嚴濤 郗洪生

（江蘇恒豐強生物技術(shù)有限公司，海門 226100）

微生物合成γ-聚谷氨酸的相關(guān)基因、合成機理及發(fā)酵的研究進展

嚴濤 郗洪生

（江蘇恒豐強生物技術(shù)有限公司，海門 226100）

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一種天然的氨基酸聚合物，由于其水溶性好、可生物降解、食用，以及對人類、動物和環(huán)境無毒等特點，因此，在環(huán)境、醫(yī)藥、食品和化妝品、飼料添加劑等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。主要是對微生物合成γ-PGA所采用的菌株、相關(guān)基因、合成機理及發(fā)酵方面進行綜述。

γ-PGA；基因；機理；發(fā)酵

隨著人們綠色環(huán)保意識的加強，尋找綠色、無污染的新型材料越來越受到關(guān)注，而γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）由于水溶性好，可生物降解與食用，以及對人類、動物和環(huán)境無毒的特點，目前已成為生物多聚物中的研究熱點之一。γ-PGA是一種水溶性可生物降解的新型綠色生物材料，由D-或L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基通過γ-酰胺鍵結(jié)合而成的陰離子聚合物。γ-PGA的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 γ-PGA的結(jié)構(gòu)式

γ-PGA具有可食用性、無毒性、成膜性、黏結(jié)性、保濕性等特點，其應(yīng)用非常廣泛，既可應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品中，又可以作為保水劑及水果、蔬菜的防凍劑、保鮮劑，還可以作為污水處理的絮凝劑、重金屬螯合劑。更重要的是，還可應(yīng)用于飼料添加劑方面，提高動物對鈣、鐵、磷等微量元素的吸收，減少動物排泄物對環(huán)境造成的污染。γ-PGA的合成方法有化學(xué)合成法、提取法和微生物發(fā)酵法。其中化學(xué)合成法包括傳統(tǒng)的肽合成法和二聚體縮合法，由于產(chǎn)物純度難以控制、副產(chǎn)物比較多，同時產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量比較小，所以限制了該方法的應(yīng)用；提取法是從日本傳統(tǒng)食品納豆（類似中國的豆豉）中分離得到γ-PGA，由于納豆中成分復(fù)雜，γ-PGA的含量不穩(wěn)定，使該方法不能廣泛運用。目前合成γ-PGA的主要方法是微生物發(fā)酵法［1，2］，該法工藝相對簡單，產(chǎn)物分離純化容易，微生物發(fā)酵法在近幾年得到了廣泛的采用與快速發(fā)展。本文主要是對微生物合成γ-PGA所采用的菌株、相關(guān)基因、合成機理及發(fā)酵方面進行綜述。

1 合成γ-PGA的菌株

γ-PGA是最早于1933年在炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）的莢膜上發(fā)現(xiàn)的，主要功能是保護細菌免受外界不利環(huán)境的影響。據(jù)報道［3］，表皮葡萄球菌（Saphylococcus epidermidis）也能合成γ-PGA，合成的γ-PGA結(jié)合在細胞壁上。另外，3種古生菌，如嗜鹽球菌（Planococcus halophilus），鹽藻芽孢八疊球菌（Sporosarcina halophila）和亞洲嗜鹽堿桿菌（Natrialba asiatica）也能合成γ-PGA，用來降低細菌周圍的鹽濃度。目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種真核γ-PGA合成生物為腔腸動物（Cnidaria）。

通過微生物來發(fā)酵合成γ-PGA，其研究主要集中在芽孢桿菌屬細菌的炭疽芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等［4］菌株上。根據(jù)細胞生長的營養(yǎng)要求，按是否需要L-谷氨酸，可以把γ-PGA合成菌分為兩大類［5］：一類是谷氨酸依賴型，即培養(yǎng)時需要L-谷氨酸才能積累γ-PGA，這類菌種主要有Bacillus anthracis、Bacillus subtilis MR-141、Bacillus licheniformis ATCC-9945、Bacillus subtilis IFO3335和Bacillus subtilis F-2-01等；另一類是谷氨酸非依賴型，即培養(yǎng)時不需要L-谷氨酸也能積累γ-PGA的，如Bacillus subtilis 5E、Bacillus licheniformis A35、Bacillus subtilis TAM-4等［6］。21世紀以來，篩選可以高效合成γ-PGA的微生物，受到越來越多的學(xué)者的關(guān)注，曹明飛等［7］成功從土壤中分離到一株γ-PGA合成菌Bacillus licheniformis NK-03，其合成的γ-PGA中L-谷氨酸單體達到98%，在已報道的同種菌株L-谷氨酸單體含量中尚屬最高。而發(fā)現(xiàn)的能夠大量合成γ-PGA的多種芽孢桿菌都具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值，本研究組合成γ-PGA所用到的菌株為枯草芽孢桿菌。

