艾秋實(shí)曹向宇趙芊牛亞利，4宋水山

（1. 河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071001；3.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，石家莊 050081；4.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130）

微量熱泳動技術(shù)原理及其在研究生物分子互作方面的應(yīng)用

艾秋實(shí)1，2，3曹向宇1，3趙芊1，3牛亞利1，3，4宋水山1，3

（1. 河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071001；3.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，石家莊 050081；4.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130）

微量熱泳動（MST）技術(shù)是近年來興起的一項(xiàng)用于研究生物分子間互作的新技術(shù)。其檢測是基于熱泳動現(xiàn)象，即分子在溫度梯度中的定向運(yùn)動及由此引起分子性質(zhì)的變化，如分子大小、電荷和水化層及構(gòu)象等。該方法把精確的熒光檢測與靈敏的熱泳動相結(jié)合，從而提供了一個靈敏的、快速的精確分析生物分子間互作的檢測方法。就MST的工作原理和檢測過程及其在生物學(xué)研究中的應(yīng)用作以綜述。

微量熱泳動；互作分析；結(jié)合性研究；生物分子間互作

研究生物分子的相互作用，對于探明生物體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控機(jī)制、生理生化代謝途徑具有重要意義。在生命科學(xué)研究中，人們經(jīng)常利用熒光分子追蹤和分析分子間的相互作用。這是因?yàn)闊晒庀嚓P(guān)技術(shù)在研究生物學(xué)過程中起到了極其重要的作用［1］。多種顯微技術(shù)可對細(xì)胞內(nèi)的熒光分子進(jìn)行觀察，而且在體外實(shí)驗(yàn)中也可應(yīng)用熒光分子。無論是檢測結(jié)合常數(shù)和酶活，還是研究蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)機(jī)制都能使用熒光分子相關(guān)技術(shù)對生物分子運(yùn)動過程的生物物理學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定。在過去幾十年中，熒光技術(shù)作為一種體外檢測方法幫助人們認(rèn)識了生物分子諸多方面的功能。這是由于熒光技術(shù)具有應(yīng)用廣泛、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)［2］。

利用熒光技術(shù)分析生物分子間互作，主要依靠檢測系統(tǒng)的性能、熒光猝滅機(jī)理、熒光光譜［3］、異向性或福斯特（Foerster）共振能量轉(zhuǎn)移來分析某個反應(yīng)的平衡常數(shù)。然而，這些技術(shù)還存在一定的局限性，如需要依賴分子的大小，結(jié)合時分子大小的變化和熒光團(tuán)相互作用時相對位置等參數(shù)［4］。另外，這些技術(shù)具有樣品用量大，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，數(shù)據(jù)分析不精確等缺點(diǎn)。

基于熒光檢測技術(shù)的優(yōu)勢，微量熱泳動（microscale thermophoresis，MST）技術(shù)將熒光檢測與熱泳動現(xiàn)象相結(jié)合，提供了一個高效、精確、靈敏的檢測方法。MST檢測通常需要用熒光標(biāo)記蛋白，配體則不需要標(biāo)記。在溫度梯度中，熒光標(biāo)記蛋白與配體發(fā)生熱泳動，導(dǎo)致反應(yīng)體系中熒光分布發(fā)生變化。MST就是通過檢測溫度梯度場中，分子熱泳動引起的熒光分布變化來分析分子間相互作用。

1 MST基本介紹

1.1 基本原理

熱泳動現(xiàn)象由 Ludwig首次闡釋，指在溫度梯度下分子的定向運(yùn)動［5］。2010年，Wienken 等［6］首次報道了利用MST技術(shù)研究蛋白質(zhì)及小分子在生物溶液中的相互作用，此項(xiàng)技術(shù)的興起是研究生物分子間互作領(lǐng)域的一場革命。MST檢測設(shè)備由Nano Temper公司發(fā)明，其工作原理是生物分子在毛細(xì)管中發(fā)生熱泳動現(xiàn)象，導(dǎo)致發(fā)生相互作用的生物分子的水化層、分子大小、電荷等分子性質(zhì)發(fā)生改變，進(jìn)而引起反應(yīng)體系中熒光分布的變化，以檢測相互作用的生物分子間的親和性。

