晏勝偉 孫程 周曉今 陳茹梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

玉米JAZ家族基因ZmJAZ4的克隆及功能分析

晏勝偉 孫程 周曉今 陳茹梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)抑制茉莉素調(diào)控基因的表達(dá)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫等方面發(fā)揮重要的功能。從玉米B73自交系中克隆到一個(gè)新的JAZ家族基因ZmJAZ4，該基因cDNA全長(zhǎng)為651 bp，編碼蛋白含有216個(gè)氨基酸，分子量約為23.1 kD，pI為10.78，屬于堿性蛋白。Real-time RT-PCR結(jié)果表明，ZmJAZ4主要在莖端分生組織、雄穗、發(fā)育早期的種子以及胚乳中表達(dá)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，ZmJAZ4與AtJAZ10轉(zhuǎn)錄因子相似性較高。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)表明，ZmJAZ4定位于細(xì)胞核內(nèi)。ZmJAZ4在酵母細(xì)胞中不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。激素及脅迫處理表明，ZmJAZ4在地上部的表達(dá)受PEG、NaCl、SA、GA和ABA誘導(dǎo)，而在地下部的表達(dá)受到ABA和GA誘導(dǎo)。結(jié)果分析表明，ZmJAZ4可能是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與調(diào)控多種激素信號(hào)通路及非生物脅迫響應(yīng)。

茉莉素；ZmJAZ基因；逆境脅迫

JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的植物中特有的蛋白家族，其通過(guò)抑制茉莉素調(diào)控基因的表達(dá)而參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育［1，2］。JAZ屬于TIFY家族，該家族蛋白序列都含有高度保守的TIF［F/Y］XG氨基酸序列，且JAZs可依靠該TIFY基序形成同源或者異源二聚體。作為T(mén)IFY家族中的一個(gè)亞家族，JAZ蛋白是茉莉素（JA）信號(hào)通路的一個(gè)重要的抑制因子［3，4］。在擬南芥中存在12個(gè)JAZ蛋白家族成員，它們均含有3個(gè)保守區(qū)，分別為NT、TIFY和Jas結(jié)構(gòu)域，其中TIFY結(jié)構(gòu)域包含有ZIM（ZINC-FINGER EXPRESSED IN INFLORESCENCE MERISTEM）結(jié)構(gòu)域［5］。正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)具有生物活性的JA（JA-Ile）水平很低，JA介導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)受JAZ蛋白的抑制，即JAZ蛋白抑制JA下游轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［6，7］。而當(dāng)植物受到昆蟲(chóng)咬食或植物腐蝕病原菌感染的脅迫時(shí)，植物體內(nèi)JA-Ile的水平升高，通過(guò)降解JAZ蛋白釋放被其抑制的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而激活JA應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄，以發(fā)揮調(diào)控功能［2，6］。

自從JAZ蛋白被報(bào)道以來(lái)，已對(duì)擬南芥、水稻和大豆等物種中的JAZ家族基因開(kāi)展了較系統(tǒng)和深入的研究。擬南芥JAZ10的過(guò)表達(dá)植株對(duì)茉莉酸不敏感，且可減輕由損傷脅迫引起的生長(zhǎng)抑制［8］。水稻OsJAZ10的超表達(dá)可以提高水稻對(duì)鹽和干旱的耐受性且增加籽粒大?。?］。而野生大豆GsJAZ2在植物的抗逆方面具有一定的功能，如GsJAZ2超表達(dá)擬南芥表現(xiàn)出對(duì)鹽、堿脅迫的耐受性，且脅迫信號(hào)通路相關(guān)基因RD29B、KIN1和DREB等表達(dá)上調(diào)［10］。煙草NaJAZd的超表達(dá)可抑制花蕾脫落［11］。JAZ蛋白不僅參與植物抗逆，同樣也與抗病相關(guān)［12］。但是，同樣作為十分重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物，玉米中的JAZ類(lèi)基因的研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室以玉米B73自交系為材料，通過(guò)基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)方法建立了玉米特異的轉(zhuǎn)錄因子庫(kù)，ZmJAZ4基因即選自其中。本研究通過(guò)RT-PCR克隆得到ZmJAZ4基因全長(zhǎng)序列，分析該基因的氨基酸序列和在玉米不同組織中的表達(dá)特性，鑒定ZmJAZ4的亞細(xì)胞定位，分析其轉(zhuǎn)錄激活活性，另外通過(guò)激素及逆境脅迫誘導(dǎo)分析該基因的調(diào)控機(jī)制，旨在為探索玉米中JAZ家族基因的功能以及研究玉米的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆等機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米B73自交系材料種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所試驗(yàn)田。

