阮征王蓮芳胡修忠吳建英張四化代長(zhǎng)云華娟夏瑜胡小明李杰黃海軍，4

（1.武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，武漢 430208；2. 武漢市重大動(dòng)物疫病防控中心，武漢 430023；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳育種農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；4.武漢市畜牧獸醫(yī)局，武漢 430023）

新生豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性分析

阮征1，2王蓮芳1胡修忠1吳建英2張四化2代長(zhǎng)云2華娟1夏瑜1胡小明3李杰1黃海軍1，4

（1.武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，武漢 430208；2. 武漢市重大動(dòng)物疫病防控中心，武漢 430023；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳育種農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；4.武漢市畜牧獸醫(yī)局，武漢 430023）

利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）治療疾病已經(jīng)逐漸成為現(xiàn)實(shí)，但是作為被移植的種子細(xì)胞，BMSCs體外傳代能力非常有限，種子細(xì)胞來(lái)源極為貧乏。本研究通過(guò)差速貼壁篩選的方法分離出一種豬BMSCs的衍生細(xì)胞株，命名為豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生細(xì)胞（Bone mesenchymal stem-derived cells，BMSDCs）。分別對(duì)BMSDCs與BMSCs細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性分析，探討其體外誘導(dǎo)分化特性，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)記物。結(jié)果表明，BMSC和BMSDCs細(xì)胞倍增時(shí)間分別為31.3 h和30.3 h，平均傳代時(shí)間分別為3-5 d和 2-3 d；兩種細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá) CD34、CD90，陰性表達(dá)CD44、CD45；經(jīng)體外誘導(dǎo)后均可分化為成脂細(xì)胞和成肌細(xì)胞。在傳代能力上，前者可傳代15至20次，后者可長(zhǎng)期傳代（200次以上）且維持正常染色體特征。研究認(rèn)為在適宜的實(shí)驗(yàn)條件下，體外培養(yǎng)的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衍生細(xì)胞——BMSDCs能夠穩(wěn)定生存增殖并維持BMSCs多向分化潛能，可作為組織工程的理想種子細(xì)胞。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；衍生細(xì)胞；豬；生物學(xué)特性；組織工程

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種存在于骨髓網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi)的非造血干細(xì)胞，具有分化成各種間葉組織的功能。近年來(lái)研究表明，豬BMSCs體外分離培養(yǎng)后，在一定的誘導(dǎo)條件下具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等定向分化的能力［1-3］，且取材方便，免疫耐受性、遺傳背景穩(wěn)定及易于轉(zhuǎn)染外源基因等。因此，豬BMSCs成為目前倍受關(guān)注的細(xì)胞及組織工程的干細(xì)胞材料［4-6］。將豬BMSCs誘導(dǎo)成上述目的細(xì)胞后，用于臨床骨損傷、肌肉損傷和基因治療以及在防治肥胖癥領(lǐng)域是一個(gè)非常有臨床應(yīng)用前景的研究課題。體外成功分離豬BMSCs及誘導(dǎo)成功是其應(yīng)用的前提。但是，文獻(xiàn)［1-3］表明，豬BMSCs在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)傳代次數(shù)非常有限，不利于其廣泛應(yīng)用于臨床治療疾病。本研究分離了豬BMSCs并進(jìn)行了體外向成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及成肌細(xì)胞的定向分化研究。此外，利用差速貼壁法從第3代豬BMSCs衍生細(xì)胞群中分離出一種亞型細(xì)胞，并建立了可穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)分析證實(shí)其仍然具備標(biāo)準(zhǔn)BMSCs干細(xì)胞特性，可為后續(xù)研究及細(xì)胞移植治療提供充足的細(xì)胞材料。

