郭啟雷，史海良，趙麗，楊紅梅，王浩

（國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，北京100094）

加壓毛細(xì)管電色譜測定乳及乳制品中三聚氰胺

郭啟雷，史海良，趙麗，楊紅梅，王浩

（國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，北京100094）

研究建立利用加壓毛細(xì)管電色譜（pCEC）測定乳及乳制品中三聚氰胺的分析方法。樣品采用2%三氯乙酸水溶液超聲提取，陽離子固相萃取柱（MCX）凈化，提取液經(jīng)C18反相毛細(xì)管電色譜柱分離，流動相乙腈-10 mmol/L辛烷磺酸鈉溶液（pH 3.0）=15+85，泵流速0.05 mL/min，分離電壓-2 kV，紫外檢測器240 nm檢測。該方法在1.0 mg/kg～100 mg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999），在牛奶和酸奶中的定量限為2.5 mg/kg，在奶粉中的定量限為10 mg/kg，加標(biāo)回收率為78.9%～93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。

加壓毛細(xì)管電色譜；乳及乳制品；三聚氰胺

目前檢測三聚氰胺的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[1-2]、高效液相色譜法（HPLC）[3-4]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[5-6]等。其中GC-MS法樣品需要衍生化，操作比較復(fù)雜；HPLC法是目前最常用的分析方法；HPLC-MS/MS靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，但儀器購置、維護(hù)成本較高。毛細(xì)管電色譜（Capillary Electro-Chromatography，CEC）是將毛細(xì)管柱內(nèi)填充或鍵合固定相，以電滲流為驅(qū)動力，結(jié)合了微徑高效液相色譜與毛細(xì)管電泳兩者的特點，具有高柱效、快速分離、高選擇性、高精度以及試劑和樣品用量少等優(yōu)點，但單純的CEC模式易產(chǎn)生氣泡、干柱等問題[7]。而加壓毛細(xì)管電色譜（Pressurized Capillary Electro-Chromatography，pCEC）通過微型液相色譜泵在毛細(xì)管電色譜柱一端施加壓力，壓力的引入使CEC分離過程受pH和緩沖液的限制相對減少，可有效地解決CEC的氣泡問題，且能實現(xiàn)梯度洗脫；用電滲流和泵壓同時驅(qū)動流動相，溶質(zhì)依據(jù)它們在流動相與固定相中分配系數(shù)的不同和自身電泳淌度的差異得到分離，對復(fù)雜樣品顯示出極大的分離能力[7]。pCEC技術(shù)近年來開始應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域[8-10]，本研究建立了應(yīng)用pCEC分析乳及乳制品中三聚氰胺的新方法，與HPLC1mL/min的流速以及UPLC、LC-MS/MS采用的0.2 mL/min流速相比，pCEC采用0.05 mL/min的流速極大地減少了有機(jī)溶劑的使用，經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。在定性方面，pCEC可以通過施加不同的電壓進(jìn)一步判斷樣品中是否含有三聚氰胺，在不采用LC-MS/MS等昂貴儀器設(shè)備的情況下，同樣可以增加定性的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈：美國Thermo Fisher公司，色譜純；冰乙酸、氨水：北京化工廠，分析純；辛烷磺酸鈉：天津市津科精細(xì)化工研究所，分析純；三氯乙酸：北京市興津化工廠；三聚氰胺：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；Oasis MCX（60 mg，3 mL）：美國waters公司。

加壓毛細(xì)管電色譜儀：TriSepTM-2100（Unimicro Technologies，Inc.，Pleasanton，CA，USA），包括2臺高壓輸液泵、±30 kV高壓電源、微流控制系統(tǒng)、紫外檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Milli-Q純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；電子天平、感量0.000 1 g、0.01 g：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HY-5回旋振蕩器：國華電器有限公司；超聲波清洗器KQ5200：昆山市超聲儀器有限公司；氮吹儀：美國Organomation association Inc.公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 pCEC條件