2 微生物合成γ-PGA的相關(guān)基因研究

合成γ-PGA的相關(guān)基因，根據(jù)其命名可分為cap（Capsule）和pgs（Polyglutamate synthase）。前者是將γ-PGA做為莢膜的結(jié)構(gòu)組成部分，為結(jié)構(gòu)型，其代表菌株為Bacillus anthracis；后者是將產(chǎn)生的γ-PGA分泌到胞外，為分泌型，其代表菌株類型為Bacillus subtilis。在Bacillus anthracis的菌體中包含兩個質(zhì)粒，即pXO1（108 kb）和pXO2（951 kb），最初將有關(guān)PGA編碼的相關(guān)基因定位在Bacillus anthracis的pXO2質(zhì)粒上，稱之為cap BCA，這也是Makino等［8］在1989年首次報道編碼γ-PGA生物合成過程的相關(guān)基因研究，他們通過基因互補技術(shù)，在質(zhì)粒pXO2上鑒定出呈簇狀分布的3個順反子，并確定其排列順序為：cap B、cap C和cap A，如圖2-A所示。通過對cap BCA這3個蛋白的氨基酸序列進行分析、定位及對理化處理的敏感性，推測這些屬于膜交聯(lián)酶。后來Urushibata等［9］將cap BCA基因克隆轉(zhuǎn)到大腸桿菌（Escherichia coli）中進行表達發(fā)現(xiàn)，cap B是一個重疊基因，能編碼2個蛋白cap B和cap B'，cap BCA酶以膜結(jié)合蛋白形式存在。另外，在cap BCA基因簇下游發(fā)現(xiàn)了編碼γ-聚D-谷氨酸解聚酶的基因dep，該基因主要是菌體在饑餓條件下，啟動該基因的表達來降解PGA為菌體提供氮源。

圖2 炭疽芽孢桿菌莢膜基因cap BCA（A）與枯草芽孢桿菌合成酶基因pgs BCA（B）

Ashiuchi等［10］從Bacillus subtilis IFO3336基因組文庫中，篩選到編碼γ-PGA合成酶復(fù)合體的克隆，其能在胞外合成更高分子量的γ-PGA。此合成基因包含：pgs B、pgs C和pgs A（也有學(xué)者稱為yws C、ywt A和ywt B）3個基因，排列成簇，如圖2-B所示。下游ywt C基因功能未知，可能是編碼γ-PGA解聚酶pgd S（也有學(xué)者稱為ywt D）基因的先導(dǎo)小蛋白，Bacillus subtilis IFO3336中pgs BCA基因與Bacillus anthracis的cap BCA基因同源性分別為66%、77%和50%。Cao等［11］篩選到一株谷氨酸非依賴型γ-PGA合成菌，即解淀粉芽孢桿菌LL3，并從菌體中克隆到pgs BCA的PGA合成基因，通過與谷氨酸依賴型Bacillus subtilis IFO3336序列比對發(fā)現(xiàn)，pgs B、pgs C和pgs A 這3個基因的相似性分別為81.39%、83.33%和73.8%。Uruchibata等［12］從Bacillus subtilis IFO16449中獲得包含4個開放閱讀框的4.2 kb片段，Northern雜交顯示其組成一個操縱子，其中yws C（pgs B）、ywt A（pgs C）和ywt B（pgs A）為γ-PGA合成必要的基因；Western雜交發(fā)現(xiàn)yws C蛋白由44 kD的 yws C和33 kD的yws C'兩部分組成，且由同向重疊的yws C基因編碼，然而兩蛋白具體功能尚不清楚。pgs BCA系統(tǒng)是分泌型芽孢桿菌菌體內(nèi)唯一的γ-PGA合成體系［13］，石峰等［14］從Bacillus subtilis ZJU-7的基因組中擴增得到合成γ-PGA的pgs BCA，通過把pTrc99A作為載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，構(gòu)建出來的工程菌大腸桿菌JM109能合成γ-PGA；有些枯草芽孢桿菌，如Bacillus subtilis 168，雖然含有pgs BCA這3個基因，但是由于γ-PGA合成酶操縱子受不同啟動子控制，在Bacillus subtilis 168菌體中轉(zhuǎn)錄水平太低，使其不能合成γ-PGA，而馬婕等［15］從Bacillus subtilis 168基因組中獲得合成γ-PGA的3個基因，即yws C、ywt A和ywt B，這3個基因被連接酶連接后，導(dǎo)入到pTrcHisA中，電轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)錄水平比較高的大腸桿菌TOP10及大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達，結(jié)果顯示宿主菌都具備了γ-PGA的合成能力。

