陳曉艷+齊恩芳+賈小霞+張武

摘 要 馬鈴薯是無(wú)性繁殖作物，常因病毒侵染而造成病毒在植株體內(nèi)累積，造成種性退化，品質(zhì)和產(chǎn)量下降。基于此，講述了馬鈴薯的幾種常見(jiàn)病毒病，并對(duì)常用的病毒檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。為保證馬鈴薯種薯質(zhì)量，促進(jìn)馬鈴薯主糧化、優(yōu)化農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)提供技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯;病毒檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1673-890X（2015）27--04

馬鈴薯具有分布范圍廣、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高和用途廣泛等特點(diǎn)，是全球公認(rèn)的全營(yíng)養(yǎng)食物。隨著我國(guó)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的啟動(dòng)，對(duì)保障國(guó)家糧食安全、順應(yīng)國(guó)人營(yíng)養(yǎng)需求、緩解資源環(huán)境壓力，有著其他作物不可替代的作用。但馬鈴薯在生長(zhǎng)期間易受多種病毒病侵染造成病毒性退化，使馬鈴薯的品質(zhì)和產(chǎn)量受到影響，造成的損失巨大。現(xiàn)已研究出的侵染馬鈴薯的病毒有40多種[1]，危害我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的主要病毒有馬鈴薯PVX、PVS、PVY、PVA、PVM、PLRV和PSTV[2，3]。這些病毒嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量及品質(zhì)。因此，馬鈴薯病毒的研究也成為各國(guó)研究的重點(diǎn)，馬鈴薯病毒的檢測(cè)成為馬鈴薯種薯繁育中的重大難題。

1 影響馬鈴薯的主要病毒類(lèi)型

1.1 馬鈴薯X病毒（Potato Virus X，PVX）

馬鈴薯X病毒為害癥狀因品種、病毒株系以及環(huán)境條件的不同，有些株系在冷涼條件下，葉片出現(xiàn)輕微花葉，繼而發(fā)展成為褪綠斑、壞死性條斑，有的上部葉畸形，葉緣呈鋸齒等癥狀;晴朗天氣，明脈、輕微花葉癥狀可減輕，甚至完全消失;有些株系，在高溫條件下不表現(xiàn)癥狀，呈隱癥現(xiàn)象。PVX是由一條正鏈RNA組成的線(xiàn)性病毒，RNA 3，末端是多聚腺嘌呤核苷酸，5，末端有m7GppG“帽子”結(jié)構(gòu)[4]。PVX單獨(dú)侵染馬鈴薯可減產(chǎn)15%左右，PVX可與多種病毒復(fù)合侵染，嚴(yán)重時(shí)造成馬鈴薯絕收。

1.2 馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）

馬鈴薯Y病毒?。≒VY）的田間癥狀復(fù)雜多變，不同的病毒株系引致的癥狀差異較大，初期出現(xiàn)明脈癥狀，后形成系統(tǒng)斑駁，葉脈兩側(cè)組織呈綠色帶狀斑，葉片基部癥狀較為明顯，病葉側(cè)脈呈灰褐色壞死，表現(xiàn)脈和莖的變褐壞死。PVY病毒粒子為彎曲線(xiàn)狀，RNA的5端為VPg，3端為Poly（A）[5]。依據(jù)基因序列和基因組學(xué)，PVY 分為PVYO、PVYN，PVYC及一系列PVYO/PVYN 重組型如PVYNTN和PVYN：O[6]。馬鈴薯侵染PVY后，通常減產(chǎn)越50%，當(dāng)它與PVX或PVA病毒混合感染時(shí)，會(huì)造成馬鈴薯產(chǎn)生非常嚴(yán)重的皺縮花葉癥狀，植株短小，減產(chǎn)可達(dá)80%[7]。

