孫曉梅 韓寧寧 楊宏光 楊盼盼

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，沈陽 110866）

芍藥種子下胚軸休眠相關(guān)基因的cDNA-AFLP分析

孫曉梅 韓寧寧 楊宏光 楊盼盼

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，沈陽 110866）

旨在探討芍藥種子下胚軸的休眠機(jī)理，采用cDNA-AFLP技術(shù)對層積0 d和根部露白兩個(gè)時(shí)期的芍藥種子進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。利用256對引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，篩選獲得3 600個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄衍生片段（TDFs），成功回收到1 200個(gè)TDFs，選取500個(gè)TDFs對其克隆測序，共得到42個(gè)有效序列。經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)，其中30個(gè)TDFs與已知功能基因同源，分別參與芍藥種子下胚軸休眠過程中的基因表達(dá)調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境脅迫、物質(zhì)與能量代謝等過程，9個(gè)TDFs與功能未知基因及假想蛋白同源，另有3個(gè)TDFs為無同源序列，可能是新的未知基因，這些基因有助于更好地闡明芍藥種子下胚軸休眠機(jī)理。

芍藥；種子；下胚軸；休眠；cDNA-AFLP；差異表達(dá)基因

芍藥（Paeonia lactiflora）為芍藥科芍藥屬多年生宿根草本花卉［1］。經(jīng)過長期的系統(tǒng)演化，芍藥種子形成了獨(dú)特的上下胚軸雙重休眠特性，表現(xiàn)為秋季降溫時(shí)下胚軸伸長，長出胚根，經(jīng)過冬季低溫后上胚軸休眠被破除，春季升溫后胚芽出土萌發(fā)，嚴(yán)重影響其實(shí)用觀賞價(jià)值［2］。目前關(guān)于芍藥種子休眠機(jī)理的研究僅集中于生理層面，這種特殊的雙重休眠分子機(jī)理仍不清楚。同時(shí)，下胚軸休眠是芍藥種子休眠的第一步，研究下胚軸休眠機(jī)理可以為進(jìn)一步研究上胚軸休眠奠定基礎(chǔ)。因此，研究種子下胚軸休眠分子機(jī)理，挖掘調(diào)控種子下胚軸休眠相關(guān)的基因?qū)ι炙幏N子休眠分子機(jī)理進(jìn)行探討具有重要的理論和實(shí)際意義。

cDNA-AFLP技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種重要的轉(zhuǎn)錄基因組學(xué)研究工具［3］，因其可靠性高，重復(fù)性好，且不需要預(yù)先知道序列信息，所需儀器設(shè)備簡單，被廣泛應(yīng)用于目標(biāo)性狀形成相關(guān)的基因分離和鑒定。周志欽［4］利用cDNA-AFLP技術(shù)對馬鈴薯塊莖從休眠到發(fā)芽整個(gè)生理過程中差異表達(dá)的基因進(jìn)行分析，初步確定了其主要差異表達(dá)基因及其表達(dá)的模式。 Juana等［5］篩選到201個(gè)與擬南芥種子萌發(fā)相關(guān)的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄衍生片段（differentially expressed transcript-derived fragments，TDFs），對其中48個(gè)克隆測序，有35個(gè)片段在GenBank數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)同源序列，剩余的功能未知。羅靜等［6］利用該技術(shù)獲得32個(gè)與已知芽休眠解除高度同源的TDFs，差異表達(dá)的基因功能主要涉及代謝、逆境響應(yīng)、細(xì)胞分化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)通過cDNA-AFLP技術(shù)對芍藥種子下胚軸休眠相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，獲得與該性狀形成相關(guān)基因的序列信息，篩選與芍藥種子下胚軸休眠相關(guān)的基因，旨在為揭示芍藥種子休眠分子機(jī)理提供理論依據(jù)，進(jìn)而促進(jìn)芍藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用芍藥種子于2013年8月下旬從沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園收獲，為芍藥品種中的‘粉玉奴’（‘Fen Yu Nu’）作母本與‘粉中樓’（‘Fen Zhong Lou’）作父本的雜交種子，千粒重為233.54 g。

選取層積0 d和根部露白兩個(gè)時(shí)期的芍藥種子去除種皮，用無菌刀片切成薄片，錫紙包裹后于液氮中速凍，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 芍藥種子總RNA的提取采用北京TIANGEN公司的RNAprep pure Plant Kit，并參照其說明書進(jìn)行，其總RNA的純度、濃度及完整性采用ES-2型微量紫外可見吸光-熒光光度計(jì)和1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測定；雙鏈cDNA采用大連TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit并參照說明書合成，其濃度采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.2 cDNA-AFLP分 析 cDNA-AFLP分 析 參 考Vuylsteke的方法進(jìn)行［7］。雙鏈cDNA用EcoRⅠ和MseⅠ酶切后連接接頭，連接產(chǎn)物稀釋10倍用于預(yù)擴(kuò)增，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍，取5 μL作為選擇性擴(kuò)增的模板，采用256對引物組合對兩個(gè)時(shí)期的芍藥種子進(jìn)行了cDNA-AFLP差異表達(dá)分析，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%的聚丙烯酰胺變性凝膠電泳，銀染檢測。接頭和引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 接頭和引物序列