Xu等［16］從Bacillus subtilis IFO 16449 菌中克隆出了一個新基因，命名為ywt D，其功能是編碼可降解γ-PGA的一種酶。經(jīng)DNA序列分析將其定位于ywt ABC和yws C基因的相連的下游，并與yws C和ywt ABC構(gòu)成控制γ-PGA生物合成的一個操縱子，如圖2-B所示。同時還證明，ywt D基因與編碼DL-內(nèi)肽酶的基因序列部分相同。純化的這種酶，具有降解γ-PGA的功能，降解后可產(chǎn)生兩種酶解產(chǎn)物，一種高分子質(zhì)量產(chǎn)物（490 kD，100%由L-谷氨酸組成）；另一種低分子質(zhì)量產(chǎn)物（11 kD，其中D-谷氨酸與L-谷氨酸的比為80∶20）。再用羧肽酶G分析證明這兩種產(chǎn)物，這種ywt D酶為一種只降解γ-PGA的D-與L-谷氨酸所形成的γ-谷氨酰鍵，為γ-DL-谷氨酰基水解酶。王計偉等［17］通過在pET-28b（+）大腸桿菌表達系統(tǒng)中克隆表達Bacillus licheniformis ATCC9945A的ywt D基因，采用SDSPAGE和Western Blot方法檢測目的蛋白的表達，并進行體外酶解試驗驗證其活性，體外酶解試驗表明該表達產(chǎn)物具有降解γ-PGA的活性。筆者在用Bacillus subtilis發(fā)酵合成γ-PGA時，在發(fā)酵后期，發(fā)酵液變得十分黏稠，但當(dāng)超濾后，高黏度的發(fā)酵液若不及時提取γ-PGA，放置幾日后，則黏度逐漸消失，這是由于γ-DL-谷氨?；饷笇Ζ?PGA降解的原因。目前，雖然已經(jīng)得知γ-PGA合成的必需基因（即cap BCA和pgs BCA），但是其合成的各個蛋白的具體功能，仍然不清楚，需要后期進一步的研究。

3 γ-PGA合成機理的研究

3.1 γ-PGA中碳骨架的來源

組成γ-PGA碳骨架是來源于葡萄糖中的碳，還是來自谷氨酸中的碳，不同菌體其來源不盡相同。有學(xué)者［18］通過13C標(biāo)記葡萄糖，對Bacillus subtilis NX-2中γ-PGA分子鏈中的碳骨架進行了跟蹤分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖作為碳源大部分用于能量代謝和菌體合成，只有少部分參與了γ-PGA合成，而谷氨酸則為γ-PGA單體的主要來源；Cromwick和Gross［19］用13C標(biāo)記檸檬酸和谷氨酸作為培養(yǎng)基碳源，通過核磁共振技術(shù)對該菌合成γ-PGA的代謝途徑進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬酸和谷氨酸均作為前體參與了γ-PGA碳骨架的合成；另外，在Bacillus subtilis MR-141［20］中，除了35%的外源14C-谷氨酸整合入γ-PGA，還有6%的14C-葡萄糖也整合入γ-PGA。由此可知，不同微生物，其γ-PGA碳骨架來源有種屬特異性，根據(jù)這一現(xiàn)象有助于為培養(yǎng)基成分的設(shè)計及γ-PGA的合成提供理論依據(jù)。

