王宇吳高吉羅曼彭傳林修江帆尚小麗吳建偉

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004；2.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽 550004）

家蠅Thymosin（THY）基因的克隆及原核表達(dá)

王宇1、2吳高吉1羅曼1彭傳林1修江帆1尚小麗1吳建偉1

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004；2.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽 550004）

采用EST測(cè)序技術(shù)從構(gòu)建的家蠅（Musca domestica）幼蟲cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中篩選到胸腺肽（Thymosin，THY）基因，以該基因的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增，測(cè)序鑒定，獲得THY基因完整編碼序列。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因及其編碼蛋白的基本理化性質(zhì)、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。構(gòu)建pET-28a（+）-THY重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。研究結(jié)果表明，THY基因ORF全長(zhǎng)384 bp，編碼127個(gè)氨基酸，理論分子量14.3 kD，等電點(diǎn)為5.22，具有THY家族的蛋白保守結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建重組原核質(zhì)粒pET-28a（+）-THY，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，蛋白在大腸桿菌中獲得表達(dá)，經(jīng)親和層析柱純化獲得目的蛋白，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純化的目的蛋白大小正確。

家蠅；胸腺肽；克?。辉吮磉_(dá)

胸腺肽THY超家族（Thymosin superfamily）蛋白屬于保守的假想蛋白，迄今為止已經(jīng)在果蠅（Drosophila melanogaster）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、家蠶（Bombyx mori）等昆蟲物種中發(fā)現(xiàn)含THY保守結(jié)構(gòu)域的序列［1-3］。THY蛋白保守區(qū)序列與β族胸腺素（β-Thymosin，Tβ）有較高的同源性，Tβ是一種多功能分子，在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、組織再生、抗細(xì)胞凋亡和抗炎癥等方面起到重要作用［4］。Tβ含有一個(gè)WH2結(jié)構(gòu)域，為一個(gè)actin單體結(jié)合位點(diǎn)，含有WH2結(jié)構(gòu)域的蛋白廣泛存在于各物種中，屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)中發(fā)揮多樣調(diào)節(jié)作用［5，6］。在與肌動(dòng)蛋白結(jié)合過程中，Tβ會(huì)改變構(gòu)象，有利于識(shí)別分子靶標(biāo)，可與免疫和細(xì)胞生長(zhǎng)的級(jí)聯(lián)信號(hào)間相互傳遞信息［7，8］。通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)結(jié)構(gòu)使得肌動(dòng)蛋白骨架處在不斷重塑的過程中，進(jìn)而在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力、成纖維細(xì)胞遷移、內(nèi)吞作用中發(fā)揮重要作用［9］。對(duì)家蠶THY的研究中發(fā)現(xiàn)其通過結(jié)合肌動(dòng)蛋白在參與調(diào)節(jié)家蠶形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變和生理功能的形成過程中起到重要的作用［1］。