1.2.3 差異片段的回收、克隆及序列測定 用滅菌刀片將差異片段切下，放入離心管中，加入40 μL滅菌雙蒸水，95℃水浴30 min，15℃ 12 000 r/min離心10 min。取5 μL上清液作模板，用相應(yīng)的選擴(kuò)引物來進(jìn)行二次擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃7 min。經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離、回收和純化。將目的片段連接到pGM-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，選取經(jīng)過檢測為陽性克隆的菌液，進(jìn)行測序。

1.2.4 序列分析 對所得的序列在NCBI應(yīng)用BLAST程序進(jìn)行同源性比對分析，預(yù)測其功能，篩選出與芍藥種子下胚軸休眠相關(guān)的基因。

2 結(jié)果

2.1 cDNA-AFLP分析

利用256對EcoRⅠ和MseⅠ引物組合對層積0d和根部露白兩個(gè)時(shí)期的芍藥種子cDNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，均得到較好的擴(kuò)增效果，表明cDNA-AFLP分析技術(shù)對芍藥差異表達(dá)基因的篩選是一種相對有效的方法。共得到9 595個(gè)可以分辨的差異條帶，平均每對引物擴(kuò)增出37個(gè)TDFs，片段大小分布在100-1 000 bp之間，其中小于100 bp的片段忽略不計(jì)，共得到1 200個(gè)片段。部分選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，兩個(gè)時(shí)期的芍藥種子的條帶大部分相同，有差異的條帶較少。條帶包含4種類型：Ⅰ類為在對照和露白中均有條帶，約占60%，是維持芍藥正常生長發(fā)育必需的基因；Ⅱ類僅在對照中出現(xiàn)條帶，約占4%，是導(dǎo)致休眠的基因，Ⅲ類僅在露白出現(xiàn)條帶，約占5%，是促進(jìn)萌發(fā)的基因，為特有的差異片段，Ⅱ類和Ⅲ類是由于不同時(shí)期種子存在背景的差異；Ⅳ類在對照和露白中都沒有條帶，約占2%，可能是引物的原因。

圖1 部分選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠圖譜

2.2 序列比對與功能分析

為了探索芍藥種子下胚軸休眠的分子機(jī)理，對部分差異片段進(jìn)行測序與功能預(yù)測。從1 200個(gè)差異片段中選取500個(gè)TDFs進(jìn)行回收、克隆測序，得到42個(gè)有效序列。表2為差異序列同源檢索結(jié)果。

經(jīng)BLAST比對顯示，30個(gè)（72%）TDFs與已知功能基因同源，9個(gè)（21%）TDFs與功能未知基因及假想蛋白同源，其余3個(gè)（7%）TDFs未檢索到相似序列或可信度太低，可能是未知基因的表達(dá)序列，需進(jìn)一步分析驗(yàn)證。本研究得到的30個(gè)TDFs可能成為與下胚軸休眠相關(guān)的候選基因，功能涉及代謝、逆境響應(yīng)、細(xì)胞分化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等（圖2）。

3 討論

休眠是植物的一種天然特性，也可視為是對環(huán)境的一種適應(yīng)性，用休眠的方式來避免不宜環(huán)境的影響，直到環(huán)境條件適合后代存活時(shí)再啟動(dòng)萌發(fā)，為植物的后續(xù)生長奠定基礎(chǔ)，然而種子休眠過程中分子機(jī)制極為復(fù)雜，打破種子休眠而萌發(fā)的分子機(jī)制目前尚未明確。本實(shí)驗(yàn)以具有下胚軸休眠的芍藥種子為試材，通過cDNA-AFLP差異分析對芍藥種子休眠的分子機(jī)制進(jìn)行基礎(chǔ)性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30個(gè)差異序列對應(yīng)蛋白質(zhì)編碼基因，其余12個(gè)差異序列中有9個(gè)與微衛(wèi)星、轉(zhuǎn)座子表現(xiàn)出顯著的差異性，有3個(gè)與任何基因庫都不同源。許多與轉(zhuǎn)座子相似，或具有重復(fù)序列的特點(diǎn)。轉(zhuǎn)座子和未知序列在種子休眠萌發(fā)過程中表達(dá)量很高。