3.2 γ-PGA的聚合機制研究

最早推測出γ-PGA合成機制的是Troy等［21］首先在Bacillus licheniformis 中發(fā)現(xiàn)的，其合成機制為：首先，ATP激活L-谷氨酸，然后由ATP脫去ppi形成的AMP，與谷氨酸在γ位結(jié)合，形成谷氨酰-γ-AMP；然后該物質(zhì)與一種帶-SH的酶或者受體（如一些硫脂，暫以X代稱）結(jié)合，并隨后異構(gòu)化為谷氨酰-X；然后谷氨酰連接到γ-PGA片段上，并脫去X，完成γ-PGA片段的延伸。

后來，Ashiuchi等［13］在一株Bacillus subtilis 中分離到了細胞膜成分，在ATP和D-谷氨酸存在下體外合成了γ-PGA。但他們發(fā)現(xiàn)該菌在合成γ-PGA時，ATP水解形成的是ADP，而非AMP，而由于cap B的表達蛋白cap B屬氨基連接酶，他們提出了另一條合成機制。即ATP被ATP水解酶水解為ADP與Pi，然后磷酸基團結(jié)合到小分子γ-PGA的C末端，之后D-或者L-谷氨酸的氨基端與C端磷酸化了的小分子γ-PGA發(fā)生親核攻擊，生成Pi，在γ-PGA合成酶的作用下，延伸γ-PGA鏈。但是，D-谷氨酸依賴型的ATP酶活性要比L-谷氨酸依賴型的ATP酶活性高，這似乎解釋了合成酶系對底物的偏好性，使得γ-PGA中的D-谷氨酸單體比例偏高。但此機制仍有待進一步證明，如小分子γ-PGA究竟多大，發(fā)生親核攻擊的具體位置等。筆者認為，雖然不同的學(xué)者得到的合成γ-PGA的機制不盡相同，但是不同的微生物，由于其生物特性及代謝調(diào)控的不同，其合成γ-PGA的機制也應(yīng)該不完全相同。

圖3 γ-PGA的合成途徑及調(diào)控示意圖

3.3 γ-PGA合成的調(diào)控研究

由于cap BCA和pgs BCA的基因序列相似度很高，而且微生物合成γ-PGA屬于結(jié)合型還是游離型，主要是取決于另外的基因cap D和pgs S，所以推測cap BCA和pgs BCA基因控制的γ-PGA合成調(diào)控機理相同［22］，而且cap BCA基因合成的γ-PGA主要是炭疽芽孢桿菌莢膜的主要成分，一般不用其大量生產(chǎn)γ-PGA，對其調(diào)控的研究很少有報道。因此，這里簡述一下pgs BCA基因合成γ-PGA的調(diào)控研究。

Mader等［23］在Bacillus subtilis中發(fā)現(xiàn)高濃度的磷酸化的DegU能夠活化pgs B，C，A的轉(zhuǎn)錄。2005年，Stanley等［24］報道稱在Bacillus subtilis中，調(diào)控蛋白ComP-ComA、DegS-DegU、GegQ和SwrA對γ-PGA的合成是必需的。他們將DegQ和SwrA分別敲除發(fā)現(xiàn)，這兩個基因任一的敲除都將導(dǎo)致γ-PGA不能合成。而后對DegQ進行了反轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)，高濃度的DegQ對yws C（與pgs B相同）的轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用，而SwrA對其轉(zhuǎn)錄有細微的影響，所以研究者猜測SwrA主要在轉(zhuǎn)錄后起調(diào)節(jié)作用。而之前的研究已經(jīng)表明，ComP-ComA和DegS-DegU都能影響DegQ的轉(zhuǎn)錄，所以他們提出了一種可能的調(diào)節(jié)途徑，如圖3所示。Kimura等［25］于2009年發(fā)現(xiàn)pgs B基因上游的一段非編碼區(qū)對其表達起重要作用。他們將lac Z與pgs B融合，組成融合基因，并通過檢測Lac Z的表達來定量表征pgs B的表達情況，然后用一種外切酶從pgs B上游-811開始切除，進而研究上游非編碼區(qū)域?qū)gs B的表達影響。結(jié)果表明，-721（+1為轉(zhuǎn)錄起始位點）之后的非編碼區(qū)對融合基因的表達起重要作用，猜測可能是ComA或者DegU需要與該段區(qū)域結(jié)合，進而對γ-PGA合成基因進行調(diào)控。另外，Bacillus subtilis 168被廣泛用于γ-PGA調(diào)控研究，因為該菌是為數(shù)不多的、擁有全套的γ-PGA合成基因卻不生產(chǎn)γ-PGA的菌株。