MST生物物理學(xué)背景已經(jīng)有了廣泛的報道［7-10］。反應(yīng)體系中的溫度變化（ΔT）可導(dǎo)致溫度升高區(qū)域中粒子數(shù)量減少。通過索雷特（Soret）系數(shù)對熱泳動進(jìn)行定量分析 ST：Chot/Ccold=exp（-STΔT）。熱泳動的減弱是由于分子與溶劑交界面相互作用導(dǎo)致的。在緩沖液不變的情況下，熱泳動可分析分子的大小、電荷和溶劑熵值。如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的熱泳動是有顯著差異的，復(fù)合物形成后會引起分子大小、電荷和溶劑能量的改變。即使結(jié)合后不能顯著改變蛋白大小、電荷，MST仍可通過檢測溶劑熵值的變化來檢測結(jié)合是否發(fā)生［10］。MST除了能精確檢測生物分子間相互作用，計算解離常數(shù)（Kds），還能得到有關(guān)生物分子互作的其他參數(shù)。

1.2 性能優(yōu)勢

長期以來，測定生物分子間的結(jié)合情況一般使用生物化學(xué)的方法。因其能直接呈現(xiàn)檢測結(jié)果，而且操作簡單、成本低。常用的生物化學(xué)方法包括，用于檢測蛋白與核酸相互作用的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），以及基于抗體的檢測技術(shù)，如酶聯(lián)免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）［11，12］。盡管這些檢測方法應(yīng)用廣泛，但很難對結(jié)合情況進(jìn)行精確分析［13］。

生物物理學(xué)的方法可對生物分子的結(jié)合情況進(jìn)行定量研究。然而目前應(yīng)用較多的一些檢測方法也存在著局限性。如等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）雖然無需標(biāo)記和固定樣品，但其靈敏度較低，且需要較多的待測樣品產(chǎn)生明顯的熱信號用于檢測，這就加大了樣品制備的難度［14］。動態(tài)光散射法（dynamic light scattering，DLS）也是免標(biāo)記、免固定樣品的方法，但其檢測依靠未結(jié)合組分與結(jié)合復(fù)合體之間水動力半徑（rH）的明顯差異，這限制了檢測的范圍［15］。熒光偏振技術(shù)（flourscence polarization，F(xiàn)P）盡管無需固定樣品，但其適用性和靈敏性受熒光染料的壽命、熒光標(biāo)記配體的大小以及配體結(jié)合后分子質(zhì)量變化的影響。該方法使用的熒光染料為熒光素，其壽命短，分子量普遍大于0.3 kD，這會影響配體的結(jié)合運(yùn)動［16，17］。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）法靈敏度高，可實(shí)時獲取檢測數(shù)據(jù)。但其需要將樣品固定，這會影響結(jié)合分子的動力學(xué)特性進(jìn)而影響結(jié)合反應(yīng)發(fā)生［18］。而MST技術(shù)則避免了上述實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不足。

MST能對微升（μL）級的溶液進(jìn)行檢測，這不完全取決于待測分子的大小變化和物理特性［6，9，19］。MST的檢測主要基于生物分子水化層的改變，所以比其他的熒光技術(shù)應(yīng)用范圍廣［7，8］。因此，MST不會像FP技術(shù)那樣，需要改變待測分子的大小和質(zhì)量，同時避免了DLS受制于結(jié)合組分的分子質(zhì)量比。另外，MST不用固定樣品，且樣品用量極少，這是ITC、SPR等非熒光檢測法所不具備的優(yōu)勢。而且細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞裂解液等復(fù)雜生物溶液可作為MST檢測的反應(yīng)體系［6，10］。

根據(jù)檢測器不同MST檢測設(shè)備分為Monolith NT.115/Monolith.NT115Pico和 Monolith NT.LabelFree。使用Monolith NT.115/Monolith.NT115Pico型號檢測時需要對其中一個待測分子進(jìn)行熒光標(biāo)記。Monolith NT.LabelFree的出現(xiàn)為研究生物分子互作提供了一個完全免標(biāo)記的檢測方法［20］，這是因?yàn)樗軝z測到蛋白質(zhì)自身所含芳香類氨基酸發(fā)出的內(nèi)源熒光。另外Monolith NT.Automated結(jié)合了上述兩種類型檢測器的特性，所以具備高通量篩選的能力。