家蠅呈世界性分布，是重要的媒介昆蟲，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，有強(qiáng)大的先天性免疫系統(tǒng)及生長(zhǎng)代謝調(diào)節(jié)功能。目前關(guān)于家蠅生長(zhǎng)代謝發(fā)育調(diào)節(jié)基因的研究鮮有報(bào)道，同時(shí)未見家蠅THY基因的研究。本研究通過構(gòu)建pET-28a（+）-THY原核表達(dá)載體，并對(duì)其原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化獲得THY蛋白質(zhì)，旨在為進(jìn)一步研究家蠅THY蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試蟲、載體和菌株 家蠅3齡幼蟲由貴陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度28℃，相對(duì)濕度65%，光照周期10L∶14D。pET-28a（+）質(zhì)粒，大腸桿菌BL21（DE3）由貴陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒（RNAiso PLUS）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA標(biāo)志物（DL2000 DNA Marker）、瓊脂糖等購(gòu)置于TaKaRa公司；蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司；Ni-NTA Agarose 購(gòu)自Merk公司；一抗兔抗His-Tag單克隆抗體、二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgA抗體、DAB顯色試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司，其余所用的化學(xué)試劑（無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇等）均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 THY基因的生物信息學(xué)分析 通過NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.blastX）獲取家蠅（Musca domestica XP_005179401.1）；果蠅（Drosophila melanogaster NP_525065.1）；埃及伊蚊（Aedes aegypti XP_00-1663844.1）；家蠶（Bombyx mori NP_001103818.1）；地中海實(shí)蠅（Ceratitis capitata XP_004527242.1）的THY同源蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)，分析該基因蛋白的氨基酸序列與其他蛋白質(zhì)氨基酸序列的相似性，判斷其是否為全長(zhǎng)基因等；用 DNAclub軟件分析cDNA 序列和開放閱讀框；運(yùn)用Signal P分析信號(hào)肽序列；運(yùn)用PHD的在線分析工具分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域；利用蛋白分析專家系統(tǒng)（Expert protein analysis system，ExPASy）的在線分析軟件Protparam，分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的氨基酸殘基性質(zhì)、分子量及理論等電點(diǎn)等［10］。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 總RNA的抽提按照TaKaRa公司的RNAiso PLUS說明書進(jìn)行操作。總RNA經(jīng)電泳檢測(cè)，GeneQuant公司核酸定量分析儀測(cè)定A260/A280比值及濃度，選取A260/A280比值范圍為1.8-2.0的樣本，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)合成、基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank登錄號(hào)：用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)引物THY-F：5'-CGCGAATTCATGGCTGCACCTGCTCTT-3'，帶EcoR I酶切位點(diǎn)；THY -R：5'-CGCCTCGAGTTAACCTCTCTTTTCTTCCTCG-3'，帶XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以cDNA為模板，應(yīng)用上述設(shè)計(jì)的特異引物擴(kuò)增目的基因，PCR 產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收、測(cè)序鑒定。

1.2.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將PCR產(chǎn)物膠回收后和原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a（+）用EcoR I和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切后回收，連接、轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21/DE3感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽性單克隆，提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序鑒定后進(jìn)行原核表達(dá)。

1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blot鑒定 挑取含有pET-28a（+）-THY重組質(zhì)粒的 E.coli BL21/ DE3 的單菌落接種于含卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中（空質(zhì)粒pET-28a（+） 的 BL21/DE3作為陰性對(duì)照），放入37℃搖床，搖至OD600約為0.6 時(shí)，取1 mL作為誘導(dǎo)前樣品，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，5 h后所有樣品離心后收集菌體處理后離心取上清行SDS-PAGE電泳分析。依據(jù)上述誘導(dǎo)表達(dá)方法對(duì)陽性克隆進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，冰上超聲裂解后離心收集上清并過濾，參照Ni-IDA Agarose說明書進(jìn)行蛋白純化，收集蛋白洗脫液，SDS-PAGE電泳分析目的蛋白，將洗脫的蛋白經(jīng)超濾管（分子截留為10 kD）離心濃縮目的蛋白，超濾后的蛋白-80℃保存?zhèn)溆?。通過Western blot檢驗(yàn)重組目的蛋白，用5%脫脂奶粉4℃過夜封閉；TBST沖洗，加入1∶500稀釋的抗His標(biāo)簽的抗體（一抗），室溫孵育2 h；TBST沖洗后加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（二抗），室溫孵育1 h［11］。采用DAB顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 家蠅THY基因的生物信息學(xué)分析

通過生物信息學(xué)分析，該cDNA序列ORF長(zhǎng)為384 bp，編碼127個(gè)氨基酸（圖1）。其含有一個(gè)能夠識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)的保守短基序LKHTET，該基序在哺乳動(dòng)物及家蠶THY的研究中證實(shí)與肌動(dòng)蛋白結(jié)合關(guān)系較密切。預(yù)測(cè)家蠅THY蛋白的理論分子量為14.3 kD，等電點(diǎn)為5.22，屬于酸性蛋白質(zhì)。多重序列比對(duì)結(jié)果分析顯示，家蠅THY與其他物種來源的THY氨基酸序列同源性較高（與果蠅為82%，埃及伊蚊為70%，家蠶為74%，地中海實(shí)蠅為84%），均具有3個(gè)保守的Thymosin 超家族結(jié)構(gòu)域（圖2）。在哺乳細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)的半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌中體內(nèi)表達(dá)的半衰期分別大于20 h和10 h。在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為46.63，預(yù)測(cè)在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)71.57，總親水性平均系數(shù)GRAVY -0.993，蛋白質(zhì)總體疏水性系數(shù)低。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示無信號(hào)肽。