綜 上 所 述，ComP-ComA、DegS-DegU、DegQ和SwrA對γ-PGA的合成都是必需的。其中ComPComA，DegS-DegU蛋白對基因degQ進行調(diào)控，進而調(diào)節(jié)DegQ的轉(zhuǎn)錄，影響γ-PGA合成酶的合成，間接影響pgs B，C，A的轉(zhuǎn)錄，SwrA則主要作用于pgs B，C，A的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，即主要調(diào)控γ-PGA合成酶的活性。而pgs B上游的非編碼區(qū)對pgs B的表達也有重要影響。

表1 γ-聚谷氨酸部分合成菌及發(fā)酵條件

4 微生物合成γ-PGA發(fā)酵的研究

通過微生物來發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，其發(fā)酵影響因素，如碳氮源、通氧量、攪拌速度、金屬離子、微量元素、前體物質(zhì)、生物素等，對不同菌株生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的影響是不同的。表1［26-34］列出了幾株谷氨酸依賴型和非依賴型菌株的培養(yǎng)基配方、發(fā)酵周期和γ-聚谷氨酸產(chǎn)量、單體D/L-谷氨酸比例及分子量大小。以發(fā)酵菌株、發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件、發(fā)酵方式3個方面來簡述微生物發(fā)酵合成γ-聚谷氨酸的研究進展。

4.1 發(fā)酵合成γ-PGA的菌株研究

由于不同菌株，其本身的特性，決定了其生長代謝的不同，因此發(fā)酵合成γ-PGA的能力也不同，因此，很多研究者在基因分子層面對菌株進行改造，采用基因工程的手段（基因克隆、敲除，轉(zhuǎn)錄和表達等）來構(gòu)建基因工程菌，以提高其菌株的性能，進而提高γ-PGA的產(chǎn)量。Su等［35］首次將細菌血紅蛋白基因（vgb）采用同源重組方式整合入枯草芽孢桿菌染色體中，突變株枯草芽孢桿菌S18-3-vgb+能正常表達血紅蛋白基因，增強了攝氧能力，成功克服了發(fā)酵時黏度增加引起的溶氧不足，使菌體濃度提高1.26倍，γ-PGA產(chǎn)量增至60.5 g/L；Yeh等［36］研究組將一種高效合成表達控制序列（synthetic expression control sequence，SECS）單拷貝形式整合入非γ-PGA合成菌枯草芽孢桿菌DB430 yws C 基因上游，獲得重組菌枯草芽孢桿菌PGA 6-2，其在不添加額外谷氨酸和氯化銨的培養(yǎng)基中，能產(chǎn)生28 g/L的γ-PGA，在遺傳研究方面，是優(yōu)良的選擇性菌株。綜上所述，通過將外源基因或調(diào)控元件導(dǎo)入到γ-PGA菌株的基因組中，可使菌體濃度、攝氧能力或內(nèi)源合成酶表達水平得到提高，以增加γ-PGA的產(chǎn)量。