綜上所述，MST與其他方法相比具有以下幾方面優(yōu)點(diǎn)：（1）可在多種生物溶液中進(jìn)行檢測；（2）實(shí)時獲取檢測數(shù)據(jù)；（3）靈敏度極高；（4）樣品處理簡單；（5）檢測時間短；（6）待測樣品用量極少。

1.3 解離常數(shù)的計算

Kds是通過MST測得的重要參數(shù)。Kds是反應(yīng)分子間親和力的重要指標(biāo)。它被定義為：

Kds：解離常數(shù)；［A］free：游離態(tài)A組分濃度；［B］free：游離態(tài)B組分濃度；［AB］：A與B結(jié)合后形成的復(fù)合體濃度。

但兩個結(jié)合組分的游離態(tài)濃度無法測得。所以，以它們的總濃度替代。它們的總濃度分別被定義為：［A］=［A］free+［AB］和［B］=［B］free+［AB］

因此Kds被定義為：

下面將A定義為滴定組分，即配體。B定義為與A結(jié)合的另一組分，即受體。其濃度保持不變，熒光值可被儀器讀出。由此解出B的結(jié)合率（FB）即可求得Kds。FB為：

MST設(shè)備給出的Fnorm是關(guān)于FB的線性函數(shù)，因此由上述等式可得出Fnorm［21］。

2 MST檢測過程

除了使用Monolith NT.LabelFree外，MST檢測要對其中一個互作分子進(jìn)行熒光標(biāo)記且濃度不變，而非熒光標(biāo)記的分子進(jìn)行倍比稀釋，根據(jù)儀器的規(guī)格最多可做15個濃度梯度。因此MST檢測主要涉及熒光標(biāo)簽選擇，結(jié)合配體的倍比稀釋和毛細(xì)管3方面的問題。MST的檢測過程，如圖1所示。

2.1 熒光標(biāo)簽

除Monolith NT.LabelFree型外，MST的激發(fā)光波長處于可見光范圍內(nèi)，所以要對待測分子進(jìn)行熒光標(biāo)記才能檢測其熱泳動現(xiàn)象，如熒光標(biāo)簽、融合熒光蛋白。生物分子存在結(jié)合標(biāo)簽位點(diǎn)，它的結(jié)合并不影響熱泳動的產(chǎn)生。此外，隨機(jī)結(jié)合的標(biāo)簽有利于MST的檢測。因?yàn)樵诮Y(jié)合過程中能降低單個標(biāo)簽的局部效應(yīng)。熒光物質(zhì)與目的分子偶聯(lián)需要特定的pH值，大部分蛋白質(zhì)都可適應(yīng)這一條件。除了蛋白質(zhì)，其他生物分子也可利用熒光標(biāo)簽進(jìn)行相互作用的研究。

熒光標(biāo)記法要針對目標(biāo)蛋白選擇特定的熒光標(biāo)簽。在體外表達(dá)系統(tǒng)中，可將嘌呤毒素?zé)晒鈭F(tuán)與C端結(jié)合［23］，也可與攜帶熒光染料的非天然氨基酸結(jié)合［24］，或是結(jié)合后對其進(jìn)行特殊修飾［25］。另外，細(xì)胞裂解液中可直接使用重組蛋白，如綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），或是針對特定染料的結(jié)合位點(diǎn)選用肽段序列標(biāo)簽。

熒光標(biāo)簽提供了一種高靈敏的檢測方法，可用于納摩（nmol）水平的檢測。該方法能檢測復(fù)雜液體環(huán)境中帶有不同標(biāo)簽的混合分子。然而熒光標(biāo)簽可能會影響分子間的結(jié)合，像G蛋白偶聯(lián)受體等膜蛋白對于修飾比較敏感。所以在選擇熒光標(biāo)簽時，要考慮被標(biāo)記生物分子的性質(zhì)，核酸、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同，它們需要的熒光標(biāo)簽也不同。通過使用Monolith NT.LabelFree型儀器可解決此問題，該儀器在紫外條件下檢測蛋白質(zhì)自身含有的芳香類氨基酸發(fā)射的熒光，如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

選擇熒光源時，要考慮MST檢測時所用緩沖液的性質(zhì)，使得緩沖液的背景熒光值在熒光團(tuán)特定波長下產(chǎn)生盡可能小的信噪比。因此，在細(xì)胞裂解物或血清等復(fù)雜生物溶液中必須采用熒光標(biāo)簽，因?yàn)樯锶芤汉休^高濃度的蛋白質(zhì)會產(chǎn)生較高的紫外熒光值。