1 材料及方法

1.1 材料

低糖 DMEM 培養(yǎng)基（GIBICO 公司）、10% 胎牛血清（GIBICO 公司）、0.125% 胰蛋白酶（Sigma 公司）、Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液（上海士鋒生物科技有限公司，比重 1.077 g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105 單克隆抗體和 FITC 標(biāo)記的二抗（Lab vision）、MTT（上海譜振生物科技有限公司）、熒光倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（SanYo公司）、流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BECTON DICKINSON 公司，美國(guó)）及超凈工作臺(tái)等、PCR儀（ABI公司）。

普通級(jí)新生長(zhǎng)白仔豬（10頭，體質(zhì)量1.5 kg-5 kg）由武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所試驗(yàn)豬場(chǎng)提供。

1.2 方法

1.2.1 豬BMSCs 的分離純化與傳代培養(yǎng) 將豬體表清洗干凈并用酒精棉充分消毒，放血致死，置于75%酒精中浸泡10 min，分離四肢皮膚及肌肉組織。無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨，切除兩側(cè)干骺端，用滅菌鋼鋸將其鋸成兩段，再用鋼鉗鉗破骨腔，擠壓鋼鉗使骨髓液流出，收集骨髓液于無(wú)菌離心管。吸取骨髓液緩慢滴加于等量 Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液（密度 1.077 g/mL）上，以 1 000 g 的速度離心 20 min，分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，收集界面上的細(xì)胞，移入另一離心管，PBS 洗滌，2 000 r/min 離心 5 min，反復(fù)2 次，棄上清，懸浮于含 15% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基（青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 U/mL），輕輕吹打均勻，接種到 25 cm2培養(yǎng)瓶，置 37℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6 d 首次換液，以后每3 d 或 4 d 換液 1 次，14-21 d 細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá) 80%以上，以 0.25% 胰蛋白酶消化，按 1∶3 比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 BMSCs衍生細(xì)胞的分離與培養(yǎng) BMSCs生長(zhǎng)融合達(dá) 80% 以上，以 0.25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞，利用差速貼壁法從中分離出一種短梭形的亞型細(xì)胞，命名為豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生細(xì)胞（Bone mesenchymal stem-derived cells，BMSDCs）。

1.2.3 BMSCs和BMSDCs細(xì)胞倍增時(shí)間的確定 取第3代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化后用含 10% FBS 的 DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以每孔 103-104個(gè)細(xì)胞于不同時(shí)相分別接種于 8 塊 96 孔板中的 8 孔，每孔體積 200 μL，置于 37℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。于第 2 天起行 MTT 比色法，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃ 繼續(xù)孵育 4 h 后，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后選擇 490 nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，以時(shí)間為橫軸，光吸收值 A（OD）為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。根據(jù)計(jì)算公式：DT = t ×［lg2/（lgNtlgN0）］確定BMSCs和BMSDCs細(xì)胞的倍增時(shí)間。

1.2.4 BMSCs和BMSDCs細(xì)胞的鑒定

1.2.4.1 化學(xué)染色 堿性磷酸酶（ALP）染色：細(xì)胞接種于蓋玻片上培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿后，細(xì)胞爬片用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定細(xì)胞，進(jìn)行ALP染色，即先用PBS洗細(xì)胞3遍，加入ALP染液，室溫孵育20-30 min，鏡下觀察，檢測(cè)成骨細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞呈紫紅色，每張載玻片隨機(jī)選擇3個(gè)視野計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性率。

PAS染色：細(xì)胞接種于蓋玻片上培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿后，細(xì)胞爬片用0.5%高碘酸水溶液氧化10 min。流水沖洗數(shù)分鐘蒸餾水換洗兩次。雪夫試劑暗處浸染15-30 min。流水沖洗10 min。蘇木素復(fù)染核1-2 min。95%乙醇、無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