1.3 馬鈴薯S病毒（Potato Virus S，PVS）

許多馬鈴薯品種都帶PVS，很多時(shí)候無(wú)病癥，卻出現(xiàn)明顯的花葉和壞死斑點(diǎn)，最初中上部葉片的葉脈間出現(xiàn)褪綠小斑點(diǎn)，周邊擴(kuò)大后，呈花葉癥狀，褪綠部出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)，葉面呈波狀，生長(zhǎng)后期，中、下位葉片表面變?yōu)榍嚆~色。PVS存在著2個(gè)株系（PVSO和PVSA），PVS病毒還存在著對(duì)氣候差異產(chǎn)生適應(yīng)性變異[8]。一般PVS單獨(dú)侵染時(shí)沒(méi)有明顯的癥狀，導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)10%～20%[9]。在大田PVS通常和其他病毒混雜感染，減產(chǎn)20%～30%[10]。

1.4 馬鈴薯卷葉病毒（Potato Leaf Roll Virus，PLRV）

植株感馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）病后，由下葉開(kāi)始葉緣上卷，嚴(yán)重的呈管狀，卷葉波及到上部葉片，導(dǎo)致株高矮縮，葉色黃變，病株葡匐莖短，生成許多小型塊莖。PLRV靠蚜蟲(chóng)以時(shí)間長(zhǎng)、循環(huán)繁殖方式傳播，在寄主植株體內(nèi)主要局限在維管束內(nèi)[11]。由于韌皮部破壞，在莖橫切面可觀察到黑點(diǎn)，莖節(jié)部和基部尤為突出，塊莖組織則出現(xiàn)導(dǎo)管區(qū)網(wǎng)狀壞死斑紋，導(dǎo)致馬鈴薯品質(zhì)嚴(yán)重受損。PLRV是單鏈正義RNA病毒，屬黃化病毒組[12，13]。可造成馬鈴薯減產(chǎn)30%以上。

1.5 馬鈴薯A病毒（Potato Virus A，PVA）

馬鈴薯A病毒（PVA）是侵染馬鈴薯的主要病毒之一，其具有絲狀的病毒粒子，長(zhǎng)730nm左右，直徑約15 nm。1914年，第一次出現(xiàn)了有關(guān)馬鈴薯A病毒病的病害癥狀的報(bào)道，正式命名直到1932年[14，15]。PVA通過(guò)汁液機(jī)械摩擦接種。薯塊可持久帶毒。依據(jù)不同種類(lèi)和不同種植地區(qū)，侵染該病毒的馬鈴薯病葉將出現(xiàn)藥葉、葉面粗糙、邊緣波浪狀或不顯癥，一部分敏感的品種表現(xiàn)出頂端壞死。該病毒通常與PVY、PVX、PVM病毒混合侵，為皺縮狀，減產(chǎn)嚴(yán)重。

1.6 馬鈴薯皺縮花葉病毒（Potato Virus M，PVM）

馬鈴薯M病毒（PVM）有正單鏈RNA，發(fā)生在全國(guó)各地[16]。田間一般經(jīng)機(jī)械和蚜蟲(chóng)傳播，常表現(xiàn)為葉片皺縮，全株矮化，還伴有葉脈透明，通常減產(chǎn)9%～49%。馬鈴薯M病毒主要借助于汁液摩擦傳毒。高海拔、低溫、晝夜溫差大的生態(tài)環(huán)境對(duì)病毒的繁殖有抑制作用。

1.7 馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒（Potato Spindle Tuber Viroid，PSTV）

馬鈴薯紡錘塊莖病毒（PSTV）是影響我國(guó)北方馬鈴薯生產(chǎn)的嚴(yán)重病害之一。該病毒能影響塊莖的形狀，還能降低結(jié)薯的數(shù)量和大小。PSTV是一個(gè)非常小的單鏈RNA分子，只有核酸，無(wú)衣殼蛋白，有病原性的RNA，呈環(huán)狀。感病植株莖和花梗細(xì)長(zhǎng)、上舉，或小葉變小，緣呈波狀，并向上卷曲，小葉扭曲，葉脈壞死和嚴(yán)重束頂。感病植株的塊莖變長(zhǎng)，某些品種還會(huì)出現(xiàn)尖頭，病薯上的芽眼增多，凹陷，有較重的芽眉，也可能呈類(lèi)似的紡錘塊莖狀。其通常會(huì)造成馬鈴薯減產(chǎn)20%～60%。PSTV很容易通過(guò)種薯（苗）、花粉、種子、機(jī)械摩擦或昆蟲(chóng)等多種途徑傳播[17]。