圖1 MST檢測過程［22］

2.2 倍比稀釋

一般初始熒光強(qiáng)度是恒定的，除非熒光團(tuán)接近結(jié)合位點(diǎn)或出現(xiàn)表面吸附和聚集情況。為驗(yàn)證這些情況是否對檢測產(chǎn)生影響，應(yīng)用去垢劑或小牛血清蛋白（BSA）等作為陰性對照。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)紫外范圍內(nèi)背景熒光值是不容忽視的，所以免標(biāo)記的MST檢測應(yīng)設(shè)置陰性對照，以扣除本底信號的干擾。通過倍比稀釋的方法，將不同濃度的非熒光標(biāo)記反應(yīng)物與固定濃度的熒光標(biāo)記反應(yīng)物混合。前者的最低濃度為游離狀態(tài)下儀器能檢測到其熱泳動的發(fā)生，最高濃度要高于預(yù)期的Kds，以及與熒光標(biāo)記反應(yīng)物完全結(jié)合時所需的濃度。通常認(rèn)為最高濃度是Kds的20倍左右。

2.3 毛細(xì)管

將待測樣品通過毛細(xì)管現(xiàn)象吸到不同的毛細(xì)管中。4 μL樣品就能滿足測試的需要。MST實(shí)驗(yàn)所用毛細(xì)管的內(nèi)徑差距不會大于1 μm，以確保每根毛細(xì)管中產(chǎn)生一致的溫度梯度，因此毛細(xì)管內(nèi)表面對實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果至關(guān)重要。毛細(xì)管外層的厚度也影響著溫度梯度及總體溫度的增加，它的熱傳導(dǎo)性決定了遠(yuǎn)離紅外線（IR-laser）照射區(qū)域的熱傳導(dǎo)效率。標(biāo)準(zhǔn)MST毛細(xì)管（nanotemper technologies）的內(nèi)表面是高度均勻的，其背景信號很低。對于非特異吸附在毛細(xì)管表面的反應(yīng)物，MST設(shè)備能輕易的檢測到，或利用BSA作為陰性對照以避免非特異吸附對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。例如，對小分子物質(zhì)檢測時，可利用BSA作為對照實(shí)驗(yàn)以排除小分子的非特異結(jié)合。毛細(xì)管內(nèi)表面也可進(jìn)行親水或疏水處理。

3 MST在生物分子互作研究中的應(yīng)用

近些年，MST已經(jīng)成功的應(yīng)用在研究生物分子間互作領(lǐng)域，主要包括寡聚核苷酸間的互作、蛋白質(zhì)與DNA的互作、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作、蛋白質(zhì)與小分子間的互作，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)體的互作。

3.1 寡核苷酸相互作用的研究

適配體（aptamer）是體外篩選的能與特定目標(biāo)分子結(jié)合的核苷酸序列，它與適配體-目標(biāo)結(jié)合物產(chǎn)生的熱泳動現(xiàn)象具有顯著差異。Baaske等［26］利用Cy5染料標(biāo)記核苷酸序列，定量分析凝血酶適配體與凝血酶的結(jié)合情況。他們發(fā)現(xiàn)在不同緩沖液中，適配體與目標(biāo)物的親和性存在差異，在10%和50%血清中測得的結(jié)合常數(shù)與其他緩沖液中測得的不同，由此表明MST可對血清這樣復(fù)雜的生物溶液進(jìn)行檢測，其檢測的靈敏度和特異性不受血清中其他組分的影響。他們還分析了ATP適配體在不同緩沖液中與AMP和ATP的結(jié)合情況。

分子穩(wěn)定性和構(gòu)象是生物分子重要的測量參數(shù)。Wienken等［27］通過測定核酸的熱泳動，精確檢測核酸的熔化相變和分解時構(gòu)象變化。利用MST分析了單核苷酸的多態(tài)性、DNA修飾、DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)和雙鏈小RNA的構(gòu)象。他們把MST測得的結(jié)果與紫外吸收光譜法測得的結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，利用兩種方法測得的結(jié)果一致，證實(shí)了MST在核酸分析方面的可靠性。

