王樂(lè) 宇光海 楊碩曄 王為為 惠明

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

一株丁二酸高產(chǎn)菌株的篩選與選育

王樂(lè) 宇光海 楊碩曄 王為為 惠明

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

旨在提高丁二酸發(fā)酵生產(chǎn)水平，通過(guò)初篩、復(fù)篩從土壤中分離得到了高產(chǎn)丁二酸菌株，發(fā)酵結(jié)束后利用高效液相色譜法檢測(cè)丁二酸的產(chǎn)率為34.45%。對(duì)菌株進(jìn)行紫外誘變選育，結(jié)果表明，在底物葡萄糖的濃度為100 g/L時(shí)，丁二酸的產(chǎn)率提高了46%，達(dá)到了50.30%，殘?zhí)堑陀?0 g/L。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化指標(biāo)測(cè)定以及16S rDNA序列分析等，鑒定該菌株為放線(xiàn)桿菌。

丁二酸；高產(chǎn)菌株；篩選；誘變；放線(xiàn)桿菌

近年來(lái)，丁二酸應(yīng)用的領(lǐng)域不斷拓展，國(guó)際市場(chǎng)的需求量也迅猛增加［1］。工業(yè)上生產(chǎn)丁二酸的方法主要為化學(xué)方法，常見(jiàn)的化學(xué)合成的方法有石蠟氧化法、氯乙酸甲酯的氰化水解法、加氫法等，生產(chǎn)工藝相對(duì)成熟［2，3］。但化學(xué)法生產(chǎn)丁二酸的價(jià)格較高，且會(huì)消耗大量石油等不可再生資源，不利于資源的可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)在生產(chǎn)過(guò)程中還會(huì)造成環(huán)境的污染［4，5］。微生物發(fā)酵法制備丁二酸具備諸多優(yōu)勢(shì)，如由于菌種特性及微生物酶的專(zhuān)一性，丁二酸純度高且產(chǎn)品易分離；生物法生產(chǎn)丁二酸工藝與傳統(tǒng)化學(xué)法相比，生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)化且成本低、生產(chǎn)條件溫和且耗能小、生產(chǎn)工藝安全且對(duì)環(huán)境友好，因此生物法生產(chǎn)丁二酸已成為目前諸多學(xué)者研究的熱點(diǎn)［6］。丁二酸的生物法生產(chǎn)主要有兩種方式，葡萄糖經(jīng)糖酵解轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸后，一方面繼續(xù)以三羧酸循環(huán)順式的方式（丙酮酸→乙酰-CoA→檸檬酸→丁二酸）生成丁二酸，另一方面以三羧酸循環(huán)反式途徑（蘋(píng)果酸→延胡索酸→丁二酸）生成丁二酸［7，8］。其中，丁二酸代謝產(chǎn)生還需要受到CO2、丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶等條件的調(diào)節(jié)［9，10］。目前，能夠產(chǎn)丁二酸的菌種主要有黑曲霉、谷氨酸棒狀桿菌、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌、產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌和重組大腸桿菌等［11］。

研究發(fā)現(xiàn)，放線(xiàn)桿菌l30Z菌株和它的變異株具有1-8 g/L氟乙酸鹽的耐受力，可以生產(chǎn)大量的丁二酸［12］。產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌ATCC55618也是國(guó)內(nèi)丁二酸發(fā)酵研究較多的菌株，研究發(fā)現(xiàn)其丁二酸產(chǎn)量為11.49 g/L，并有乳酸、甲酸和乙酸等副產(chǎn)物的生成［13］。近年來(lái)，研究人員篩選出菌株琥珀酸放線(xiàn)桿菌CGMCC1593，對(duì)其誘變選育后，在5 L發(fā)酵罐上發(fā)酵36 h，丁二酸產(chǎn)量高達(dá)40.51 g/L，同時(shí)伴隨一些副產(chǎn)物［14］。天然的菌種產(chǎn)丁二酸的能力較低，副產(chǎn)物也較多，且對(duì)于底物或產(chǎn)物的耐受性較差，因此利用生物工程技術(shù)手段對(duì)現(xiàn)有的菌種進(jìn)行改造成為該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)［15］。為了降低乳酸、甲酸等副產(chǎn)物的生成，以野生型大腸桿菌w1485為出發(fā)菌株，在染色體中插入抗性基因，構(gòu)建丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）和乳酸脫氫酶（ldhA）基因失活菌株，實(shí)現(xiàn)了丁二酸的高效生產(chǎn)［16，17］。美國(guó)MBI的專(zhuān)利中有丁二酸發(fā)酵的最高產(chǎn)量110 g/L，而產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌是目前丁二酸發(fā)酵最具工業(yè)化潛力的菌株［18］。

