賀元川陳仕江楊勇賀宗毅張德利柴佳炎

（1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065；2. 重慶黔江朵朵潤(rùn)耳責(zé)任有限公司，重慶 409000）

有性雜交選育銀耳優(yōu)良菌株的初步研究

賀元川1陳仕江1楊勇1賀宗毅1張德利1柴佳炎2

（1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065；2. 重慶黔江朵朵潤(rùn)耳責(zé)任有限公司，重慶 409000）

為了解決銀耳栽培生產(chǎn)中存在菌株優(yōu)良性狀單一，生產(chǎn)效率較低等問(wèn)題，采用銀科1#和Tr21兩個(gè)不同品種菌株為親本菌株，通過(guò)單孢子分離選取50個(gè)有性孢子單核體、兩兩配對(duì)有性雜交試驗(yàn)，顯微觀察鏡檢鑒定，統(tǒng)計(jì)雜交成功率為36%、雜交菌株與親本的拮抗試驗(yàn)選育出7株雜交株，栽培對(duì)比農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)選育出1株（GT3）比親本菌株生長(zhǎng)快，生物轉(zhuǎn)化率較高的菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明有性雜交育種可作為一種行之有效的篩選銀耳優(yōu)良菌株的方法。

銀耳；單孢分離；有性雜交；優(yōu)良菌株

銀耳（Tremella fuciformis）又稱白木耳。在真菌分類學(xué)中隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、銀耳綱（Tremellomycetes）、銀耳目（Tremellales）、銀耳科（Tremellaceae）。銀耳是一種藥用價(jià)值極高的藥食真菌，性平、味甘淡、無(wú)毒，具有提高肝臟解毒能力、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力、扶正固本的功效，歷來(lái)是一種高級(jí)滋養(yǎng)補(bǔ)品［1］。銀耳在藥食用菌產(chǎn)量中占重要地位，其栽培業(yè)成為福建古田、四川通江、重慶黔江等地的重要產(chǎn)業(yè)。近年來(lái)由于育種工作選育的滯后，嚴(yán)重影響了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此對(duì)銀耳高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的篩選和選育工作勢(shì)在必行。目前的栽培銀耳品種普遍存在菌種衰退快、產(chǎn)量不高、抗逆性差、適應(yīng)性弱等現(xiàn)象，已嚴(yán)重影響銀耳的產(chǎn)量與品質(zhì)，阻礙了銀耳產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［2］。

藥食用菌的常用育種途徑主要有：野生馴化、孢子分離、雜交育種，其他如原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程育種、誘變育種等新技術(shù)，手段也在不斷的嘗試中。雜交育種自20世紀(jì)80年代以來(lái)，香菇、金針菇、木耳等食用菌新品種都通過(guò)雜交育種，并陸續(xù)投入生產(chǎn)，加快了我國(guó)成為食用菌超級(jí)大國(guó)的步伐。目前雜交育種在食用菌新菌株選育中占有重要的地位，逐漸成為食用菌新品種篩選的有力手段和方法［3］。銀耳屬于雙因子控制的四極性異宗配合菌類，一個(gè)擔(dān)子能產(chǎn)生4個(gè)不同極性的有性孢子，它們之間交配反應(yīng)受兩套因子控制，A（a）和B（b），A因子控制配對(duì)芽孢萌發(fā)管的產(chǎn)生，B因子控制配對(duì)產(chǎn)生的萌發(fā)管是否形成具有鎖狀聯(lián)合的雙核菌絲。只有擔(dān)孢子雜交后獲得AaBb等位基因的雙核菌絲才能成功出耳［4］。但是銀耳育種的報(bào)道有太空育種，誘變育種等，當(dāng)時(shí)僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，由于變異的不定向，不穩(wěn)定導(dǎo)致后期篩選工作繁雜，尚未將穩(wěn)定菌株應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中［5］。雜交育種將親本的優(yōu)良菌株整合到雜交株中，對(duì)于篩選具有多個(gè)優(yōu)良特性的雜交株提供了參考。本研究擬篩選具有優(yōu)良特性的親本菌株，采用單孢子分離、有性孢子雜交育種、顯微鑒別等技術(shù)篩選出雜交菌株，并通過(guò)栽培試驗(yàn)，比較農(nóng)藝性狀等，以進(jìn)一步篩選出具有二者親本優(yōu)良特性的雜交菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 Tr21：子實(shí)體成熟時(shí)耳片舒展，較白，無(wú)小耳蕾，蒂頭黃，耳片下垂，彈性強(qiáng)，菊花形，朵直徑10-14 cm，產(chǎn)量高，單朵鮮重90-150 g，栽培周期35-42 d，抗逆性強(qiáng)，生物轉(zhuǎn)化率約0.93%-1.34%（干重），子實(shí)體形態(tài)見圖1。銀科1#：子實(shí)體成熟時(shí)耳片舒展，米黃色，無(wú)小耳蕾，蒂頭黃，耳片肥厚，彈性強(qiáng)，牡丹花形，朵型圓整，直徑10-15 cm，產(chǎn)量較高，單朵鮮重90-120 g，栽培周期33-40 d，生物轉(zhuǎn)化率0.93%-1.25%（干重），子實(shí)體形態(tài)見圖2。