2 馬鈴薯病毒檢測(cè)的方法

目前，主要運(yùn)用莖尖脫毒繁育脫毒種薯來(lái)防治馬鈴薯病毒病，在脫毒種薯的繁殖過(guò)程中，保證種薯質(zhì)量的關(guān)鍵是對(duì)病毒進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。現(xiàn)階段，馬鈴薯病毒檢測(cè)的方法有指示植物法、酶聯(lián)免疫吸附法、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。

2.1 指示植物法

1929年，美國(guó)的病毒學(xué)家Holmes首先發(fā)現(xiàn)了指示植物檢測(cè)法[18]。其原理是對(duì)馬鈴薯上的某個(gè)病毒反應(yīng)敏感，只要被侵染，指示植物可以超速的表現(xiàn)出明顯癥狀。該方法簡(jiǎn)便可行，對(duì)儀器、藥品、深?yuàn)W的理論知識(shí)要求低，空間足夠大、隔離條件良好、癥狀觀察經(jīng)驗(yàn)豐富遍可操作，一般的研究單位、種薯生產(chǎn)公司均可掌握。但指示植物的培育需要占用很大空間、消耗很長(zhǎng)時(shí)間，且靈敏度不高，這對(duì)于大批生產(chǎn)馬鈴薯試管苗的檢測(cè)不適用。

此方法已在PVS、PVY、PVX等病毒株系的檢測(cè)上廣泛運(yùn)用，且用于分子生物學(xué)或血清學(xué)檢測(cè)之前的初步鑒定[19]。吳凌娟[20]等在2003年用多種指示植物分離鑒定PVX，結(jié)果說(shuō)明千日紅是一種不錯(cuò)的鑒定指示植物。常用的馬鈴薯病毒的指示植物及癥狀見(jiàn)表1。

2.2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction，RT-PCR）

PCR是體外擴(kuò)增DNA的一種技術(shù)，絕大部分植物病毒是RNA病毒，需要將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA然后PCR擴(kuò)增，該方法是RT-PCR[21]。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于PMTV、PLRV、PVA等的檢測(cè)[22]。關(guān)翠萍[23]用一步RT-PCR法檢測(cè)出馬鈴薯中的PVY、PVX和PLRV，證明了該方法比兩步RT-PCR靈敏度高約100倍。Mumford[24]等用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測(cè)了馬鈴薯PMTV、TRV，說(shuō)明與常規(guī)RT-PCR檢測(cè)比靈敏度分別提高了100和10 000倍左右。

現(xiàn)在檢測(cè)馬鈴薯病毒用免疫試紙條法加RT-PCR法，先用試紙條免疫捕獲目標(biāo)病毒，再取下試紙條上出現(xiàn)的檢測(cè)條帶作為模板直接進(jìn)行RT-PCR，不僅省去了常規(guī)RT-PCR提取總RNA的繁瑣步驟，而且可以放大核酸信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度[25]。此項(xiàng)技術(shù)已在馬鈴薯PVX、PVY、PVS快速檢測(cè)上得到應(yīng)用。但同時(shí)，RT-PCR檢測(cè)技術(shù)也存在些許問(wèn)題，表2對(duì)RT-PCR中一些常見(jiàn)問(wèn)題和解決方案進(jìn)行了總結(jié)。

2.3 酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（Enzyme-linked Immune Sorbent Assay，ELISA）

ELISA（Enzyme-Linked Immune Sorbent Assay）技術(shù)是荷蘭學(xué)者Van Weeman、Schurrs和瑞典學(xué)者Engvall、Perman在20世紀(jì)70年代幾乎同時(shí)提出的[26-27]。ELISA的基本原理見(jiàn)圖1。