圖1 THY基因開放閱讀框cDNA序列及對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸序列

圖2 不同物種來源的THY氨基酸序列比對(duì)分析

2.2 原核重組質(zhì)粒的鑒定

將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果（圖3）顯示約380 bp處有一清晰的條帶，與目的基因的大小基本相符，測(cè)序證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 蛋白表達(dá)、純化及鑒定

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21/DE3中表達(dá)，15% SDS-PAGE電泳分析結(jié)果（圖4第4、5泳道）所示，大約在18 kD（與His標(biāo)簽約4 kD融合后）左右處出現(xiàn)表達(dá)條帶，將蛋白純化后超濾濃縮，結(jié)果如第7泳道所示，證明目的蛋白純化成功。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后純化的融合蛋白做Western blot驗(yàn)證，用DAB法在PVDF膜上顯色，結(jié)果顯示目的條帶單一且清晰，說明目的蛋白表達(dá)正確。蛋白濃度測(cè)定為0.35 mg/mL。

3 討論

昆蟲THY是一個(gè)多功能分子，具有創(chuàng)傷修復(fù)、、組織再生，通過結(jié)合肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)昆蟲的生理功能及形態(tài)結(jié)構(gòu)，其序列具有高度保守性。對(duì)家蠶THY的研究發(fā)現(xiàn)其具有結(jié)合肌動(dòng)蛋白進(jìn)而影響家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的功能，同時(shí)其在體內(nèi)的調(diào)節(jié)作用較強(qiáng)，是機(jī)體能夠維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子［1］。

圖3 重組質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定

圖4 THY重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

本研究從家蠅幼蟲cDNA文庫(kù)［12］中篩選到THY基因序列，全長(zhǎng)384 bp，編碼127個(gè)氨基酸，理論分子量為14.3 kD，等電點(diǎn)為5.22，屬于酸性蛋白質(zhì)。通過結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示家蠅THY蛋白中含有3個(gè)Thymosin的功能域，屬于THY超家族。為進(jìn)一步了解該蛋白的特性，將目的基因克隆入pET-28a（+）載體，構(gòu)建pET-28a（+）-THY重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到相對(duì)分子質(zhì)量約為18 kD的重組胸腺肽，并通過Western blot驗(yàn)證顯示純化后的蛋白與目的蛋白大小一致。

Tβ中與肌動(dòng)蛋白結(jié)合關(guān)系極為密切的六肽基序LKKTET在整個(gè)家族蛋白中很保守，這段序列扮演著識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)的重要角色［13-16］。在家蠅THY和其他物種的THY蛋白結(jié)構(gòu)域中也發(fā)現(xiàn)這樣的保守的序列（圖2已標(biāo)注出六肽基序所在區(qū)，在昆蟲中多為L(zhǎng)KHTET），推測(cè)在家蠅體內(nèi)該基序也具有結(jié)合肌動(dòng)蛋白的功能，通過阻斷該位點(diǎn)與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合有可能控制家蠅生長(zhǎng)發(fā)育，從而為家蠅的防治提供新靶點(diǎn)。與THY高度同源的Tβ功能研究中也是圍繞其與肌動(dòng)蛋白的關(guān)系展開的，研究顯示Tβ與免疫調(diào)節(jié)，腫瘤發(fā)生，細(xì)胞遷移，血管生存，創(chuàng)傷愈合等有密切關(guān)系的生物學(xué)活性［17］，這些研究結(jié)果為下一步家蠅THY的功能研究提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆了家蠅THY基因，全長(zhǎng)384 bp，編碼127個(gè)氨基酸，成功構(gòu)建pET-28a（+）-THY重組質(zhì)粒并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，親和層析法純化了目的蛋白THY，繼而用Western blot驗(yàn)證獲得的目的蛋白。

［1］ Zhang WP， Zhang CR， Lv ZB， et al. Molecular characterization，tissue distribution， subcellular localization and actin-sequestering function of a thymosin protein from silkwom［J］. PLoS ONE， 2012，7（2）：e31040.

［2］Clark AG， Eisen MB， Smith DR， et al. Evolution of genes and genomes on the Drosophila phylogeny［J］. Nature， 2007， 450：203-218.

［3］Holt RA， Subramanian GM， Halpern A， et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae［J］. Science， 2002，298：129-149.