瑞氏-姬姆薩染色：吸取瑞氏-姬姆薩染液滴至玻片蓋滿標(biāo)本，靜置30 s，再加入PBS 2-3倍體積，染色1-3 min，傾去染液，水洗，封片。

1.2.4.2 PCR鑒定 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的豬BMSCs和BMSDCs細(xì)胞，參考文獻(xiàn)［7］的方法，分別提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為50 μL體系，其中包括ddH2O 10 μL，dNTPs 8 μL（濃度為10 mmol/L），2×Buffer 25 μL，cDNA模板4 μL，上下游引物分別添加1 μL KOD DNA聚合酶1 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，退火30 s，68℃延伸1 kb/30 s，35個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)的引物和條件見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，加0.5 μL上樣緩沖液（10×Loading Buffer），混勻后小心點(diǎn)樣于0.7%的瓊脂糖凝膠膠孔中，同時(shí)點(diǎn)5 μL DL1k Marker作為參照，在150 V電壓條件下，電泳40 min。電泳結(jié)束后，在加有EB的緩沖液中染色15 min，取出用干凈的水洗去表面的EB，然后利用G-BOX凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

表1 PCR引物

1.2.4.3 細(xì)胞免疫化學(xué) 于超凈工作臺(tái)內(nèi)，打開(kāi)6孔板，放置滅菌蓋玻片。將細(xì)胞懸液滴加至蓋玻片上，置于CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)至細(xì)胞固著（約2 h）。加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)約6 h。倒去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次5 min。爬片稍甩干后用組化筆在蓋玻片中間細(xì)胞分布均勻的位置畫(huà)圈（防止抗體流走），加50-100 μL破膜工作液，室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。去除PBS，用PBS按一定比例稀釋好的一抗（CD34，rabbit，1∶50；CD44，mouse，1∶100；CD90， mouse，1∶100）覆蓋組織。爬片平放于冰箱內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。爬片用PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的熒光二抗（cy3標(biāo)記山羊抗兔1∶100；cy3標(biāo)記山羊抗小鼠1∶100）覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。用PBS（pH 7.4）洗滌3次，每次5 min。爬片稍甩干后將有細(xì)胞的一面朝下用抗熒光淬滅封片劑將玻片封固在載玻片上封片。切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)記 取第3代BMSCs，用 0.25% 胰蛋白酶消化，2 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌 2 次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 1×106/mL，分為 4 份，分別滴加人抗兔 CD34、CD44、CD45、CD90的一抗（以 PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照），室溫反應(yīng) 30 min 后，PBS 洗滌 2 次，滴加CY3標(biāo)記的抗兔 IgG，避光反應(yīng) 15 min 后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面 CD34、CD44、CD90 陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。1.2.4.5 體外誘導(dǎo)分化 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的豬BMSCs和BMSDCs細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，制成單細(xì)胞懸液，以1×10 mL 密度接種于5個(gè)培養(yǎng)皿中，每皿預(yù)置3張載玻片，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%匯合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)。成肌誘導(dǎo)：10%FBS+10 μmol/L 5-氮胞苷誘導(dǎo)21 d。成脂誘導(dǎo)：10%FBS+1 μmol/L 地塞米松+0.5 mmol/L IBMX+10 μg/mL胰島素+200 μmol/L吲哚美辛（2 d），10%FBS+1 μmol/L 地塞米松+0.5 mmol/L IBMX+10 μg/mL胰島素（2 d），10%FBS+10 μg/mL胰島素（2 d），10%FBS培養(yǎng)基。肉眼可見(jiàn)明顯脂滴，用油紅O進(jìn)行染色［7］。

2 結(jié)果

2.1 豬原代BMSCs的形態(tài)及培養(yǎng)特征

原代培養(yǎng)中，可見(jiàn)細(xì)胞以分散、克隆集落方式增殖（圖1-A1）；第 1-3 天細(xì)胞大部分呈圓形、橢圓形生長(zhǎng)；第 3-7 天貼壁細(xì)胞增多，并逐漸延展生長(zhǎng)為多角形、星形或梭形；7-21 d 貼壁細(xì)胞明顯增多，并有集落形成，相鄰集落融合成片達(dá) 80% 以上，細(xì)胞排列呈漩渦狀，細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形；14-21 d 后，原代細(xì)胞生長(zhǎng)匯合。