圖1 Tr21菌株子實(shí)體

圖2 銀科1#菌株子實(shí)體

1.1.2 培養(yǎng)基配方

1.1.2.1 PDA培養(yǎng)基（1 L） 去皮土豆200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂20 g，硫酸鎂3 g，磷酸二氫鉀2 g，pH5.2-5.8。

1.1.2.2 CM培養(yǎng)基（1 L） 香灰木屑100 g，去皮土豆200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂15-18 g，硫酸鎂3 g，磷酸二氫鉀2 g，pH5.2-5.8。

1.1.2.3 栽培種培養(yǎng)基 青杠木屑78%，麩皮20%，蔗糖1%，石膏1.2%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.2%，水分65%。

1.1.2.4 栽培袋培養(yǎng)基 棉耔殼83.5%，麩皮15%，石膏1.5%，蔗糖1%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.2%，水65%。

1.2 方法

1.2.1 單孢子分離 選取發(fā)育健壯，無(wú)病蟲害的成熟的耳片，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌水充分洗滌，然后用無(wú)菌濾紙吸干水分，采用鉤懸法在小三角瓶?jī)?nèi)收集孢子。取少量無(wú)菌水至三角瓶中，充分混勻，計(jì)數(shù)，梯度稀釋至10-5/mL，從各梯度中分別吸取150 μL孢子懸浮液于CM平板上面并涂布均勻，于25℃恒溫培養(yǎng)7-10 d，挑選萌發(fā)菌絲的菌落鏡檢，觀察有無(wú)鎖狀聯(lián)合，挑取單孢子萌發(fā)的菌落用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 雜交配對(duì) 隨機(jī)挑取銀科1#和Tr21菌株的單孢子兩兩配對(duì)雜交，在同一CM平板上相距0.5 cm接種，于25℃下培養(yǎng)，當(dāng)兩種單核菌絲接觸萌發(fā)菌絲后鏡檢，有鎖狀聯(lián)合的菌絲表明配對(duì)成功，將其挑至斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)后備用。

1.2.3 拮抗試驗(yàn) 在PDA培養(yǎng)基平板內(nèi)，采用三點(diǎn)接種法分別接種2個(gè)親本菌株與雜交新菌株。每2點(diǎn)間隔1 cm，接種后25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察記錄各菌株間拮抗?fàn)顩r。

1.2.4 酶活力的測(cè)定 按照上述培養(yǎng)料的配方，采用常規(guī)方法進(jìn)行栽培種的培養(yǎng)，測(cè)定雜交菌株與對(duì)應(yīng)香灰菌配比后長(zhǎng)滿瓶是白毛團(tuán)和混合菌絲的纖維素酶，漆酶，多酚氧化酶的活力。分別在菌種瓶中間均勻取白毛團(tuán)和混合菌絲各5 g（鮮重），加入25 mL蒸餾水并攪勻，浸提2 h后進(jìn)行抽濾，抽濾后的溶液即為菌絲粗酶液。酶活力測(cè)定的具體原理和方法參照施特爾馬赫B著、錢嘉淵譯的《酶的測(cè)定方法》［6］。

1.2.5 栽培對(duì)比試驗(yàn) 將雜交菌株與親本進(jìn)行栽培對(duì)比試驗(yàn)，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3袋，每袋干料300 g，測(cè)定各菌株的子實(shí)體產(chǎn)量，培養(yǎng)周期，計(jì)數(shù)生物學(xué)效率，對(duì)每個(gè)菌株的子實(shí)體隨機(jī)取樣，測(cè)定各個(gè)菌株的鮮重和子實(shí)體形態(tài)特征，以篩選出優(yōu)于親本的優(yōu)良菌株。

2 結(jié)果

2.1 單孢子分離結(jié)果

圖3顯示了單孢子分離平板生長(zhǎng)情況，早期萌發(fā)菌絲鏡檢可發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合；前期似酵母樣的菌落，后期逐漸萌發(fā)菌絲，無(wú)鎖狀聯(lián)合，熒光顯微觀察，酵母樣菌落為單核細(xì)胞，被確定為單孢子萌發(fā)菌絲。早期萌發(fā)的菌落可能是親本孢子液體涂布沒(méi)有完全分離所致，形成雙核菌絲以及具有鎖狀聯(lián)合特征。