丁二酸作為一種優(yōu)秀的化學(xué)平臺(tái)產(chǎn)品，其前景廣闊［19］。生物法生產(chǎn)丁二酸是基于可再生能源（如葡萄糖）和二氧化碳為主要原料，不僅能夠擺脫對(duì)石油化工原料的依賴(lài)性，而且開(kāi)辟了溫室氣體二氧化碳新的利用方式，具有可再生性、成本低廉、綠色無(wú)污染和環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)［9，20］。本研究旨在通過(guò)篩選、分離土壤中生產(chǎn)丁二酸的菌種，以得到一種可以在較為苛刻條件下生長(zhǎng)，且屬于微厭氧菌株，高產(chǎn)丁二酸的菌株，并對(duì)篩選出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行紫外誘變處理，以期有效提高丁二酸的產(chǎn)率和底物葡萄糖的利用能力，為后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行菌種性能和生產(chǎn)工藝的改良，以及代謝控制發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的研究奠定基礎(chǔ)，也為大規(guī)模利用生物法生產(chǎn)丁二酸提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鈣、碳酸鎂、硫酸銨、氯化鎂，均為分析純，購(gòu)于北京化工廠(chǎng)。莫能菌素、富馬酸鈉、溴甲酚綠、瓊脂，均為生化級(jí)，均購(gòu)于Sigma 公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 THZ-312型臺(tái)式恒溫振蕩器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），LDZX-0KBS型立式高溫蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)），SW-CJ-ZF型雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），722N紫外分光光度計(jì)（上海精科科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)A12004B電子天平（上海精科科學(xué)儀器有限公司），TDL-5-A離心機(jī)（上海安亭科技股份有限公司），Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 富集培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，富馬酸鈉5 g，酵母膏5 g，莫能菌素0.1 g，KH2PO43 g，NaCl 1 g，（NH4）2SO41 g，CaCl20.5 g，MgCl20.5 g，MgCO35 g，蒸餾水1 L，121℃滅菌15 min。

分離培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，NaCl 5 g，澳甲酚綠0.1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH6.8-7.2，121℃滅菌15 min。

保藏培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母粉5 g，K2HPO43 g，NaCl 0.1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH7.0，121℃，滅菌15 min。

活化培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH7.2±0.2。121℃，滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母粉5 g，K2HPO43 g，NaCl 0.1 g，CaCl20.5 g，MgCl20.5g，pH7.0，121℃，滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100 g，酵母膏15 g，NaCl 0.5 g，NaHCO315 g，Na2HPO40.5 g，NaH2PO49.6 g，K2HPO45 g，pH7.0，121℃，滅菌15 min。

普通培養(yǎng)條件：接種量為10%，裝液量為100 mL培養(yǎng)基/250 mL搖瓶，培養(yǎng)溫度為37℃，pH值自然，轉(zhuǎn)速150 r/min，搖瓶在滅菌過(guò)程中用紗布封口，接種后在紗布上覆蓋保鮮膜以實(shí)現(xiàn)微氧環(huán)境，發(fā)酵周期72 h。

1.1.4 菌種 土壤樣品采自鄭州市某奶牛場(chǎng)。在鄭州市某奶牛場(chǎng)，采集帶有牛糞土壤和附近土壤共10處，每處各15 g，裝入無(wú)菌袋中。將這10份采集回來(lái)的土壤樣品放置在-20℃冰箱保藏，待用。