2.2 豬BMSCs的傳代培養(yǎng)及細(xì)胞生物學(xué)特性

傳代后豬BMSCs 2-4 h迅速貼壁，8 h大部分貼壁，10 h細(xì)胞全部貼壁，并開(kāi)始分裂增殖。細(xì)胞呈均勻分布，形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)梭形，并沿一定方向排列（圖1-A2）。細(xì)胞倍增時(shí)間為31.3 h，2-5 d細(xì)胞鋪滿瓶底，即可消化傳代。開(kāi)始時(shí)大多為細(xì)長(zhǎng)梭形，增殖速度快，細(xì)胞傳代周期縮短，待傳至第7-8代時(shí)，細(xì)胞鋪展得寬大而扁薄，增殖速度減慢，細(xì)胞傳代周期延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)增多。

PCR檢 測(cè) 表 明，BMSCs表 達(dá)Sox2、Nanog、CD90和CD29基因，Pou5f基因表達(dá)較弱，不表達(dá)Lin28（圖1-D）。細(xì)胞ALP、PAS和Gimsa染色陽(yáng)性（圖1-B）。細(xì)胞免疫熒光化學(xué)分析，BMSC細(xì)胞表達(dá)CD44和CD90，不表達(dá)CD34、CD45（圖1-C）。流式檢測(cè)，CD44和CD90的表達(dá)比例分別達(dá)到89.77%和89.53%，CD34、CD45的表達(dá)分別為0.9%和1.3%（圖1-E）。體外適當(dāng)誘導(dǎo)可分化為成肌細(xì)胞和脂滴（圖1-F）。

2.3 豬BMSDCs細(xì)胞系的建立及細(xì)胞生物學(xué)特性

在我們分離的豬BMSCs的培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)了兩種主要形態(tài)的細(xì)胞（圖2-A1）。利用差速貼壁法我們純化了短梭狀生長(zhǎng)的細(xì)胞，命名為豬BMSDCs細(xì)胞（圖2-A2）。細(xì)胞倍增時(shí)間為30.3 h，2-3 d細(xì)胞鋪滿瓶底，即可消化傳代。

PCR檢測(cè)結(jié)果表明，BMSDCs細(xì)胞表達(dá)Sox2、Pou5f、CD90和CD29基因，Nanog基因表達(dá)較弱，不表達(dá)Lin28（圖2-D）。細(xì)胞ALP、PAS和Gimsa染色陽(yáng)性（圖2-C）。細(xì)胞免疫熒光化學(xué)分析，BMSDCs細(xì)胞表達(dá)CD44和CD90，不表達(dá)CD34、CD45（圖2-B）。流式檢測(cè)，CD44和CD90的表達(dá)比例分別達(dá)到88.92%和81.47%，CD34、CD45的表達(dá)分別為1.9%和1.1%（圖2-E）。體外適當(dāng)誘導(dǎo)可分化為成肌細(xì)胞和脂滴（圖2-F）。