1.2 方法

1.2.1 玉米ZmJAZ4 基因的克隆 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄因子庫(kù)篩選出的ZmJAZ4基因（序列號(hào)GRMZM2-G024680），設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)引物：5'-AAGGATCCATGGCCGCCTCCGGGAACAA-3'和5'-AAGGTTACCTCAGAGCCTGAGCGCGAGCC-3'，提取B73玉米自交系三葉一心時(shí)期幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物連接到pEASYBlunt（北京全式金公司）載體測(cè)序，驗(yàn)證克隆。

1.2.2 ZmJAZ4 氨基酸序列特性分析 通過(guò)搜索玉米全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.gramene.org/和http：//www.maizegdb.org/）對(duì)目的基因編碼蛋白等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行分析。使用Clustal W 軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建使用MEGA4.1軟件。

1.2.3 ZmJAZ4轉(zhuǎn)錄本表達(dá)分析 分別取玉米根、莖、葉、葉鞘、莖尖、雄花，以及授粉后10、15、20和25 d的胚和胚乳，液氮速凍研磨，提取總RNA。激素及逆境脅迫處理：玉米幼苗在蛭石中生長(zhǎng)至三葉一心期，將幼苗從蛭石中取出，放于水中平衡2 h后開(kāi)始逆境與激素處理，并取處理后0、0.5、1、3、6、9和24 h的地上部與地下部；激素處理包括赤霉素（GA，100 μmol/L），水楊酸（SA，100 μmol/L）和脫落酸（ABA，100 μmol/L）。逆境處理方法分為干旱（20% PEG4000）和高鹽（NaCl，250 mmol/L），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材分為地上部與地下部，然后液氮速凍研磨，提取總RNA。使用RNAiso Plus（TaKaRa，Japan）提取上述材料總RNA，利用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，USA）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，合成第一鏈cDNA，qRT-PCR 應(yīng)用ABI Prism 7500 system（Applied Biosystems，USA）檢測(cè)系統(tǒng)和SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，Japan）試劑盒。ZmJAZ4基因的RT-PCR上下游引物為：5'-CGCTCAGGCTCTGAAACAGTGAAACC-3'和5'-CGACGACAGACACAGTGCCTAAGAAT-3'；以玉米Actin1作為內(nèi)參，其上下游擴(kuò)增引物為5'-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3'和5'-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3'。

1.2.4 亞細(xì)胞定位分析 以克隆得到的ZmJAZ4全長(zhǎng)cDNA為模板，應(yīng)用引物5'-CTCGAGATGGCCGCCTCCGGGAACAA-3'和5'-TCTAGAGAGCCTGAGCGCGAGCCACG-3'擴(kuò)增獲得不含終止密碼子的ZmJAZ4全長(zhǎng)ORF，并在其兩端引入Xho I與Xba I內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)上述酶切位點(diǎn)將ZmJAZ4 cDNA連入pRTL2-NGFP載體CaMV35S啟動(dòng)子和GFP的 cDNA之間，使目的基因與GFP cDNA的N端融合，然后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證［13］。通過(guò)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體［14］，培養(yǎng)12 h后，在共聚焦顯微鏡下觀察蛋白定位結(jié)果。1.2.5 ZmJAZ4的轉(zhuǎn)錄激活活性分析 通過(guò)PCR方法在ZmJAZ4的 cDNA兩端分別引入EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)，經(jīng)上述酶切位點(diǎn)將ZmJAZ4 cDNA 與pGBK-T7（CLONTECH）載體的GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，融合載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。將上述重組載體和空載體pGAD-T7共轉(zhuǎn)化到酵母AH109菌株中，29℃培養(yǎng)3 d后，挑取SD/-Trp/-His篩選培養(yǎng)基上的酵母單菌落于SD/-Trp/-His液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將菌液滴于SD/-Leu-Trp/-His-Ade缺陷篩選培養(yǎng)基上驗(yàn)證是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

2 結(jié)果

2.1 ZmJAZ4 的克隆和序列分析

本研究擴(kuò)增的ZmJAZ4基因長(zhǎng)度為651 bp（圖1），編碼蛋白含有216個(gè)氨基酸，分子量約為23.1 kD，pI為10.78，屬于堿性蛋白。為了研究ZmJAZ4與其他已報(bào)道的JAZ類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子間的進(jìn)化關(guān)系，選擇研究比較深入的擬南芥和水稻JAZ家族蛋白與ZmJAZ4進(jìn)行了比對(duì)分析（圖2）。結(jié)果表明，ZmJAZ4含有JAZ家族基因特有的NT、TIFY和Jas保守結(jié)構(gòu)域（圖2-A），但其氨基端和羧基端的NT和Jas結(jié)構(gòu)域保守性較低。將ZmJAZ4氨基酸序列與擬南芥JAZ家族的12個(gè)成員進(jìn)行了進(jìn)化樹(shù)分析（圖2-B）。結(jié)果表明，ZmJAZ4與AtJAZ10相似性最高。而AtJAZ10的過(guò)表達(dá)植株對(duì)茉莉酸不敏感，且可減輕由損傷脅迫引起的生長(zhǎng)抑制，推測(cè)ZmJAZ4在植物抗逆方面具有與AtJAZ10相似的功能。