1.2 方法

1.2.1 土壤的富集培養(yǎng) 取10份保藏的土壤樣品各3 g，分別放入250 mL搖瓶中含有150 mL的富集培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24 h，之后按照15%的接種量，在同樣的培養(yǎng)條件進(jìn)行轉(zhuǎn)接，共轉(zhuǎn)接3次。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行5 000 r/min離心3 min，棄上清，得到無(wú)菌濕菌體，待用。

1.2.2 純菌種的分離 取土壤富集培養(yǎng)得到的濕菌體，適當(dāng)稀釋后分別涂布于溴甲酚綠變色分離平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)32 h，取溴甲酚綠變色平板上變色菌落，用劃線(xiàn)法接種到保藏培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，得到菌落，再用描點(diǎn)法接種到溴甲酚綠變色平板上，在發(fā)生變色反應(yīng)的位置上得到菌落。重復(fù)上述過(guò)程直至不再出現(xiàn)雜菌。將分離得到單菌落接種于保藏培養(yǎng)基斜面上，保藏，用于菌株的篩選和發(fā)酵。

1.2.3 熒光法初篩檢測(cè) 從斜面上取下少量分離得到的單菌落接入至種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h，結(jié)束后進(jìn)行5 000 r/min離心3 min，得上清發(fā)酵液，作為檢測(cè)樣品。取0.3 mL樣品分別于試管中，加入濃硫酸0.3 mL，然后加入間苯二酚0.6 g后混合，將混合物沸水浴加熱溶解直至有深紅色出現(xiàn)，之后放入冰水混合物中冰浴10 min，然后從反應(yīng)試管的邊緣緩慢加入1 mol/L的NaoH溶液2 mL，震蕩充分至反應(yīng)物溶解，再緩慢加入5 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液，觀(guān)察顏色反應(yīng)，是否出現(xiàn)綠色熒光圈，并判斷熒光圈大小。

1.2.4 葡萄糖含量的測(cè)定 樣品中葡萄糖含量的測(cè)定方法采用DNS法［21］。葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。

圖1 DNS法測(cè)定葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.2.5 高效液相色譜法復(fù)篩 進(jìn)行菌株復(fù)篩的發(fā)酵樣品，其丁二酸含量的測(cè)定采用高效液相色譜法。丁二酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2所示。

圖2 高效液相法測(cè)定丁二酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.2.6 菌體干重測(cè)定 發(fā)酵結(jié)束后取20 mL菌體懸液于稱(chēng)重后的干燥離心管內(nèi)，進(jìn)行5 000 r/min離心5 min，去上清，菌體用無(wú)菌去離子水洗滌，離心，重復(fù)兩遍后得濕菌體，于55℃烘干至恒重后稱(chēng)重。直接稱(chēng)重。

1.2.7 紫外誘變選育 將菌株在保藏培養(yǎng)基平板上活化12 h，接入種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，得到菌體總體處在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌懸液，倒入無(wú)菌平皿中，深度約1.0 cm，菌體數(shù)量約為105個(gè)/mL，借助磁力攪拌器保持平皿中的菌懸液勻質(zhì)。選取260 nm下的紫外光源，紫外燈的功率為15 W，燈源與菌懸液的最近距離為25 cm，進(jìn)行紫外誘變。從打開(kāi)紫外燈后計(jì)時(shí)，紫外線(xiàn)照射時(shí)間為5-120 s。紫外誘變結(jié)束后，將菌懸液均勻涂布在溴甲酚綠變色分離上，于37℃，避光培養(yǎng)2-3 d后得到出現(xiàn)變色反應(yīng)的單菌落，在保藏培養(yǎng)基上延續(xù)傳8代穩(wěn)定后，重復(fù)熒光法初篩檢測(cè)和高效液相法復(fù)篩，篩選經(jīng)過(guò)誘變選育后丁二酸產(chǎn)量最高的優(yōu)勢(shì)菌株，并對(duì)發(fā)酵液中的菌體進(jìn)行鏡檢。