3 討論

BMSCs 體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)特點(diǎn)和生物學(xué)特性已有較多相關(guān)文獻(xiàn) 報(bào)道。BMSCs 在骨髓中的含量極少，約占有核細(xì)胞的 0.001%-0.01%［8］，如何獲得高純度、足量的 BMSCs，成為 BMSCs 應(yīng)用研究的關(guān)鍵。目前常用于BMSCs 分離方法有貼壁篩選法［9］、密度梯度離心法［10，11］、免疫磁珠法［12］、流式細(xì)胞儀分離法［13］及 Hung等［14］研究的特制微孔培養(yǎng)板篩選法。特制微孔培養(yǎng)板篩選法，可以快速有效獲取相對(duì)同質(zhì)的BMSCs，利用這種方法可以不用考慮去除紅細(xì)胞，但是結(jié)果不穩(wěn)定，目的細(xì)胞不易大量獲取［15］。免疫磁珠分離和流式細(xì)胞術(shù)篩選的方法，優(yōu)點(diǎn)是可以獲得純度較高的細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞活性影響較大，而且操作復(fù)雜，成本較高，獲得的細(xì)胞數(shù)目又非常少［16］。密度梯度離心法主要是根據(jù)骨髓中各細(xì)胞成分比重的不同，利用淋巴細(xì)胞分離液提取單核細(xì)胞，操作上較貼壁篩選法煩瑣，得到的細(xì)胞數(shù)也比后者少，但此方法可排除大量紅細(xì)胞對(duì)BMSCs貼壁的影響，因而被廣泛采用［17］。在本研究中，我們也采用過(guò)全骨髓法成功分離出目的細(xì)胞。全骨髓法操作簡(jiǎn)便，將獲得的骨髓直接培養(yǎng)，骨髓中的造血干細(xì)胞能分泌生長(zhǎng)因子和促貼壁物質(zhì)，可促進(jìn)BMSCs貼壁生長(zhǎng)，同時(shí)根據(jù)BMSCs的貼壁生長(zhǎng)特性，通過(guò)更換培養(yǎng)液逐步去除漂浮生長(zhǎng)的造血干細(xì)胞，獲得純度較高的BMSCs。

圖1 豬BMSCs細(xì)胞生物學(xué)特性

BMSCs 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，然而 BMSCs 表面標(biāo)志物由于細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)時(shí)間等的不同而有差異。Pittenger 等［18］認(rèn)為人BMSCs 陽(yáng)性表面標(biāo)志物是 SH2（CD105）、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124，陰性表面標(biāo)志物是 CD45、CD34 和 CD14等造血細(xì)胞標(biāo)志。Hung 等［14］采用帶孔培養(yǎng)板的裝置培養(yǎng)分離得到人BMSCs，培養(yǎng)至第 2 代時(shí)陽(yáng)性表面標(biāo)志是 CD90、CD44、CD29、CD51，陰性表面標(biāo)志是 CD45、CD34、CD7、AC133 等。研究者們應(yīng)用不同的分離擴(kuò)增方法及不同的方式表達(dá)細(xì)胞特性，使得對(duì)一些研究結(jié)果的比較變得困難，阻礙了其在這些領(lǐng)域的應(yīng)用［19］。因此在 2005 年，ISCT（the International Society for Cellular Therapy）定義了BMSCs 的最低標(biāo)準(zhǔn)：首先，BMSCs 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下必須具備貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)；其次，BMSCs 表達(dá)CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或CD11b、CD79a、或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表達(dá)陰性；第三，BMSCs 在體外能分化為成肌細(xì)胞或脂肪、成骨等多種細(xì)胞［20］。本研究結(jié)果表明，獲得的BMSCs和BMSDCs細(xì)胞均符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)。