種子下胚軸休眠過程中，基因表達(dá)、酶活性及激素積累方面均有不同，同時(shí)通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)傳遞信號，啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，開啟相關(guān)代謝途徑。TDF6編碼的蛋白質(zhì)與肌醇半乳糖苷酶同源，參與植物體內(nèi)的基礎(chǔ)代謝，該酶的主要功能是合成棉子糖家族寡糖（RFOs）。在低溫脅迫時(shí)，RFOs會(huì)迅速增加，提高體內(nèi)的糖含量，改變細(xì)胞的滲透壓，增強(qiáng)種子對休眠的適應(yīng)性［8］。參與淀粉合成的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（TDF36）無明顯變化。TDF16編碼的蛋白與半胱氨酸蛋白酶同源，半胱氨酸蛋白酶可以降解底物中的天冬氨酸殘基，可以調(diào)控植物的程序性細(xì)胞死亡（PCD）活性，與植物休眠相關(guān)［9］。有報(bào)道表明，植物處于休眠時(shí)，由于活性氧的原因，導(dǎo)致無功能蛋白質(zhì)的積累，需要利用泛素化過程及時(shí)處理這些蛋白［10］。泛素結(jié)合酶E2（TDF25）參與植物蛋白降解途徑，泛素化的蛋白能被26S蛋白酶體降解，釋放的泛素，再循環(huán)利用。熱激蛋白（HSP）與植物休眠之間存在一定的關(guān)系。熱激蛋白又稱熱休克蛋白（TDF13），不僅在熱刺激條件下表達(dá)［11］，在種子的萌發(fā)期也有相應(yīng)的HSP表達(dá)。熱激誘導(dǎo)的HSP70在休眠階段富集打破休眠，使其萌發(fā)。F-box蛋白（TDF17）在生長素的信號傳導(dǎo)、生長發(fā)育以及對生物鐘節(jié)律的調(diào)節(jié)等許多傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括從接收到休眠信號到各個(gè)基因表達(dá)的整個(gè)級聯(lián)反應(yīng)，是植物休眠分子機(jī)制的重要組成部分。在生長素依賴的方式中，F(xiàn)-box蛋白生長素受體同Aux/IAA阻遏物相互作用［12］。線粒體磷酸轉(zhuǎn)移子（TDF5）是位于線粒體內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)子［13］，與許多重要的機(jī)體活動(dòng)息息相關(guān)，影響植物的生長、發(fā)育及性狀，參與酶代謝、物質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)。在植物解除休眠過程中，表達(dá)量明顯升高，促進(jìn)ATP的合成，提高植物體內(nèi)ATP/ADP的比值，從而使解除休眠過程中所需的相關(guān)蛋白大量合成，徹底打破休眠。木葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶（TDF14）通過催化轉(zhuǎn)糖苷，調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的彈性和延展性來影響植物的生長發(fā)育功能［14］。TDF24與鋅指蛋白同源，是一類能夠調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子［15］。鋅指蛋白與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚發(fā)育等密切相關(guān)，主要與核酸相互作用，通過調(diào)控靶基因的表達(dá)與基因結(jié)合來調(diào)節(jié)種胚發(fā)育，使其萌發(fā)。UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（TDF39）廣泛存在于植物體中，將活性糖基從核苷糖轉(zhuǎn)移到植物激素分子上［16］。種子休眠過程中，該酶是細(xì)胞維持代謝平衡的主要酶之一，參與信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，對打破休眠維持正常的生長發(fā)育具有重要作用。

表2 差異片段的序列比對結(jié)果

圖2 芍藥種子下胚軸休眠差異表達(dá)基因的功能分析

部分分離的序列也未與公共數(shù)據(jù)庫的序列表現(xiàn)出相似性。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一些新序列，都具有唯一性。在種子休眠過程中，許多轉(zhuǎn)座子有助于新序列的注釋和調(diào)控機(jī)理分析。這一結(jié)果說明，雖然芍藥種子下胚軸的休眠是對其生長發(fā)育生命周期中一個(gè)相對靜止的時(shí)期，但整個(gè)過程均有不同類型的基因參與表達(dá)。從這一多樣性上可以看出芍藥種子休眠在分子水平上的復(fù)雜性，同時(shí)也在分子方面為前面提到的眾多因子影響芍藥種子下胚軸休眠提供了理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)是根據(jù)BLAST比對得到的同源序列，對可能與下胚軸休眠相關(guān)的TDFs進(jìn)行初步功能預(yù)測，后續(xù)的研究是將得到的相關(guān)序列通過RACE技術(shù)，獲得目的基因全長，并進(jìn)一步利用原核表達(dá)的方法進(jìn)行功能驗(yàn)證，為芍藥種子下胚軸休眠分子機(jī)理最終闡明奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用cDNA-AFLP技術(shù)對芍藥種子休眠時(shí)期的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，分離出30個(gè)與下胚軸休眠相關(guān)的差異片段，對其進(jìn)行克隆測序及功能預(yù)測，涉及基因表達(dá)調(diào)控、能量代謝、逆境響應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面。

［1］ 魁杰. 芍藥［M］. 北京：中國林業(yè)出版社， 2004.