1.2.8 菌株的生理生化試驗(yàn) 將紫外誘變選育得到的高產(chǎn)菌株接種于葡萄糖、木糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖、纖維二糖、棉籽糖、淀粉、蜜二糖、硝酸鹽、尿素、明膠等生化管內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，并進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果判斷其基本特性［22］。

1.2.9 16S rDNA的 PCR擴(kuò)增及其序列分析 利用Oligo6 和Primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，即上游P1：5'-AGAGTTTGATC（A/C）TGG-3'和下游P2：5'-GGACTAC（A/T/C）AGGGTATCTAAT-3'，P1和P2擴(kuò)增出的片段大小約為780 bp。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：10×Taq酶緩沖液 2.5 μL，引物 0.2 μmol/L，200 mmol/L dNTP 2 μL，DNA模板20 ng，Taq酶（TaKaRa）1 U，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，56℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，循環(huán)30次；72℃延伸5 min?；厥盏哪康钠危谀康钠未笮√幊霈F(xiàn)了特異性條帶，且與預(yù)計(jì)的片段大小相符。測(cè)序工作由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 富集培養(yǎng)分離菌株

采用含溴甲酚綠指示劑的瓊脂培養(yǎng)基作為選擇性平板，以稀釋分離純菌落為目的，對(duì)產(chǎn)丁二酸菌株進(jìn)行富集培養(yǎng)。圖3顯示，在溴甲酚綠篩選平板上有一定量的單菌落生成，由于溴甲酚綠在酸性條件下會(huì)顯黃色，因此，此變色菌落為產(chǎn)酸菌落。通過(guò)挑選溴甲酚綠選擇性平板上不同變色菌落，尤其是對(duì)變色反應(yīng)后出現(xiàn)較深色斑的菌株，進(jìn)行選擇性平板重復(fù)篩選，分離選取出優(yōu)勢(shì)菌株X1、X2、X3……Xn，分別進(jìn)行斜面保藏。

圖3 溴甲酚綠篩選平板上的菌落

2.2 熒光法篩選丁二酸生產(chǎn)菌株

熒光法篩選丁二酸生產(chǎn)菌株的結(jié)果（圖4）顯示，丁二酸標(biāo)準(zhǔn)品（1號(hào)）有著明顯的綠色熒光圈，說(shuō)明熒光法對(duì)丁二酸具有良好的顯色分辨效果。2、3、4號(hào)樣品為溴甲酚綠選擇性平板變色的3株優(yōu)勢(shì)菌株X4、X7和X12。通過(guò)對(duì)比可知，3號(hào)（X7）和4號(hào)（X12）樣品比2號(hào)（X4）樣品的熒光顯色結(jié)果更為清晰、明顯，且熒光圈較大。因此將X7和X12菌株分別命名為Y3和Y4，作為利用高效液相法進(jìn)行復(fù)篩的優(yōu)勢(shì)菌株。