圖1 ZmJAZ4基因的RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳

2.2 ZmJAZ4 轉(zhuǎn)錄本的時(shí)空表達(dá)分布

基因的表達(dá)模式分析有助于人們更有效地了解其功能。為了鑒定ZmJAZ4的時(shí)空分布特征，以玉米B73自交系的不同組織提取的總RNA進(jìn)行了熒光定量RT-PCR分析。結(jié)果（圖3）顯示，ZmJAZ4的轉(zhuǎn)錄本在莖端分生組織、雄花和籽粒中有表達(dá)，在籽粒中主要于胚乳中表達(dá)，而在胚中的表達(dá)量較低。此外，ZmJAZ4的表達(dá)量隨著籽粒的成熟而逐漸上調(diào)。推測(cè)ZmJAZ4可能在雄穗及種子的發(fā)育，尤其是在胚乳的發(fā)育過(guò)程起一定的調(diào)控作用。

2.3 ZmJAZ4 蛋白的亞細(xì)胞定位分析

轉(zhuǎn)錄因子作為反式作用因子，是通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合或通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子互作來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，因此其若發(fā)揮功能則首先應(yīng)該進(jìn)入到細(xì)胞核。為了探究ZmJAZ4蛋白的亞細(xì)胞定位特征，將其編碼序列融合到GFP的5'端（圖4-A），通過(guò)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體使融合蛋白在玉米原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)，使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果（圖4-B）顯示，空載GFP對(duì)照蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；而ZmJAZ4-GFP蛋白融合，只定位于細(xì)胞核。此結(jié)果說(shuō)明ZmJAZ4蛋白定位于細(xì)胞核，可能參與調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。

2.4 ZmJAZ4 的轉(zhuǎn)錄活性分析

為了驗(yàn)證ZmJAZ4是否具有轉(zhuǎn)錄因子的功能，將ZmJAZ4的cDNA與pGBK-T7載體的GAL4 DNA結(jié)合域融合，然后與pGAD-T7載體共轉(zhuǎn)化到酵母AH109菌株中，結(jié)果（圖5）表明ZmJAZ4不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。已知ZmJAZ4 蛋白定位于細(xì)胞核，因此可以推測(cè)ZmJAZ4可能通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子互作發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用。

2.5 玉米ZmJAZ4 于非生物脅迫下的表達(dá)特性分析

采用qRT-PCR方法，以玉米B73自交系為材料分析了ZmJAZ4在GA、SA、ABA、PEG、NaCl和H2O六種處理下的表達(dá)特性。結(jié)果（圖6）顯示，在玉米的地上部分，ZmJAZ4主要受到GA、SA、PEG和NaCl四種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其中在GA誘導(dǎo)下表達(dá)量最高，即在誘導(dǎo)后1 h增加60多倍。在根中，ZmJAZ4受GA和ABA誘導(dǎo)，且在ABA誘導(dǎo)后1 h表達(dá)量達(dá)到最高值，增加約30倍。此結(jié)果說(shuō)明ZmJAZ4受鹽、干旱、GA、SA以及ABA脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，可能在激素及逆境脅迫信號(hào)通路中起一定的調(diào)控作用，且ZmJAZ4在玉米的根和葉中響應(yīng)脅迫的方式有一定的差異。