圖2 豬BMSDCs細(xì)胞生物學(xué)特性

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，獲取的BMSCs開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)時(shí)，呈短梭形或多角形，具有長(zhǎng)短不等的數(shù)個(gè)細(xì)胞突起；在細(xì)胞密集區(qū)表現(xiàn)為渦旋狀，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，相互重疊成多層。但是BMSCs的傳代次數(shù)非常有限，最高傳代至18代。值得高興的是，我們最終獲得了由BMSCs衍生而來(lái)的亞型細(xì)胞，其生長(zhǎng)形態(tài)類(lèi)似于成纖維細(xì)胞，也具備標(biāo)準(zhǔn)BMSCs的特性，而且可以長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，生物學(xué)性狀穩(wěn)定（至發(fā)稿前該細(xì)胞已經(jīng)傳代超過(guò)200次），為后期基因工程細(xì)胞移植在動(dòng)物疫病防控領(lǐng)域的應(yīng)用提供了試驗(yàn)材料。關(guān)于本研究獲得的BMSCs和BMSDCs兩者之間的細(xì)胞生物學(xué)特性存在差異，可以理解為衍生細(xì)胞BMSDCs是BMSCs向成體細(xì)胞分化的中間型分化產(chǎn)物，但是BMSCs細(xì)胞具體的分化機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從第3代豬BMSCs衍生分化的細(xì)胞群中分離出一種亞型細(xì)胞，并建立了可長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)分析證實(shí)其仍然具備標(biāo)準(zhǔn)BMSCs細(xì)胞特性，可為后續(xù)研究BMSCs細(xì)胞分化機(jī)制及細(xì)胞移植治療提供充足的細(xì)胞材料。

［1］Jiang YH， Jahagirda BN， Reinhardt RL， et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow［J］. Nature，2002， 418（4）：41-49.

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（責(zé)任編輯 李楠）

Isolation，Culture and Characterization of Derived Cells from Neonatal Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Ruan Zheng1，2Wang Lianfang1Hu Xiuzhong1Wu Jianying2Zhang Sihua2Dai Changyun2Hua Juan1Xia Yu1Hu Xiaoming3Li Jie1Huang Haijun1，4
（1. Wuhan Institute of Animal and Veterinary Science，Wuhan 430208；2. Wuhan Animal Disease Prevention and Control Center，Wuhan 430023；3. Key Laboratory of Swine Breeding and Genetics of Ministry of Agriculture & Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics，Breeding and Reproduction of Ministry of Education，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070；4. Wuhan Bureau of Animal Husbandry and Veterinary，Wuhan 430023）

Recently it has become possible to use bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）in the clinical treatment of certain diseases. However， BMSCs， the seed cells used in transplantation， are limited in vitro proliferation capability and can only be obtained from very few sources. In order to acquire a substitute for BMSCs， the method of differential velocity adherent screening was used in this study to isolate a derived strain of porcine BMSCs， named bone marrow mesenchymal stem-derived cells（BMSDCs）. The biological characteristics of BMSDCs and BMSCs cells were compared by continuous morphological imaging by inverted microscope， and the growth curves of both cells were monitored by the MTT method. Furthermore， their characteristics of differentiation in vitro were examined， and flow cytometry was used to measure cell surface markers. Our results suggest that the doubling times of BMSCs and BMSDCs are 31. 3 h and 30. 3 h， respectively， and the average passaging time is 3-5 d and 2-3 d， respectively. Cultured BMSCs and BMSDCs are both positive for CD34 and CD90 and negative forCD44 and CD45. Both BMSCs and BMSDCs can differentiate into adipocytes and myoblasts by induced differentiation in vitro. Concerning their passaging abilities， the former can have 15 to 20 passages in vitro， whereas latter can have a longer period of time（more than 200 passages）while normal karyotypes are still maintained. We conclude that， under certain experimental circumstances， cultured porcine BMSDCs in vitro can survive and proliferate while maintaining multi-directional differentiation potential of BMSCs， and potentially it can be an ideal type of seed cell for tissue engineering.

bone marrow mesenchymal stem cell；derived cell；porcine；biological characteristics；tissue engineering

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.027

2014-09-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201938），武漢市晨光計(jì)劃（201150431078），武漢市農(nóng)科院英才計(jì)劃（YC201101）

阮征，男，高級(jí)獸醫(yī)師，研究方向：動(dòng)物疫病防控；E-mail：paper2006@sina.cn并列第一作者：王蓮芳，女，畜牧師，研究方向：動(dòng)物科學(xué)技術(shù)與推廣；E-mail：hygene@qq.com

黃海軍，男，博士，副研究員，研究方向：動(dòng)物生物技術(shù)與疫病防控；E-mail：hhj@stemcell8.com