圖4 培養(yǎng)液樣品的熒光法初篩

2.3 高效液相色譜法篩選丁二酸生產(chǎn)菌株

丁二酸標(biāo)準(zhǔn)品在高效液相法檢測(cè)時(shí)的峰保留時(shí)間為4.22 min，兩株菌在4.22 min時(shí)都出現(xiàn)有明顯的色譜峰，說(shuō)明Y3和Y4菌株均具有產(chǎn)丁二酸的能力，這也與熒光圈初篩的結(jié)果相一致。高效液相色譜檢測(cè)丁二酸的方法經(jīng)優(yōu)化調(diào)整，條件如下：XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相25 mmol/L K2HPO4，pH2.8（H3PO4調(diào)節(jié)）；流速0.8 mL/min；紫外檢測(cè)器，210 nm；進(jìn)樣量，20 μL；柱溫，室溫。通過(guò)對(duì)比兩株菌的高效液相色譜（圖5和圖6）表明，Y3菌株在底物葡萄糖濃度為100 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，丁二酸的產(chǎn)率為34.45 g/L，利用DNS法測(cè)得的殘留葡萄糖濃度為15.3 g/L。Y4菌株在底物葡萄糖濃度為100 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，丁二酸產(chǎn)率為12.78 g/L，殘留葡萄糖濃度為19.0 g/L。相對(duì)于Y4菌株，Y3菌株的發(fā)酵樣品中丁二酸產(chǎn)量較高，且副產(chǎn)物較少，優(yōu)勢(shì)明顯。Y4菌株的發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的能力一般，且有一些副產(chǎn)物的生成，可能是該菌株不僅生產(chǎn)出丁二酸還產(chǎn)出了如乳酸、甲酸等副產(chǎn)物，在一定程度上削弱了丁二酸代謝途徑，降低了丁二酸的產(chǎn)量。因此，將利用高效液相復(fù)篩法得到的優(yōu)勢(shì)菌株Y3命名為G3。對(duì)G3進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變選育處理，以進(jìn)一步提高該菌株的丁二酸發(fā)酵水平。

2.4 紫外線(xiàn)誘變

對(duì)G3進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變選育處理的致死率曲線(xiàn)（圖7）顯示，最佳的致死率時(shí)間為50-60 s，因此選擇紫外照射的時(shí)間為60 s，采用平皿法，于30℃，避光培養(yǎng)2-3 d后，得到單菌落，在富集培養(yǎng)基上延續(xù)傳8代穩(wěn)定后，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，并利用高效液相法進(jìn)行丁二酸產(chǎn)量的檢測(cè)，發(fā)酵菌體進(jìn)行顯微鏡鏡檢。

圖5 Y3菌株發(fā)酵液的高效液相色譜圖

圖6 Y4菌株發(fā)酵液的高效液相色譜圖

圖7 紫外線(xiàn)誘變菌體致死率曲線(xiàn)

紫外照射60 s的6株誘變選育結(jié)果與復(fù)篩優(yōu)勢(shì)菌株G3（空白對(duì)比）的結(jié)果（圖8）顯示，經(jīng)過(guò)紫外誘變60 s后的1號(hào)菌株的丁二酸發(fā)酵結(jié)果有了明顯提高，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后丁二酸產(chǎn)量最高，為50.3 g/L，相比于初始菌株的丁二酸產(chǎn)量34.5 g/L，提升了46%。1號(hào)誘變菌株的細(xì)胞干重為12.8 g/L，相比于初始菌株的細(xì)胞干重11.5 g/L，提高了11.2%。因此，將紫外誘變處理后丁二酸產(chǎn)量最高的1號(hào)菌株命名為Z1。

圖8 紫外誘變60 s后的選育結(jié)果

2.5 Z1菌株的生理生化試驗(yàn)及分子鑒定結(jié)果

2.5.1 形態(tài)學(xué)特征及生理生化指標(biāo)測(cè)定 優(yōu)勢(shì)誘變菌株Z1，在保藏培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3 d后形成直徑約1 mm的菌落，菌落呈圓形凸起，表面光滑，不透明，邊緣整齊，淡黃色。在顯微鏡下觀(guān)察菌體大?。?.4-0.6 μm×1.0-3.5 μm），以桿形為主，無(wú)莢膜和動(dòng)力。采用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)液均勻混濁，底部有菌體沉淀，經(jīng)革蘭氏染色呈現(xiàn)陰性。Z1菌株能夠利用葡萄糖、木糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖、纖維二糖、棉籽糖、淀粉，能夠使硝酸鹽還原，不能利用蜜二糖，無(wú)法使尿素分解、明膠液化。

2.5.2 16S rDNA的基因序列測(cè)定及比對(duì)結(jié)果 對(duì)Z1菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增純化產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果如圖9所示，其序列經(jīng) BLAST 軟件對(duì)比GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行同源性分析得出，Z1與GenBank中序列號(hào)為|AF024525.1|的Actinobacillus succinogenes 16S rRNA基因同源性達(dá)到99%。綜上可初步判斷Z1菌株為放線(xiàn)桿菌。