圖3 單孢子分離試驗(yàn)結(jié)果

2.2 單孢子配對(duì)試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)雜交株具有雙核菌絲和鎖狀聯(lián)合特征，以及雙核菌絲和單核菌絲萌發(fā)速度的差異，借助顯微鏡鏡鏡檢鑒定，共篩選出18株雜交菌株，有性雜交成功率達(dá)到36%。根據(jù)銀耳的雙因子四極性特點(diǎn)，尚未配對(duì)的菌株是因?yàn)榕鋵?duì)中缺乏完全配對(duì)的因子，導(dǎo)致無(wú)法萌發(fā)出雙核，鎖狀聯(lián)合的菌絲［4］。

2.3 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

18株雜交菌株與親本拮抗試驗(yàn)的結(jié)果顯示，其中7株雜交菌株與2個(gè)親本存在明顯的拮抗線，11株無(wú)顯著的拮抗線。拮抗線是不親和的菌株共同培養(yǎng)是在交界處形成的隔離，阻礙遺傳上明顯不同的菌株融合，保持了個(gè)體遺傳上的獨(dú)立和穩(wěn)定。雜交菌株與親本菌株之間形成拮抗線表明遺傳物質(zhì)差異較大，則可能為篩選的新品種［7］。將有明顯拮抗線的雜交菌株依次編號(hào)GTi（i=1，2，3……），轉(zhuǎn)管備用。

2.4 雜交菌株的酶活力測(cè)定結(jié)果

將7株菌株分別與親本的香灰菌配對(duì)制備銀耳栽培種，當(dāng)栽培種生長(zhǎng)完成時(shí)，測(cè)定白毛團(tuán)的纖維素酶活力和香灰菌絲的漆酶和多酚氧化酶活力，同時(shí)接種至栽培袋進(jìn)行栽培對(duì)比試驗(yàn)。表1顯示不同雜交菌株的酶活力，其中GT1、GT6、GT7菌株的纖維素酶活力介于親本之間，GT4比兩個(gè)親本的酶活力都低，GT2、GT3、GT5纖維素酶的活力略高于親本，由此可見，有性雜交并不是簡(jiǎn)單的遺傳物質(zhì)的組合。漆酶和多酚氧化酶的活力與對(duì)應(yīng)親本的酶活力進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，其值均大于0.05，無(wú)顯著差異。

2.5 栽培試驗(yàn)比較結(jié)果

7株雜交菌株與2親本進(jìn)行了小規(guī)模的栽培對(duì)比試驗(yàn)，測(cè)定了栽培種酶活力，統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)周期，單朵直徑，耳片情況，單朵直徑、鮮重和生物學(xué)效應(yīng)等農(nóng)藝性狀，表2顯示了相關(guān)數(shù)據(jù)信息。整理數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)雜交菌株GT3的鮮重，耳片展片完全，彈性較好，生長(zhǎng)周期較短，抗污染能力較好，鮮重和轉(zhuǎn)化率與親本相比略高；其余菌株有的生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，生物學(xué)效率降低，為表現(xiàn)出親本各自的優(yōu)勢(shì)。GT3可能具備開發(fā)為優(yōu)良菌株的潛力，該菌株的穩(wěn)定性還需進(jìn)一步的證實(shí)。

表2 雜交菌株栽培對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)完成了銀耳有性孢子分離，配對(duì)篩選，從50個(gè)單孢子菌落配對(duì)僅僅獲得18個(gè)菌株，在18個(gè)菌株種僅7個(gè)雜交菌株和親本菌株有明顯的拮抗現(xiàn)象，表明此雜交菌株與親本菌株遺傳物質(zhì)具有明顯區(qū)別，有可能為選育的新品種［8］。栽培種酶活力測(cè)定結(jié)果顯示，某些菌株纖維素酶活力較親本強(qiáng)，多數(shù)介于二者之間，少數(shù)低于親本。從栽培試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)纖維素酶活力高，生長(zhǎng)周期相對(duì)縮短，漆酶、多酚氧化酶活性相對(duì)變化較小，但是活力高，提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能較多，對(duì)生物學(xué)效率提供具有一定的意義［9-11］。綜合栽培時(shí)間、生物轉(zhuǎn)化率等農(nóng)藝學(xué)參考因子，GT3雜交菌株具有生長(zhǎng)周期短，生物轉(zhuǎn)化率高和抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特征，該雜交菌株與兩種香灰菌株均可配對(duì)，關(guān)于該菌株的穩(wěn)定性、是否能優(yōu)良菌株應(yīng)用于生產(chǎn)還需要進(jìn)一步試驗(yàn)［12，13］。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)銀耳有性孢子的分離、有性孢子雜交育種、農(nóng)藝性狀的評(píng)價(jià)等篩選出一株具有生長(zhǎng)周期短，生物轉(zhuǎn)化率高，抗逆性強(qiáng)的雜交菌株。該菌株與親本有明顯的拮抗現(xiàn)象，酶活力較親本縮短。

［1］ 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草［M］.上海：上?？萍汲霭嫔纾?1998：515-519.