［4］丁大有， 馬素永， 許松山， 等. 胸腺素β4與藥物開發(fā)［J］. 生命的化學(xué)， 2012， 32（1）：67-71.

［5］Paunola E， Mattila PK， Lappalainen P. WH2 domain：a small，versatile adapter for actin monomers［J］. FEBS Lett， 2002， 513（1）：92-97.

［6］Koshikawa S， Cornette R， Matsumoto T， et al. The homolog of Ciboulot in the termite（Hodotermopsis sjostedti）：a multimeric β-thymosin involved in soldier-specific morphogenesis［J］. BMC Developmental Biology， 2010， 10：63.

［7］Dedova IV， Nikolaeva OP， Safer D， et al. Thymosin beta4 induces a conformational change in actin monomers［J］. Biophys J， 2006， 90（3）：985-992.

［8］Irobi E， Aguda AH， Larsson M， et al. Structural basis of actin sequestration by thymosin-β4：implications for WH2 proteins［J］. EMBO J， 2004， 23（18）：3599-3608.

［9］Dominguez R. The beta-thymosin/WH2 fold：multifunctionality and structure［J］. Ann NY Acad Sci， 2007， 111（2）：86-94.

［10］國(guó)果， 吳沁怡， 吳建偉， 等. 家蠅泛素結(jié)合酶基因的生物信息學(xué)分析［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2014（2）：107-111.

［11］ 劉小寧， 李芬， 趙文博， 等. 棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）FK506結(jié)合蛋白基因的克隆、表達(dá)與純化［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2014（4）：115-120.

［12］劉紅美， 張潔， 王贇， 等. 熱脅迫后家蠅幼蟲cDNA文庫(kù)構(gòu)建與隨機(jī)EST測(cè)序分析［J］. 免疫學(xué)雜志， 2010， 9：772-775.

［13］Aguda AH， Xue B， Trobi E， et al. The structural basis of actin interaction with multiple WH2/beta-thymosin motif-containing proteins［J］. Structure， 2006， 14（3）：469-476.

［14］Dhaese S， Vandepoele K， Waterschoot D， et al. The mouse thymosin beta15 gene family displays unique complexity and encodes a functional thymosin repeat［J］. J Mol Biol， 2009， 387：809-825.

［15］Zoubek RE， Hannappel E. Subcellular distribution of thymosin beta4［J］. Ann NY Acad Sci， 2007， 1112：442-450.

［16］Rossenu S， Leyman S， Dewitte D， et al. A phage display based method for determination of relative affinities of mutants，application of the actin-binding motifs in thymosin beta 4 and the villin headpiece［J］. J Biol Chem， 2003， 278（19）：16642-16650.

［17］王春卉， 宋海峰， 劉秀文. β族胸腺素研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)新藥雜志， 2006， 15（8）：580-584.

（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Prokaryotic Expression of Musca domestica Thymosin Gene

Wang Yu1，2Wu Gaoji1Luo Man1Peng Chuanlin1Xiu Jiangfan1Shang Xiaoli1Wu Jianwei1
（1. Basic Medical College，Guiyang Medical College，Guiyang 550004；2. Guizhou Provincial Center for Disease Control Prevention，Guiyang 550004）

In order to clone and analyze the prokaryotic expression of thymosin gene from Musca domestica， the thymosin gene which was isolated from Musca domestica cDNA library， was analyzed by the bioinformatics methods in the following aspects， including general physical and chemical properties， signal peptide and subcellular localization. The expression construct pET-28a（+）-THY was preformed. The open reading frame of the thymosin gene was 384 bp that encoded a putative protein with 127 amino acids. The protein with predicted molecular weight 14.3 kD and pI of 5.22， has the conserved thymosin domain that belongs to thymosin family. The result showed that the recombinant prokaryotic expression vector pET-28a （+）-THY was successfully constructed and fusion protein was expressed in E. coli. SDS-PAGE and Western blot analysis indicated that the fusion protein that purified using Ni2+affinity chromatography had the predicted size.

Musca domestica；thymosin；cloning；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.021

2014-07-01

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAC06B12），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81360254）

王宇，男，博士研究生，研究方向：昆蟲分子生物學(xué)；E-mail：wangzhongyuwy@163.com

吳建偉，男，博士，研究方向：昆蟲免疫學(xué)及生物活性物質(zhì)利用；E-mail：wjw@gmc.edu.cn