圖9 Z1菌株16S rDNA的基因序列測(cè)定結(jié)果

3 討論

琥珀酸作為許多重要化學(xué)品的直接或間接合成中間體被廣泛應(yīng)用于化工領(lǐng)域，具有很高的商業(yè)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景［23，24］。目前生產(chǎn)琥珀酸的方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法兩種，但由于化學(xué)合成法具有能耗高，污染大等缺點(diǎn)，不符合可持續(xù)發(fā)展的要求［25］。近幾年隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展和逐漸成熟，生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸因兼具資源可再生利用及吸收CO2等優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的發(fā)展?jié)摿Γ?4］。

從已報(bào)道的丁二酸生產(chǎn)菌株的種屬分布來(lái)看，它們廣泛分布于不同的種屬中。目前主要生產(chǎn)丁二酸的菌種有黑曲霉、谷氨酸棒狀桿菌、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌、產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌和重組大腸桿菌等［5］。對(duì)于從自然界中分離出產(chǎn)丁二酸菌種的研究，國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道，大多數(shù)的菌種自然產(chǎn)丁二酸的量還比較低，但是經(jīng)過(guò)基因技術(shù)的改良能夠有效地提高菌種的產(chǎn)量［23］。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，自然界中生產(chǎn)丁二酸的菌屬以放線(xiàn)桿菌居多，產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌具有高耐受底物濃度和產(chǎn)物抑制等優(yōu)點(diǎn)，是最具有工業(yè)化發(fā)展前景的潛力菌株之一［25］。本研究分離得到的高產(chǎn)菌株也屬于放線(xiàn)桿菌，但是與其他研究不同的是，本研究獲得的優(yōu)勢(shì)菌株Z1對(duì)氧氣的抵抗能力較強(qiáng)，能夠在微厭氧條件下較好地生產(chǎn)丁二酸。原因或許是我們?cè)趯?duì)該菌株進(jìn)行分離和選育時(shí)，有針對(duì)性的混雜一些無(wú)菌空氣，篩選出的菌株能夠較好地適應(yīng)微厭氧條件，也或許與在紫外誘變選育的過(guò)程中發(fā)生了基因突變有關(guān)，有待于進(jìn)一步深入的研究。

在富集培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中加入了5 g/L的富馬酸鈉和0.1 g/L的莫能菌素，目的是促進(jìn)目的菌株優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。富馬酸是三羧酸循環(huán)中重要的電子受體，能轉(zhuǎn)移氫，氫的減少能使產(chǎn)乳酸菌和產(chǎn)甲烷菌減少生長(zhǎng)，在一定程度上避免一些產(chǎn)酸菌落的干擾［7］，為生產(chǎn)丁二酸菌種的篩選奠定了一定基礎(chǔ)。采用熒光光圈篩選丁二酸生產(chǎn)菌株，該方法較為簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、耗時(shí)比較少，適合于大量篩選產(chǎn)丁二酸菌株的工作［13］。熒光法篩選產(chǎn)丁二酸菌株的原理是：在濃硫酸存在的條件下，丁二酸首先形成丁二酸酐，丁二酸酐與間苯二酚縮合而成丁二酰熒光素，反應(yīng)化學(xué)方程式如圖10所示［12］。

圖10 丁二酸酐與間苯二酚縮合成丁二酰熒光素化學(xué)方程式［12］

發(fā)酵液中丁二酸的含量與熒光圈的大小成正比，通過(guò)對(duì)比熒光顯色狀況和光圈大小，可以初步判斷在同樣培養(yǎng)條件下菌株的發(fā)酵產(chǎn)酸能力［13］。采用高效液相色譜法對(duì)經(jīng)過(guò)熒光圈初篩法得到優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證，能夠檢測(cè)菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的水平，也能測(cè)定出該菌株在丁二酸發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物生成情況。結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)室篩選得到的優(yōu)勢(shì)菌株在丁二酸發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，副產(chǎn)物代謝生成途徑較弱，發(fā)酵液中的丁二酸含量較高，因此在后期的分離純化的難度得以大幅降低，具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。