［2］ 李嘉玨. 中國牡丹與芍藥［M］. 北京：中國林業(yè)出版社，1999：153-155.

［3］ Borgmann K， Sinaha P. Changes in the two dimensional protein pattern and in gene expression during the sink to source transition of patato tubers［J］. Plant Science， 1994， 99：97-108.

［4］ 周志欽. 馬鈴薯從休眠到發(fā)芽過程差異表達(dá)基因的分析［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2001， 23（3）：210-215.

［5］ de Diego JG， David Rodríguez F， Rodríguez Lorenzo JL， et al. cDNAAFLP analysis of seed germination in Arabidopsis thaliana identifies transposons and new genomic sequences［J］. Journal of Plant Physiology， 2006， 163：452-462.

［6］ 羅靜， 張巧蓮， 武崢， 等. 桃花芽休眠解除相關(guān)上調(diào)表達(dá)基因的cDNA-AFLP分析［J］. 果樹學(xué)報(bào)， 2012， 29（4）：557-562.

［7］ Vuylsteke M， Peleman JD， van Eikl MJ. AFLP-based transcript profiling（cDNA-AFLP）for genome-wide expression analysis［J］. Nature Protocols， 2007， 2（6）：1399-1413.

［8］ 黃東亮， 李雙喜， 廖青， 等. 植物蔗糖磷酸合成酶研究進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志， 2012， 32（6）：109-119.

［9］ Masaki S， Ohtsuka R， Abe Y， et al. Expression analysis of microRNAs in rythropoiesis［J］. Rinsho， Byori， 2008， 56（12）：1086-1092.

［10］ Ernst R， Claessen JH， Mueller B， et al. Enzymatic blockade of the ubiquitin-proteasome pathway［J］. PLoS Biology， 2011， 8（3）：e1000605.

［11］ Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， et al. Two transcription factors，DREB1 and DREB2， with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction path ways in drought and low temperature responsive gene expression， respectively， in Arabidopsis［J］. Plant Cell， 1998， 10：1391-1406.

［12］ Chapman EJ， Estelle M. Mechanism of auxin-regulated gene expression in plants［J］. Annual Review of Genetics， 2009， 43：265-285.

［13］ 鄭國生， 蓋樹鵬， 孟麗， 等. 低溫解除牡丹芽休眠過程中內(nèi)源激素的變化［J］. 林業(yè)科學(xué)， 2008， 45（2）：48-52.

［14］ Dong J， Jiang YY， Chen RJ， et al. Isolation of a novel xyloglucan endotransgucosylase（OsXET9）gene from rice and analysis of the response of this gene to abiotic stresses［J］. African Journal of Biotechnology， 2011， 10（76）：17424-17434.

［15］ Mukhopadhyay A， Vij S， Tyagi AK. Overexpression of a zinc-finger protein gene from rice confers tolerance to cold， dehydration and saltstress in transgenic tobacco［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2004， 101（16）：6309-6314.

［16］ Steven F， Isabel DS， Heather C. Dormancy cycling in Arabidopsis seeds is controlled by seasonally distinct hormone signaling pathways［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2011， 108：20236-20241.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

cDNA-AFLP Analysis of Dormancy-related Genes in Seed Hypocotyl of Paeonia lactiflora

Sun Xiaomei Han Ningning Yang Hongguang Yang Panpan
（College of Forestry，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866）

To explore the dormancy mechanism of seed hypocotyl of Paeonia lactiflora and isolate dormancy-related genes from P. lactiflora， a cDNA-AFLP technology was used to identify differentially expressed genes between the stages of seeds with stratification for 0 d and germination. A total of 3 600 differentially expressed transcript-derived fragments（TDFs）were screened by selective PCR amplification using 256 primer combinations， and 1 200 TDFs were recovered successfully. Then selected 500 TDFs were cloned and sequenced， and 42 effective sequences were obtained. Bioinformatics analysis with BLAST showed that 30 TDFs were homologous to the known functional genes， which involved in gene expression regulation， signal transduction， stress responding， material and energy metabolism etc. during the dormancy of seed hypocotyl of P. lactiflora. Nine TDFs were similar to genes of unknown functions and hypothetical proteins， and another 3 TDFs had no sequence homology to GenBank entries and might be new unknown genes， which could help us to clarify the mechanism of seed hypocotyl dormancy of P. lactiflora.

Paeonia lactiflora；seed；hypocotyl；dormancy；cDNA-AFLP；differentially expressed gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.018

2014-09-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31240028，31470696）

孫曉梅，女，博士，教授，研究方向：園林植物遺傳育種；E-mail：xiaomei7280@126.com