毛細(xì)管電色譜柱EP-100-20/45-3-C18（蘇州環(huán)球色譜有限公司），內(nèi)徑100 μm，有效柱長20 cm，總長45 cm，填料為粒徑3 μm ODS，流動相：乙腈-10 mmol/L辛烷磺酸鈉溶液（冰乙酸調(diào)節(jié)pH 3.0）=15+85，流速：0.05 mL/min，檢測波長240 nm，電壓-2 kV。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g（精確至0.000 1 g）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。然后用水逐級稀釋成1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)加壓毛細(xì)管電色譜儀測定，峰面積對濃度作圖。

1.2.3 樣品處理

稱取牛奶、酸奶樣品10 g（精確至0.01 g）于25 mL比色管中，加入2%三氯乙酸水溶液至刻度，渦旋混勻后，超聲提取20 min，提取液經(jīng)濾紙過濾，待凈化。

稱取奶粉樣品2.5 g（精確至0.01 g）于50 mL比色管中，加入10 mL水，渦旋混勻使奶粉充分溶解，加入2%三氯乙酸水溶液定容至25 mL，渦旋混勻后，超聲提取20 min，提取液經(jīng)濾紙過濾，待凈化。

取5 mL上述提取液過MCX小柱（預(yù)先經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化），待提取液全部通過MCX小柱后，依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干，加入6 mL5%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，50℃水浴氮吹至干，用1 mL流動相經(jīng)渦旋、超聲充分溶解，過0.45 μm有機(jī)相濾膜，供pCEC測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相中有機(jī)相條件的優(yōu)化

三聚氰胺的極性較大，需要在流動相中加入離子對試劑來延長保留時間。采用10 mmol/L的辛烷磺酸鈉為離子對試劑，冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0。實驗考察了流動相中有機(jī)相的比例對三聚氰胺色譜分離的影響，如圖1所示。

圖1 流動相中有機(jī)相比例對pCEC分離三聚氰胺的影響Fig.1 Electrochromatograms of melamine with different concentration of organic solvent

隨著流動相中乙腈比例增加，三聚氰胺的保留時間越來越短，分析速度加快，同時色譜峰的峰寬越來越小，綜合考慮色譜分離的周期和實際樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，最后選擇流動相為15%乙腈的實驗條件進(jìn)行色譜分離。

2.2 施加電壓的研究

實驗考察了施加不同的電壓對三聚氰胺色譜行為的影響，見圖2。

從圖2中可以看出，0 kV時，三聚氰胺在色譜柱上保留時間較長，峰面積較小，檢測靈敏度較低；隨著負(fù)電壓的增加，電滲流、電泳的方向與泵壓方向相同，保留時間減小。綜合考慮分離度和分析時間，選擇-2 kV為分析條件。對于陽性樣品，可以通過改變電壓，觀察樣品峰與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時間符合程度來進(jìn)一步判斷樣品中是否含有三聚氰胺，相較普通液相色譜來說，增加了定性的準(zhǔn)確性。

2.3 提取條件的選擇

GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》采用1%三氯乙酸溶液加少量乙腈的方法來提取三聚氰胺，在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，該方法對于部分配方奶粉處理效果不好。本課題改用2%三氯乙酸水溶液提取，提高了三氯乙酸的濃度，蛋白沉淀效果明顯改善，用該方法對上述不易處理的配方奶粉樣品進(jìn)行提取，均取得了良好的結(jié)果。提取液經(jīng)MCX陽離子固相萃取柱凈化，供pCEC測定。圖3～圖5比較了乳制品經(jīng)MCX凈化前后的色譜圖，以及加標(biāo)的色譜圖。被分析樣品的各個組分受到泵壓、電壓和電滲流等3個驅(qū)動力的綜合作用，在3個驅(qū)動力的綜合作用下，三聚氰胺與食品的基質(zhì)成分得到了很好分離，從圖中可以看出，本試驗建立的儀器條件和前處理方法對三聚氰胺的測定沒有干擾，確保了定性、定量的準(zhǔn)確性。

圖2 三聚氰胺在不同電壓下的pCEC色譜圖Fig.2 Electrochromatograms of melamine with different voltage

圖3 牛奶基質(zhì)在不同凈化條件的pCEC比較Fig.3 Electrochromatograms of melamine in milk with different pretreatment.1-melamine