圖1 ELISA的基本原理

酶聯(lián)免疫檢測(cè)法具有高度的特異性;因酶在其與底物的反應(yīng)中不被消耗，表現(xiàn)出高度的靈敏性;酶標(biāo)記的試劑制備容易，結(jié)合物穩(wěn)定，而且有效期長(zhǎng);國(guó)際上許多權(quán)威機(jī)構(gòu)將其列為優(yōu)先發(fā)展的分析技術(shù)之一[28-30]。但諸多因素均影響其取得成功，如材料的選擇、操作步驟的嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，只要有一個(gè)因素改變即可能會(huì)造成其他條件的改變，最終導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性不夠，并且仍然存在不易檢測(cè)含量極少的韌皮部病毒等缺陷。現(xiàn)階段，檢測(cè)食品中所含農(nóng)藥的殘留，國(guó)內(nèi)外有不少都用酶免疫技術(shù)。還有將其應(yīng)用在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和食品檢驗(yàn)學(xué)中的報(bào)道也很多。如吳凌娟[31]等將直接酶聯(lián)免疫吸附法和間接酶聯(lián)檢測(cè)法做了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果說(shuō)明間接酶聯(lián)檢測(cè)法檢測(cè)病毒的靈敏度較直接酶聯(lián)免疫吸附法高。張仲凱[32]等在2003年用TAS-ELISA檢測(cè)馬鈴薯脫毒苗，并對(duì)幾種檢測(cè)方法進(jìn)行比較，比較得出TAS-ELISA的靈敏度遠(yuǎn)高于DAS-ELISA。

3 結(jié)論

本文介紹了幾種常見(jiàn)馬鈴薯的病毒病，歸納總結(jié)了馬鈴薯病毒檢測(cè)的常用方法，每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，馬鈴薯是宜糧、宜菜、宜飼、宜做工業(yè)原料的多種用途經(jīng)濟(jì)作物，其退化的原因是病毒侵染，所以，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的病毒檢測(cè)方法，增大對(duì)種薯的檢測(cè)強(qiáng)度，從源頭上控制種薯質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)脫毒種薯的最全脫毒，是防治病毒侵染、提高產(chǎn)量的主要選擇?，F(xiàn)在防治馬鈴薯病毒病的發(fā)生主要是通過(guò)馬鈴薯病毒檢測(cè)，因此馬鈴薯病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確和成本對(duì)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有深刻的影響。馬鈴薯脫毒種薯繁育中應(yīng)采用操作較為簡(jiǎn)單的TAS-ELISA技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯病毒，有條件的單位可以采用TAS-ELISA和RT-PCR技術(shù)結(jié)合的方法檢測(cè)馬鈴薯病毒，科研單位應(yīng)積極研究免疫試紙條結(jié)合RT-PCR法快速檢測(cè)馬鈴薯病毒新方法，提高檢測(cè)靈敏度，降低馬鈴薯病毒檢測(cè)的費(fèi)用。因此，病毒檢測(cè)技術(shù)還須向著降低成本與高靈敏度的方向發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1]Gramm，Atkakig，Avgelis A.Behavior of Potato Gane Toclonal Plants Against the Necrotic Strain of Potato Virus[J].Russian Journal of Plant Physiology，2007，54（4）：507-512.

[2]E.Asseheman，H.Brinkman C，Bus B，et al. Potato Diseases[M].DenHaag Netherland：NIVKA，1996.

[3]李明福.馬鈴薯病毒及其檢疫重要性初析[J].植物檢疫，1997，11（5）：261-264.

[4]Hooker WJ.馬鈴薯病害及其防治[M].石家莊：河北科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[5]魯瑞芳，呂鵬飛.馬鈴薯Y病毒NIb復(fù)制酶基因在轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)的相對(duì)廣譜抗病性[J].病毒學(xué)報(bào)，2000，2（1）：15.

[6]胡新喜，何長(zhǎng)征，熊興耀，等.馬鈴薯Y病毒研究進(jìn)展[J].中國(guó)馬鈴薯，2009，23（5）：293-298.

[7]孫慧生.馬鈴薯PVY病毒的載體構(gòu)建與干涉效果測(cè)定[J].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003，22（5）：191.

[8]郎秋蕾，陳集雙，傅天珍，等.馬鈴薯S病毒的分子鑒定與檢測(cè)[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007，37（2）：217-220.