圖2 ZmJAZ4的氨基酸序列（A）及其進(jìn)化樹(shù)分析（B）

圖3 ZmJAZ4 mRNA的時(shí)空表達(dá)分布

圖4 ZmJAZ4的亞細(xì)胞定位分析

圖5 ZmJAZ4轉(zhuǎn)錄激活活性分析

圖6 不同激素及脅迫處理下ZmJAZ4在B73玉米植株地上部分（A）及根部（B）的表達(dá)特性分析

3 討論

JAZ是特異存在于植物中的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，屬于TIFY超家族。目前，人們對(duì)JAZ蛋白的調(diào)控機(jī)制逐步有了深入了解。已有研究結(jié)果表明，JAZ蛋白調(diào)控的信號(hào)通路在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境脅迫方面具有重要的功能，如擬南芥JAZ家族基因可以被多種非生物逆境誘導(dǎo)表達(dá)［15］，AtJAZ10在擬南芥中過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致擬南芥對(duì)茉莉酸不敏感，并且降低損傷導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制［8］。而水稻中的大部分JAZ基因受茉莉酸和非生物脅迫的誘導(dǎo)，且其在水稻中過(guò)表達(dá)后顯著提高植株對(duì)高鹽和干旱的抗性［16］。于大豆中過(guò)表達(dá)GsJAZ2可以增加植株對(duì)鹽堿的敏感性，并可調(diào)控RD29B、DREB、KIN1等基因的表達(dá)［10］。有研究表明，蕓苔屬植物中JAZ5a能夠顯著提高抽薹期植物的耐熱性［17］。煙草中過(guò)表達(dá)NaJAZd和 NaJAZh可以分別抑制花蕾脫落和促進(jìn)尼古丁的合成［11，18］。可以看出，JAZ家族基因雖然在不同物種中所表現(xiàn)出的功能不盡相同，但在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫中扮演著十分重要的角色。然而，玉米中的JAZ至今鮮有報(bào)道。若能夠?qū)τ衩字蠮AZ家族蛋白進(jìn)行系統(tǒng)而又深入的研究，將能夠?yàn)橛衩子N工作提供重要的幫助。ZmJAZ4作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，可以受鹽、干旱、GA、SA以及ABA多種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，可能在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆等方面扮演重要角色。下一步的試驗(yàn)中，計(jì)劃將ZmJAZ4基因在玉米中過(guò)量表達(dá)和抑制表達(dá)，進(jìn)一步探究其在玉米中發(fā)揮的調(diào)控功能。

4 結(jié)論

本研究利用基因芯片技術(shù)獲得的玉米轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合RT-PCR技術(shù)，獲得ZmJAZ4基因的cDNA序列。序列分析發(fā)現(xiàn)ZmJAZ4具有JAZ家族的保守結(jié)構(gòu)域，利用進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)ZmJAZ4與擬南芥中的AtJAZ10相似性最高。利用qRT-PCR對(duì)其在不同組織及發(fā)育階段的表達(dá)特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ZmJAZ4在莖端分生組織、雄花和籽粒中有表達(dá)，而籽粒中主要于胚乳表達(dá)，且其表達(dá)量隨著籽粒的成熟而上調(diào)。ZmJAZ4定位于細(xì)胞核，為不具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。非生物脅迫處理結(jié)果表明ZmJAZ4受鹽、干旱、GA、SA以及ABA脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，且在玉米的根和葉中相應(yīng)脅迫的表達(dá)模式有一定的差異。結(jié)果表明，ZmJAZ4編碼的蛋白在細(xì)胞核中可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在激素及逆境脅迫信號(hào)通路中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Characterization Analysis of ZmJAZ4，a JAZ Family Gene in Maize（Zea mays L.）

Yan Shengwei Sun Cheng Zhou Xiaojin Chen Rumei
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Jasmonate ZIM-domain（JAZ）proteins are a group of plant-specific transcription factors， which have important function in plant growing development and abiotic stress by inhibiting the expression of genes associated with JA regulation. In this study， a novel JAZ family gene， named ZmJAZ4， was isolated from maize（Zea mays L.）inbred lines B73. The ZmJAZ4 cDNA has a total length of 651 bp and encodes a protein of 216 amino acids with a molecular weight of about 23.1 kD and a isoelectric points of 10.78， belonging to the basic protein. Real-time RT-PCR showed that ZmJAZ4 was mainly expressed in shoot apex meristem， tassel， developing seeds and endosperm. Phylogenetic analysis revealed that ZmJAZ4 was related to AtJAZ10 from Arabidopsis. Subcellular localization experiment showed that ZmJAZ4 was localized to the nucleus. ZmJAZ4 possessed no transcriptional activating activity in yeast cells. Various treatments were performed to detect the expression level of ZmJAZ4 in response to phytohormones or abiotic stresses. The transcripts of ZmJAZ4 was induced by PEG， NaCl， SA， GA and ABA treatment in shoots and that was induced by ABA and GA in roots. The above results showed that ZmJAZ4 may be an important transcriptional regulator，which participates in many hormones signaling pathways and abiotic stress.

Jasmonate；Zea mays Jasmonate ZIM-domain gene；Abiotic stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.013

2014-10-13

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863”項(xiàng)目（2012AA10A306），國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973”項(xiàng)目（2014CB138200），轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)（2008ZX08003-002）

晏勝偉，男，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：zhongdayan109@163.com

陳茹梅，女，研究員，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：chenrumei@caas.cn