3.2 蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究

病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5是構(gòu)成病毒質(zhì)的主要成分。Martin等［28］證實(shí)鐵硫簇在NSP5與ssRNA結(jié)合過程中發(fā)揮作用。用Cy-3標(biāo)記ssRNA與野生型NSP5或缺少鐵硫簇的NSP5 C171A C174反應(yīng)，以測得Kds。MST結(jié)果顯示，野生型NSP5有兩個結(jié)合位點(diǎn)可以結(jié)合ssRNA，且兩個結(jié)合位點(diǎn)的親和性不同。而NSP5 C171A C174只具有親和性較高的結(jié)合位點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄因子PU.1在造血系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，在分化過程中PU.1的結(jié)合形式會發(fā)生明顯的改變。轉(zhuǎn)錄因子能夠識別并結(jié)合到基因組特定DNA序列。Pham等［29］通過體內(nèi)外結(jié)合實(shí)驗(yàn)和生物信息技術(shù)研究表明，PU.1選擇它的結(jié)合位點(diǎn)主要依靠與目的序列的親和性。他們利用MST技術(shù)檢測了75個Cy-3標(biāo)記的DNA模體序列與體外表達(dá)PU.1的Kds發(fā)現(xiàn)，每個模體log-odds scores與Kds成反比，認(rèn)為logodds scores能夠反應(yīng)模體序列的親和力。

3.3 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究

泛素化信號被一整套泛素受體識別，Keren-Kaplan等［30］發(fā)現(xiàn)了一個可能與泛素結(jié)合的結(jié)構(gòu)域ALIX-V。首先通過pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALIX-V與泛素具有較強(qiáng)的親和性，但SPR測得的Kds約為2 200 μmol/L，不能印證pull-down實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。利用MST技術(shù)測得Kds約為119 μmol/L，這一結(jié)果與多數(shù)泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域特征相符。他們推測SPR與MST結(jié)果出現(xiàn)分歧的原因可能是泛素引起ALIX-V發(fā)生齊聚反應(yīng)，SPR實(shí)驗(yàn)需要把ALIX-V固定，而MST實(shí)驗(yàn)并不需要將其固定。他們又通過MST實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了其推測。

線粒體熱休克蛋白Hsp70的分子伴侶 Ssq1在鐵硫蛋白成熟過程中起著至關(guān)重要的作用。Ssq1與支架蛋白Isu1結(jié)合，以促進(jìn)新合成的鐵硫簇從Isu1上解離，同時Ssq1轉(zhuǎn)移到目標(biāo)載脂蛋白上。Uzarska等［31］證實(shí)Ssq1也可與硫醇谷氧還蛋白5（Grx5）結(jié)合，但是結(jié)合位點(diǎn)與Isu1不同。在MST實(shí)驗(yàn)中使用Kit Red標(biāo)記Grx5與Ssq1進(jìn)行反應(yīng)，計算出Grx5的親和常數(shù)。

3.4 蛋白質(zhì)與小分子互作的研究

小分子物質(zhì)可競爭單結(jié)構(gòu)域酶的活化位點(diǎn)，抑制其蛋白功能，還可干擾兩個含單結(jié)構(gòu)域酶的相互作用。tRNA-鳥嘌呤轉(zhuǎn)糖基酶（TGT）只有形成二聚體才能發(fā)揮作用，因此通過小分子物質(zhì)抑制TGT形成二聚體是治療志賀桿菌病的新思路。為阻止TGT形成二聚體，Immekus等［32］根據(jù)TGT的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計了不同類型的配體。利用MST技術(shù)檢測Alexa Fluor 647標(biāo)記的TGT與不同配體間的Kds。并通過［8-3H］鳥嘌呤動力學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了所測得Kds。

G-蛋白介導(dǎo)的Rho鳥苷酸交換因子（GEF）-Rho GTPase信號軸參與人類的病理過程，它也是一個潛在的治療位點(diǎn)。Shang等［33］對能夠嵌入LARG（參與RhoA激活并受G蛋白調(diào)節(jié)的Rho GEF）的DH-PH結(jié)構(gòu)域的化學(xué)物進(jìn)行了篩選，并通過生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以Y16為代表的一類化學(xué)抑制劑能夠特異的阻止LARG與RhoA結(jié)合。通過MST技術(shù)檢測Y16與Alexa Fluor 647標(biāo)記的LARG作用時的 Kds，表明Y16能與LARG特異性結(jié)合。他們還用LARG不同位點(diǎn)的突變體與Y16反應(yīng)，進(jìn)一步明確了Y16與LARG的結(jié)合位點(diǎn)。