4.2 發(fā)酵合成γ-PGA的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件研究

4.2.1 碳源 對于用Bacillus 屬的幾種菌發(fā)酵合成γ-PGA最適碳源多為檸檬酸、甘油、果糖、淀粉、葡萄糖和麥芽糖等。其中不同菌株適用不同的碳源。Bacillus licheniform WBL-3［37］最適碳源為檸檬酸、甘油；Bacillus subtilis NX-2的最適碳源為淀粉和麥芽糖，但它不能利用檸檬酸作為碳源［38］；Bacillus licheniformis ATCC 9945a以最佳碳源為葡萄糖和甘油的組合［39］時，其γ-PGA的產(chǎn)量可達到 20.5 g/L，它也是合成γ-PGA的主要菌株之一。Yao等［40］運用13C核磁共振的方法跟蹤檢測13C標(biāo)記的葡萄糖的結(jié)果表明，葡萄糖作為一種速效碳源，主要是作為菌體生長的營養(yǎng)物質(zhì)，而添加的 L-谷氨酸則被用來合成γ-PGA，對于谷氨酸依賴型的菌株來說是來自外加的谷氨酸，對于非谷氨酸依賴型的菌株來說，其碳源通過內(nèi)循環(huán)能提供合成所需的谷氨酸。大多數(shù)枯草芽孢桿菌以檸檬酸和葡萄糖作為最適宜的碳源，以供合成γ-PGA所需要的能量。就降低合成成本［41］考慮，宜用檸檬酸或葡萄糖作碳源。

4.2.2 氮源 對于Bacillus sp.而言，最適氮源包括有機氮源和無機氮源。無機氮源如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨和尿素等，有機氮源包含豆?jié){、蛋白胨、酵母抽提物、玉米漿、玉米漿干粉、黃豆餅粉和花生餅粉等。無機氮源的組成比較清楚，但是營養(yǎng)成分比較單一；而無機氮源營養(yǎng)比較豐富，含有許多未知的促生長因子，能顯著促進菌體的生長，但是其組成成分不明確。不同的菌青睞不同的氮源。如以豆?jié){作為Bacillus licheniformis ATCC 9945a的氮源，γ-PGA的最高產(chǎn)量可以達到35 g/L［42］；以（NH4）2SO4等作為Bacillus subtilis IFO3335、Bacillus subtilis PGS-1的氮源，在發(fā)酵培養(yǎng)基中額外添加L-谷氨酸能促進γ-PGA的合成，且沒有副產(chǎn)物的產(chǎn)生［43］；用酵母抽提物代替硝酸銨，Bacillus licheniformis CGMCC3336的γ-PGA的產(chǎn)量比之前增加17%［44］。不同氮源對微生物的生長和目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量具有重要的影響，表現(xiàn)為氮源不僅可以通過同化作用轉(zhuǎn)變成微生物自身的組成成分，如重要功能性分子酶類和蛋白質(zhì)等，而且也是某些目標(biāo)產(chǎn)物合成的原料來源，如氨基酸類產(chǎn)物中的氮元素的主要來源。谷氨酸非依賴型菌株雖然γ-PGA產(chǎn)率較低，但由于可用廉價原料代替價格偏高的谷氨酸，因此在工業(yè)合成中有其實際應(yīng)用意義。所以需要根據(jù)不同菌株合理選擇相適應(yīng)的氮源。

4.2.3 金屬離子 某些金屬離子對Bacillus sbutilis 的γ-PGA合成非常重要，K+、Mn2+、Fe3+、Mg2+和Ca2+等金屬離子對枯草芽孢桿菌合成γ-PGA是必須的營養(yǎng)成分之一［45］。低濃度的Mn2+有利于枯草芽孢桿菌自身的生長，進一步提高培養(yǎng)基中Mn2+的濃度，枯草芽孢桿菌的生長反而被抑制，盡管如此，發(fā)酵液中γ-PGA的積累量仍然增加。同時Cromwick等［46］發(fā)現(xiàn)可以通過改變培養(yǎng)基中的Mn2+離子濃度來調(diào)節(jié)某些芽孢桿菌產(chǎn)物γ-PGA的多聚體鏈中D-型或L-型谷氨酸的比例。同樣，培養(yǎng)基中添加Ca2+有利于菌體內(nèi)多肽的合成，其濃度對于菌體活性具有重要的影響作用。在發(fā)酵合成γ-PGA的過程中，Mg2+可能具有控制菌體內(nèi)專一性很強的D-和L-多肽合成酶系統(tǒng)的作用。隨著枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的獲得，金屬離子對γ-PGA發(fā)酵合成的影響作用將會得到進一步深入研究。因此，培養(yǎng)基中金屬離子種類和濃度對γ-PGA的合成具有重要的影響作用。在發(fā)酵合成γ-PGA的過程中有許多酶類參加反應(yīng)，金屬離子對維持這些酶的活性中心構(gòu)象和保持酶活性方面具有重要的作用。