［2］ 彭衛(wèi)紅、王勇、黃忠乾， 等. 我國(guó)銀耳研究現(xiàn)狀與存在問(wèn)題［J］.食用菌基礎(chǔ)， 2005， 12（1）：51-56.

［3］付立忠、吳學(xué)謙， 魏海龍， 等.我國(guó)食用菌育種技術(shù)應(yīng)用研究現(xiàn)狀與展望［J］.食用菌學(xué)報(bào)， 2005， 12（3）：63-68.

［4］陳明， 陳立國(guó)， 汪國(guó)蓮. 銀耳極性測(cè)定的初步研究［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2000， 19（2）：138-141.

［5］劉佳. 通江銀耳乘“神八”育種是否成功需要3年驗(yàn)證［N］.四川日?qǐng)?bào)， 2011-11-22（21302）.

［6］ 施特爾馬赫（German ）（錢嘉淵譯）. 酶的測(cè)定方法［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社， 1992：10-280.

［7］ 陳絹， 蘇開美.食用菌遺傳育種與種質(zhì)鑒定研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)食用菌， 2008（5）：3-7.

［8］ 張樹強(qiáng)， 衛(wèi)彩紅， 胡建偉.雞腿菇單孢分離與單孢雜交的研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 49（1）：190-194.

［9］ 溫志強(qiáng)， 白盛鎮(zhèn)， 鄧優(yōu)錦. 不同菌齡銀耳菌種的酶活力測(cè)定［J］.食藥用菌， 2011， 4：25-27.

［10］戴維鴻， 戴維浩.銀耳不同菌齡的菌種對(duì)產(chǎn)量與品質(zhì)的影響試驗(yàn)［J］. 食藥用菌， 2010， 4：28-29.

［11］ 賀元川， 陳仕江， 楊勇， 等.香灰菌傳代對(duì)銀耳栽培的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 42（4）：201-202.

［12］ 鄧優(yōu)錦， 王慶福， 劉福陽(yáng)，等.不同香灰菌與銀耳的配對(duì)研究［J］.食藥用菌， 2012， 20（1）：25-27.

［13］張漢文.淺談提升銀耳菌種穩(wěn)定性及其技術(shù)線路的探討［C］.國(guó)際食（藥）用菌生物科學(xué)高峰論壇暨第二屆中國(guó)（古田）食用菌節(jié)-紀(jì)念中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)成立二十周年論文集， 137-138.

（責(zé)任編輯 李楠）

Sexual Hybridization Breeding Selection for Good Quality Strain of Tremella fuciformis

He Yuanchuan1Chen Shijiang1Yang Yong1He Zongyi1Zhang Deli1Chai Jiayan2
（1. Chongqing Academy of Chinese Material Medica，Chongqing 400065；2. Chongqing Duoduoruner Co.，Ltd，Chongqing 409000）

During the process of Tremella fuciformis cultivation， some problems， such as low yield and long cultivation time， often are followed with different strains. The aim of this study is to mix good properties of different strain together to new strains by sexual hybridization method. Based comparison of yield， fresh ear ventral color and mature culture， yinke 1#and Tr21 were selected as parents strains with good properties. 50 single spores were isolated from fresh ear and partnered each other following single hybridization principle. 17 combinations are identified with an optical microscope examination and 7 genetic characteristics of hybrid strains are different from parent strains by Antagonism experiment. The results of agronomic traits comparison showed that cultivation period， diameter and the yield of hybrid strains GT3are significantly different from the parents， and the production has exceeded the parent strains more than 3%. GT3can be used as an excellent hybrid strains reserves and has the potential to develop into a new species. Sexual hybridization breeding would be effective way to select good quality strain.

Tremella fuciformis；single spore isolation；sexual hybridization；good quality strain

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.022

2014-08-21

重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目（JA-12-21-1）

賀元川，女，碩士，助理研究員，研究方向：藥食用菌培養(yǎng)及活性物質(zhì)；E-mail：heyuanchuan@126.com

陳仕江，男，研究員，研究方向：藥食用菌的培植；E-mail：shijiangchen@163.com