[9]李濟(jì)宸，唐玉華，譚宗九，等.馬鈴薯病害及其防治[M].石家莊：河北科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[10]吳麗萍，王蒂，王化俊，等.馬鈴薯S病毒的RT-PCR檢測(cè)[J].中國(guó)馬鈴薯，2006，20（4）：3-4.

[11]張鶴齡.馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）基因組研究進(jìn)展[J].中國(guó)病毒學(xué)，1996，11（1）：1-8.

[12]Robert R，Martin Paul K，Keese， et al. Evolution and Molecular Biology of Luteo Viruses[J].Phytopathology，1990（28）：341-363.

[13]Murphy FA，F(xiàn)auquet CM，Bishop DHL，et al. Virus Taxonomy Classification and Nomenclature[J].Archives of Virology，1995（10）：187-192.

[14]Orton W A. Potato wilt leaf-roll and Related Diseases[J].USD ep Agric Bull，1914（64）：1-46.

[15]Murphy PA，McKay R.A Comparison of Some European and American Virus Diseases of Photo[J].Roy Dublin Soc Sci Proc，1932（20）：347-358.

[16]范國(guó)權(quán)，白艷菊，高艷玲，等.馬鈴薯M病毒提純技術(shù)及抗血清制備[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2010，37（5）：479-480.

[17]馮光惠，杜虎平，李夏隆，等.榆林地區(qū)馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒的RT-PCR檢測(cè)與序列分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（10）：1047-1050.

[18]Holmes FO. Local Lesions in Tobacco Mosaic[J].Bot Gaz，1929（87）：39-68.

[19]徐潔.指示植物鑒定馬鈴薯病毒技術(shù)的研究與應(yīng)用[J].中國(guó)馬鈴薯，2002，16（2）：73-74.

[20]吳凌娟，張雅奎，董傳民，等.用指示植物分離鑒定馬鈴薯輕花葉病毒（PVX）的技術(shù)[J].中國(guó)馬鈴薯，2003，l7（2）：82-83.

[21]毛彥芝.馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)的研究概況[J].中國(guó)蔬菜，2009（12）：1-6.

[22]李浚明，朱登云.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2005.

[23]關(guān)翠萍，張鶴齡，門(mén)福義，等.馬鈴薯病毒一步法RT-PCR診斷研究[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，3（2）：178-185.

[24]Mumford R A，Walsh K，BarkerI， et al. Detection of Potato Mop Top Virus and Tobacco Rattle Virus Using a Multiplex Real-time Fluorescent Reverse-transcription Polymerase Chain Reaction Assay[J].Phytopathology，2000，90（5）：448-453.

[25]朱云芬，程群，沈艷芬，等.免疫試紙條結(jié)合RT-PCR法快速檢測(cè)馬鈴薯Y病毒[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（5）：1056-1057，1062.

[26]Van Weemen. Immunoassay Using Antcgenenzyme conjugates[J].FEBS Letters，1971（15）：232-235.

[27]Engvall E. Enzyme-linked immune sorbent assay （ELISA）.Quantitative assay of immunoglobulin G[J].Immune chemistry，1987（8）：871-874.

[28]VANDERLANN M. Mmunoassays for Trace Chemical Analysis Monitoring Toxic Chemical in Humans Food and the Environment[J].ACSW ashington DC，1991（6）：2-10.

[29]CONAWAY JE. New Trend in Analytical Technology and Methods for Pesticide Residue Analysis[J].JAOAC Int，1991，74（5）：715-716.

[30]周新民，陳連頤，王捍東，等.SMD殘留檢測(cè)的ELISA方法的建立和初步應(yīng)用[J].畜牧與獸醫(yī)，2003，35（10）：8-11.

[31]吳凌娟，張雅奎，董傳民，等.馬鈴薯普通花葉病毒（PVX）抗血清的制備和不同酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法的對(duì)比試驗(yàn)[J].中國(guó)馬鈴薯，2001，15（4）：219- 221.

[32]張仲凱，丁銘，方琦，等.云南馬鈴薯病毒種類(lèi)及脫病毒種苗篩選技術(shù)體系[J].云南農(nóng)業(yè)科技，2003（5）：121-130.

（責(zé)任編輯：趙中正）