4.2.4 其他培養(yǎng)條件 除了碳源、氮源、金屬離子對γ-PGA合成造成影響外，還有一些鹽類，如NaCl的加入，對其合成有一定的影響。有研究發(fā)現(xiàn)［32］，加入一定濃度的NaCl，可以減小發(fā)酵后期發(fā)酵液的黏度，起到消泡的作用。其原因是加入的NaCl破壞了γ-PGA形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，甚至使γ-PGA的黏彈性完全喪失，從而降低其黏度，但加入的NaCl量太高，會使發(fā)酵液中的滲透壓過高，會導(dǎo)致細胞脫水死亡，影響γ-PGA的產(chǎn)量；另外，培養(yǎng)條件對其γ-PGA合成也有影響，如轉(zhuǎn)速太低，傳質(zhì)不均勻，溶氧不足；轉(zhuǎn)速太高，對菌體產(chǎn)生的剪力越大，會破壞菌體的細胞壁、細胞膜，不利于菌體的生長，進而影響產(chǎn)物的生成［44］，因此需要選擇合適的轉(zhuǎn)速；好氧微生物在生長過程中需要給菌體生長提供足夠的溶氧量，供氧量不足時，好氧微生物會在厭氧條件下，其正常的生理代謝會受到影響［47］；另外，有研究發(fā)現(xiàn)［46］，Bacillus licheniformis ATCC 9945a在pH維持在6.5時γ-PGA生成量最大，而pH小于5.5或大于7.4則γ-PGA生成量顯著下降。培養(yǎng)條件的研究對提高γ-PGA的產(chǎn)量具有重要作用，必須創(chuàng)造適合于菌體產(chǎn)γ-PGA的最佳環(huán)境，才能讓微生物發(fā)酵出更多的γ-PGA。

4.3 合成γ-PGA的發(fā)酵方式研究

發(fā)酵方式有多種，如液體發(fā)酵、固體發(fā)酵、固定化細胞發(fā)酵等。通過微生物的方式發(fā)酵合成γ-PGA，常用的發(fā)酵方式為液體發(fā)酵，Cromwick等［46］以Bacillus licheniformis ATCC 9945a菌株在適宜的條件下液體發(fā)酵γ-PGA，其產(chǎn)量可達到25 g/L。液體發(fā)酵的優(yōu)點是發(fā)酵過程中的參數(shù)容易控制，發(fā)酵周期短，有利于后期分離提取，成本低廉，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。Chen等［48］采用固態(tài)發(fā)酵，其培養(yǎng)成分雞糞、豆餅粉、麥麩用量為1∶1∶0.2，0.5%谷氨酸，0.5%檸檬酸，含水量65%，通過Bacillus subtilis CCTCC202048固體發(fā)酵，可得到42 g/L的γ-PGA。另外，Xu等［49］采用一種新型的有氧植物纖維床生物反應(yīng)器（APFB），對細胞進行固定化發(fā)酵，通過發(fā)酵動力學(xué)進行分析，固定化細胞發(fā)酵表現(xiàn)出更高效的γ-PGA產(chǎn)量，用這個APFB反應(yīng)器進行分批補料發(fā)酵，γ-PGA的產(chǎn)量達到了71.21 g/L。固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵相比，其優(yōu)點是設(shè)備和技術(shù)較簡易，成本、能源消耗低，培養(yǎng)基原料價格低廉、廣泛易得。不足之處是工藝參數(shù)難以控制，發(fā)酵速度慢，周期長，后期分離純化困難，離工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的距離；固定化細胞發(fā)酵，雖然其發(fā)酵γ-PGA的產(chǎn)量比較高，但由于其發(fā)酵設(shè)備及相關(guān)技術(shù)有較高的要求，生產(chǎn)成本高，目前還處于實驗室階段，不適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

