(yōu)化篩選是一項(xiàng)非常必要的工作，也是引物篩選的必要前提。本研究以優(yōu)化的最佳ISSR反應(yīng)體系對(duì)50條候選引物的退火溫度進(jìn)行一一篩選，以確保每一條引物擴(kuò)增條帶穩(wěn)定，重現(xiàn)性好并且清晰，同時(shí)通過(guò)ISSR體系的驗(yàn)證試驗(yàn)，為應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行黔產(chǎn)寬葉纈草的遺傳多樣性研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)中，確立了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶這5個(gè)主要影響黔產(chǎn)寬葉纈草ISSR擴(kuò)增的有效濃度范圍，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得到適合寬葉纈草的ISSR反應(yīng)體系：總體積25 μL，包含2.5 μL 10×Taq Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.75 U Taq DNA聚合酶，60 ng DNA 模板，ddH2O補(bǔ)齊。所建立的ISSR反應(yīng)體系適用于黔產(chǎn)寬葉纈草的ISSR擴(kuò)增。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Establishment and Optimization of ISSR Reaction System for Valeriana officinalis L. var. latifolia Miq of Guizhou Province

Qian Zhiyao Zhou Daotang Huang Xiuping Zhou Mei Chen Zuyun Qin Ronggui
（School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550025）

This study is to establish a stable and reliable ISSR system for Valeriana officinalis L.var. latifolia Miq. Based on the single factor experiment in 10 levels， L16（45）orthogonal design was applied to conduct combinatorial optimization in 4 levels of 4 major factors，and the results were analyzed by visual method， range analysis and variance method. The primer and the optimal annealing temperature were screened by optimized reaction system. The stability and reliability of this system were tested by 9 samples from different origins. The optimal ISSR conditions in the experiments were as following： in 25 μL reaction system containing 2.5 μL 10×Taq Buffer， 2.0 mmol/L Mg2+， 0.28 mmol/ L dNTPs， 0.3 μmol/L primer， 1.75 U Taq DNA polymerase， 60 ng DNA template， and ddH2O completed. The order of the effect by the factors was in Mg2+＞ primer ＞ dNTP s ＞ Taq DNA polymerase. The optimal annealing temperature for each primer was determined， and 17 primers with distinct and stable amplified bands were screened. Stability test showed that the optimized system was stable and reliable. By this study we may reach the conclusion that the optimal ISSR reaction system for V. officinalis var. latifolia was generated， and the desired primers also were screened， which may provide the technical foundation for the application of ISSR molecular marker technology in the study of genetic diversity of V. officinalis var. latifolia.

Valeriana officinalis L. var. latifolia Miq；ISSR；single factor experiment；orthogonal design；optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.011

2015-02-03

貴州省中藥攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合ZY［2011］3008號(hào)），貴州省高層次人才特助經(jīng)費(fèi)（TZJF-2010-053號(hào)）

錢志瑤，女，碩士研究生，研究方向：中藥資源及質(zhì)量評(píng)價(jià)；E-mail：15285135995@163.com

覃容貴，女，博士，教授，研究方向：中藥資源及質(zhì)量評(píng)價(jià)；E-mail：1346812934@qq.com