N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）是革蘭氏陰性細(xì)菌分泌的一類群體感應(yīng)信號，并能影響植物體內(nèi)多條信號通路［34］。因此尋找植物體內(nèi)AHLs受體對進(jìn)一步研究植物如何感應(yīng)AHLs至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室利用MST技術(shù)驗(yàn)證擬南芥體內(nèi)可能的AHLs受體G蛋白偶聯(lián)受體2（GCR2）是否作為某種AHLs的受體，即用Kit Red標(biāo)記GCR2并與不同的AHLs分子進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)（未發(fā)表）。

3.5 蛋白質(zhì)與脂質(zhì)體互作的研究

突觸囊泡蛋白Synaptotagmin-1是神經(jīng)元胞吐作用中重要的Ca2+感受器，它同時與Ca2+和帶陰離子的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）結(jié)合。但三者間的協(xié)同作用還并不十分清楚。Van Den Bogaart等［35］利用MST技術(shù)分析了PIP2和Ca2+與Synaptotagmin-1的結(jié)合情況。用Alexa Fluor 488標(biāo)記Synaptotagmin-1及其突變體發(fā)現(xiàn)，PIP2與C2B結(jié)構(gòu)域保守區(qū)域結(jié)合。當(dāng)有較高濃度的PIP2存在時可以顯著提高Ca2+與C2AB的親和性。由此證明，在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中，Ca2+、synaptotagmin-1和PIP2之間的相互作用十分緊密。

4 結(jié)語

研究生物分子間互作，對于明確生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，生物分子的結(jié)構(gòu)與功能等方面尤為重要。但如何證明兩個生物分子結(jié)合一直是生物學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)，一般需要用多個實(shí)驗(yàn)共同驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性、可靠性。MST技術(shù)的出現(xiàn)為研究生物分子間互作提供了一個新的方法。目前，MST與pull-down、液閃實(shí)驗(yàn)等技術(shù)相結(jié)合，豐富了研究生物分子間互作的檢測方法，提高了檢測效率。除了上述提到的優(yōu)勢外，MST還具有儀器維護(hù)及運(yùn)行費(fèi)用較低，儀器體積小等優(yōu)點(diǎn)。但目前，MST的應(yīng)用還有一定的局限性，其一、儀器價格昂貴；其二、不能直接確定結(jié)合的具體位點(diǎn)，只能通過使用該生物分子的突變體等方法加以確定。MST技術(shù)通過進(jìn)一步的發(fā)展，一定會在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、小分子配體篩選、分子靶向治療、醫(yī)藥研發(fā)等研究領(lǐng)域中發(fā)揮越來越大的作用。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Principle and Application of Microscale Thermophoresis in Studies of Biomolecular Interactions

Ai Qiushi1，2，3Cao Xiangyu1，3Zhao Qian1，3Niu Yali1，3，4Song Shuishan1，3
（1. Biology Institute，Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081；2. College of Life Sciences，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001；3. Hebei Engineering and Technology Center of Microbiological Control on Main Crop Disease，Shijiazhuang 050081；4. College of Chemistry and Engineering，Hebei University of Technology，Tianjin 300130）

Microscale Thermophoresis（MST）is a new technique to study biomolecular interactions in recent years. It is based on thermophoresis， i.e.， the directional movements of molecules in a temperature gradient， which results in subsequent changes of molecular properties such as sizes， charges， hydration shell and conformation. MST combines the precise fluorescence detection and sensitive thermophoresis and provides a sensitive， fast and precise detection technique to analyze biomolecular interactions. Wor king principle， detection process and application of MST in biology researches are reviewed here.

microscale thermophoresis；interaction analysis；binding studies；biomolecular interaction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.010

2014-08-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270880）

艾秋實(shí)，男，碩士研究生，研究方向：植物抗逆機(jī)理；E-mail：yingyangtt@163.com

宋水山，男，博士，研究員，研究方向：細(xì)胞信號傳導(dǎo)；E-mail：shuishans@hotmail.com