綜上所述，影響微生物產(chǎn)γ-PGA的原因，主要包括內(nèi)因（菌株本身的特性）和外因（培養(yǎng)基成分及發(fā)酵方式）兩方面。針對內(nèi)因，可以通過構(gòu)建工程菌，從分子水平上來將菌種改造成合成所需要的高產(chǎn)γ-PGA的菌株；針對外因，可以通過統(tǒng)計學(xué)的方法（如PB設(shè)計，CCD設(shè)計、正交實驗、響應(yīng)面分析等）來進行培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，為微生物提供一個有利于產(chǎn)γ-PGA的環(huán)境，最大限度的使菌株產(chǎn)γ-PGA。另外，改變傳統(tǒng)液態(tài)發(fā)酵方式，改變發(fā)酵設(shè)備等，也能提高γ-PGA的產(chǎn)量。另外，為了能迎合工業(yè)化大生產(chǎn)的需要，不僅是要提高 γ-PGA的產(chǎn)量，而且還要能降低合成成本，合成可采用廉價的原料，如甘蔗、糖蜜［50］、玉米漿干粉、牛糞堆肥、合成味精的殘渣［51，52］等合成γ-PGA。本研究正在從廉價的培養(yǎng)基原料（如玉米漿干粉、糖蜜、黃豆餅粉、麥麩等）著手，其成分為天然的營養(yǎng)成分，營養(yǎng)豐富，價格低廉，適合作為工業(yè)化大生產(chǎn)的原料，通過統(tǒng)計學(xué)的方法，已篩選出最佳培養(yǎng)基配方，γ-PGA的產(chǎn)量可達到50 g/L。

5 展望

γ-PGA最吸引人的特性在于它是水溶性的、無毒、可生物降解、可食用等，這些特性使其有大量潛在的商業(yè)應(yīng)用前景［53］，目前研究得比較熱門的菌株主要是地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniforms）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。而急需解決的是如何降低合成成本、提高PGA的產(chǎn)量、控制產(chǎn)物分子量等。根據(jù)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，γ-PGA的未來研究方向可向這些方面來發(fā)展：尋求廉價的適合工業(yè)化大合成的原料，如玉米漿、黃豆餅粉等；篩選高效高產(chǎn)的優(yōu)良菌株，特別是谷氨酸非依賴型合成菌，并對發(fā)酵條件進行優(yōu)化；通過基因工程的手段，構(gòu)建工程菌，提高菌株本身的合成性能，進而增加γ-PGA的產(chǎn)量。目前，在國外，如日本味之素株式會社利用納豆菌對谷氨酸進行聚合，成功的生成了PGA，已經(jīng)投入到商業(yè)化生產(chǎn)當(dāng)中；Cell Therapeutics公司開發(fā)出了以PGA作為藥物載體，用于治療腫瘤的藥物——PGA-紫杉醇藥物，其產(chǎn)品已經(jīng)在日本、中國臺灣、韓國及亞洲其他國家和地區(qū)上市銷售。而國內(nèi)的研究工作大部分僅限于實驗室，或者只有中小規(guī)模的生產(chǎn)，且偏重于菌種和發(fā)酵工藝，對菌株合成γ-PGA的基因?qū)用?、提取工藝研究相對較少。隨著研究的深入和基因改造手段的成熟，傳統(tǒng)方法對γ-PGA產(chǎn)量的提高越來越有限，而通過對基因和代謝流的改造，如提高關(guān)鍵酶的活性、增加正向調(diào)控蛋白的濃度、敲除γ-PGA的降解基因等，將會扮演越來越重要的角色。本研究組在分子層面，正在進行通過基因同源重組［54，55］的方法，通過氨芐青霉素作為篩選標(biāo)記，敲除枯草芽孢桿菌中的降解酶基因［56］，減少γ-PGA產(chǎn)物的降解，進而提高γ-PGA的得率。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Progresses of Microbial Synthesis of Poly-γ-Glutamic Acid of Related Genes，Synthesis Mechanism and Fermentation

Yan Tao Xi Hongsheng
（Jingsu Hengfengqiang Bio-technology Co.，Ltd，Haimen 226100）

γ-polyglutamic acid（γ-PGA）is naturally occurring poly amino acids with characteristics of water solubility， biodegradability，edible and non-toxicity towards human， animals and the environment. Therefore， γ-Poly（glutamic acid）and its derivatives have been of interest in a broad range of industrial fields such as environment， medicine， food， cosmetics and feed additives. This paper focuses on the microbial synthesis of γ-PGA of related genes， synthesis mechanism and fermentation.

γ-polyglutamic acid；gene；mechanism；fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.004

2014-08-09

嚴濤，男，碩士，研究方向：微生物發(fā)酵；E-mail：yantao2112@126.com