目前所報(bào)道的琥珀酸產(chǎn)量最高的菌株就是琥珀酸放線(xiàn)桿菌的誘變突變株［24］，因此，本研究對(duì)篩選出優(yōu)勢(shì)菌株G3進(jìn)行了紫外線(xiàn)誘變選育。紫外誘變的主要原理是使同鏈DNA 的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，以阻礙堿基間的正常配對(duì)，從而引起微生物突變或死亡。經(jīng)紫外線(xiàn)損傷的DNA能被可見(jiàn)光復(fù)活，故經(jīng)紫外線(xiàn)照射后孢子懸液不應(yīng)貯放太久，處理后的培養(yǎng)樣品需用黑紙或黑布包裹，避免長(zhǎng)波紫外線(xiàn)和可見(jiàn)光的照射［26］。本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)紫外誘變選育獲得了一株細(xì)胞干重和丁二酸產(chǎn)率均有明顯提高的高產(chǎn)菌株Z1，與誘變處理前的菌株相比，丁二酸的產(chǎn)率提高了46%。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化指標(biāo)測(cè)定以及16S rDNA序列分析等，鑒定Z1菌株為放線(xiàn)桿菌。本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)篩選和選育得到的菌株Z1，在丁二酸的發(fā)酵生產(chǎn)能力上處于自然菌屬發(fā)酵結(jié)果的較高水平，但與目前報(bào)道的利用基因工程手段獲取的重組大腸桿菌發(fā)酵丁二酸的結(jié)果相比，還有一定的差距。因此，利用代謝控制發(fā)酵和基因工程手段，進(jìn)一步提高丁二酸的發(fā)酵水平，將成為今后研究的重點(diǎn)方向。

4 結(jié)論

本研究利用溴甲酚綠指示劑的固態(tài)培養(yǎng)基作為選擇性平板，分離得到了生產(chǎn)丁二酸的單一菌落。通過(guò)熒光圈初篩法初步篩選得到了兩株產(chǎn)丁二酸水平較高的菌株Y3和Y4，然后利用高效液相法對(duì)初篩優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩檢驗(yàn)，得到產(chǎn)丁二酸產(chǎn)率較高的菌株G3，并對(duì)菌株G3進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變選育處理，獲得了一株細(xì)胞濕重和丁二酸產(chǎn)率均有明顯提高的高產(chǎn)菌株Z1，與誘變處理前的菌株G3相比，丁二酸的產(chǎn)率提高了46%，在底物葡萄糖濃度為100 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，Z1菌株的丁二酸發(fā)酵產(chǎn)量為50.30 g/L，葡萄糖殘留濃度為9.0 g/L。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化指標(biāo)測(cè)定以及16S rDNA序列分析等，鑒定Z1菌株為放線(xiàn)桿菌。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Screening and Breeding of a Strain for High Yield of Succinic Acid

Wang Le Yu Guanghai Yang Shuoye Wang Weiwei Hui Ming
（College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

It was to improve the production of succinic acid. After the primary and secondary screening， a strain with high-yield of succinic acid was isolated from the soil. The succinic acid production of 34.45% was determined by the high performance liquid chromatography（HPLC）after the fermentation. Later， the UV mutagenic breeding of strains has been performed， resulting in the succinic acid production of 50.30% which increased by 46% in the substrate of glucose concentration of 100 g/L with the residual sugar lower than 10 g/L. After the determinations of morphological characteristics， physiological and biochemical index and 16S rDNA sequence analysis， the strain was identified as actinobacillus.

succinic acid；high-producing strain；screen；mutagenesis；Actinobacillus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.018

2014-08-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21306040）

王樂(lè)，男，博士，講師，研究方向：微生物學(xué)，發(fā)酵工程；E-mail：wanglely1984@163.com

惠明，男，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：huiming69@163.com