圖4 酸奶基質(zhì)在不同凈化條件的pCEC比較Fig.4 Electrochromatograms of melamine in yoghourt with different pretreatment.1-melamine

圖5 奶粉基質(zhì)在不同凈化條件的pCEC比較Fig.5 Electrochromatograms of melamine in milk powder with different pretreatment.1-melamine

2.4 檢出限、線性范圍和回收率

在空白樣品中添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照上述實驗方法進(jìn)行處理，用pCEC測定，以10倍信噪比計算本方法在牛奶和酸奶中的定量限為2.5 mg/kg，在奶粉中的定量限為10 mg/kg。按照1.2.2制備系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按濃度由低到高依次經(jīng)加壓毛細(xì)管電色譜儀測定，峰面積對濃度作圖，得到三聚氰胺的線性方程A=103.5C+9.82，r2=0.999，線性范圍1.0 mg/kg～100 mg/kg。

采用經(jīng)測定不含有三聚氰胺的3種樣品，進(jìn)行添加回收和精密度實驗，加標(biāo)濃度為20、50、100 mg/kg，按本文實驗方法進(jìn)行處理，用pCEC進(jìn)樣測定。平均添加回收率（每個添加濃度平行測定5次）為78.9%～93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，結(jié)果見表1。

表1 3種樣品中三聚氰胺的回收率和精密度Table 1 Recovery and precision of melamine

采用本方法對市場上的30例乳及乳制品樣品進(jìn)行檢測，均未發(fā)現(xiàn)陽性樣品，表明目前對三聚氰胺的違法添加得到了有效控制。

3 結(jié)論

本文以非食用物質(zhì)三聚氰胺為研究對象，選取牛奶、酸奶、奶粉等食品基質(zhì)，樣品采用三氯乙酸水溶液超聲提取，提取液經(jīng)陽離子固相萃取柱凈化，采用反相毛細(xì)管電色譜柱分離，泵流速0.05 mL/min，分離電壓-2 kV，流動相乙腈-10 mmol/L（15+85，v/v）等度洗脫。該方法在1.0 mg/kg～100 mg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（R2=0.999），在牛奶和酸奶中的定量限為2.5 mg/kg，在奶粉中的定量限為10 mg/kg，加標(biāo)回收率為78.9%～93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。pCEC采用0.05 mL/min的流速極大地減少了有機(jī)溶劑的使用，經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。另外，相較普通高效液相色譜來說，pCEC可以通過施加不同的電壓進(jìn)一步判斷樣品中是否含有三聚氰胺，在不采用質(zhì)譜等昂貴儀器設(shè)備的情況下，同樣可以增加定性的準(zhǔn)確性，為乳及乳制品中三聚氰胺的檢測提供了新的技術(shù)手段。

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Determination of Melamine in Milk and Dairy Product by Pressurized Capillary Electro-Chromatography

GUO Qi-lei，SHI Hai-liang，ZHAO Li，YANG Hong-mei，WANG Hao
（National Food Quality&Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

An effective and convenient method for determination of melamine in milk and dairy product was developed.Pressurized capillary electro-chromatography （pCEC）was used as separation technology.The samples were extracted by ultrasonic with 2%trichloroacetic acid solution，cleaned up by mixed cation exchange solid phase extraction （MCX SPE）.The separation was performed on a reversed phase C18 column with 240 nm as the UV detection wavelength.The mobile phase was composed of acetonitrile and sodium octanesulfonate solution（15∶85，v/v，pH3.0），at a pump flow rate of 0.05 mL/min and separation voltage of -2 kV.Under the optimal conditions，the linear range of melamine was 1.0 mg/kg-100 mg/kg with correlation coefficient higher than 0.999.The LOQ was 2.5 mg/kg in milk and yoghurt，and 10 mg/kg in milk powder.The recoveries were 78.9%-93.5%and the relative standard deviations（RSD）were less than 5%.

pressurized capillary electro-chromatography（pCEC）；milk and dairy product；melamine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.021

北京市科技計劃項目（Z111100056811006）

郭啟雷（1979—），男（漢），研究員，博士，研究方向：食品安全。

2014-04-03