梁春花劉霞孫雪婧羅玉柱高雪晉杜曉華

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；3. 甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

甘肅河西地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的遺傳變異研究

梁春花1，3劉霞2，3孫雪婧1，3羅玉柱3高雪晉2杜曉華1，3

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；3. 甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

旨在對(duì)甘肅河西的臨澤、甘州、武威、金昌、高臺(tái)5個(gè)地區(qū)283頭西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的遺傳多態(tài)性及變異特征進(jìn)行系統(tǒng)分析，采用PCR-SSCP方法檢測(cè)了283頭西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子和部分內(nèi)含子的多態(tài)性，且對(duì)群體內(nèi)各等位基因進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果顯示，5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群共檢測(cè)出5個(gè)等位基因（A、B、C、D、E），表現(xiàn)為5種基因型（AA、AB、AC、AD、AE）。其中甘州、武威、金昌西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因均只檢測(cè)到AA、AB 2種基因型，高臺(tái)西門(mén)塔爾雜交類群檢測(cè)到AA、AE 2種基因型，臨澤西門(mén)塔爾雜交類群檢測(cè)到AA、AB、AC、AD 4種基因型。A等位基因和AA基因型的頻率在5個(gè)群體中最高，為優(yōu)勢(shì)基因和優(yōu)勢(shì)基因型。對(duì)不同SSCP帶型的對(duì)應(yīng)片段進(jìn)行測(cè)序分析，共發(fā)現(xiàn)6個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)（75 bp C→T，78 bp C→G，128 bp G→A，214 bp G→A，232 bp C→T，233 bp G→A），其中第75 bp和第78 bp處的突變位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域，其余4處突變位點(diǎn)均位于外顯子區(qū)域。第214 bp處的核苷酸突變導(dǎo)致甘氨酸（Gly）突變?yōu)榻z氨酸（Ser），第232 bp處核苷酸突變導(dǎo)致精氨酸（Arg）突變?yōu)樯彼幔═rp），第233 bp處核苷酸突變導(dǎo)致精氨酸（Arg）突變?yōu)楣劝滨０罚℅ln），經(jīng)χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，5個(gè)地區(qū)的西門(mén)塔爾雜交類群在此3個(gè)突變位點(diǎn)上都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。群體遺傳學(xué)分析結(jié)果表明，臨澤、甘州、武威、金昌、高臺(tái)西門(mén)塔爾雜交類群的多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.0582、0.0196、0.0196 、0.0161、0.0159，均屬于低度多態(tài)（PIC＜0.25）。

西門(mén)塔爾雜交類群；NGB基因；外顯子；遺傳變異

2000年德國(guó)科學(xué)家Burmester等［1］首次在Nature上報(bào)道人和小鼠腦內(nèi)存在第3種攜氧球蛋白——腦紅蛋白（neuroglobin，NGB）。此后，科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)NGB存在于各種哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、爬蟲(chóng)類、兩棲類、魚(yú)類等。NGB主要在腦組織中表達(dá)，能夠可逆地結(jié)合氧，從而特異性地向腦組織供氧。缺氧能夠誘導(dǎo)NGB的表達(dá)，而高表達(dá)的NGB則能夠保護(hù)神經(jīng)元免受缺氧損傷，從而在神經(jīng)系統(tǒng)缺氧/缺血損傷中具有重要的神經(jīng)保護(hù)功能，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)［2-5］，但有關(guān)NGB作用的生理機(jī)制仍不明確。

西門(mén)塔爾牛原產(chǎn)于瑞士西門(mén)山谷地帶（Simon Valley），其屬大型乳、肉、役兼用品種，是世界第二大牛種。甘肅河西地區(qū)自1980年開(kāi)始引用西門(mén)塔爾牛凍精進(jìn)行雜交改良本地黃牛的產(chǎn)肉產(chǎn)奶性能［6］，通過(guò)30多年持續(xù)不斷地級(jí)進(jìn)改良和導(dǎo)入選育，基本形成了適應(yīng)甘肅河西地區(qū)的西門(mén)塔爾雜交類群。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)NGB基因的研究多見(jiàn)于人和大鼠，對(duì)牦牛、藏羚羊、高原兔、藏雞等也都有相關(guān)的研究［7-13］，但有關(guān)西門(mén)塔爾牛NGB基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用PCR-SSCP方法，對(duì)甘肅河西地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的遺傳變異規(guī)律進(jìn)行了研究，其結(jié)果能夠?yàn)檫M(jìn)一步了解西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因的遺傳特性提供有價(jià)值的理論依據(jù)，對(duì)于探討NGB基因在缺氧/缺血狀態(tài)下的保護(hù)性生理機(jī)制也具有一定的理論與實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物血樣 隨機(jī)選取甘肅河西5個(gè)地區(qū)共283頭西門(mén)塔爾雜交類群。其中，臨澤地區(qū)50頭（臨澤縣位于甘肅省河西走廊中部，海拔1380-2 278 m）、甘州地區(qū)50頭（甘州區(qū)位于甘肅省河西走廊中部，平均海拔1 474 m）、武威地區(qū)60頭（武威市位于河西走廊東端，海拔1 440-3 263 m）、金昌地區(qū)61頭（金昌市位于甘肅省河西走廊東端，海拔1 500-4 442 m）、高臺(tái)地區(qū)62頭（高臺(tái)縣位于甘肅省河西走廊中部，黑河終段下游，海拔1 260-3 140 m），頸靜脈采血10 mL，ACD（酸性檸檬酸葡萄糖）法抗凝，-70℃凍存。

1.1.2 試劑與儀器 蛋白酶K、Tris平衡酚購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自Amersco公司；過(guò)硫酸銨購(gòu)自煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；去離子甲酰胺、TEMED購(gòu)自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；2×Power Taq PCR Master Mix購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)公司；Accurate Run 100 bp-I DNA ladder購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

移液槍購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；梯度PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；DYY-11電泳儀、DYCP-31DN水平電泳槽購(gòu)自北京六一儀器廠；A-6030凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自韓國(guó)BIONEER公司；PROTEAN Ⅱ xi Cell雙垂直電泳槽、042BR10095 PowerPac Universal電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；F12加熱/制冷循環(huán)儀購(gòu)自德國(guó)JULABO公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 用常規(guī)酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 參考GenBank中普通牛NGB基因序列（登錄號(hào)：AC_000167.1），用Primer 3.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的引物，上游引物：5'-ACACAGGCTGCCTTTTGTCT-3'、下游引物：5'-GGGAGAGATGAACAGGTGGA-3'，預(yù)擴(kuò)增片段大小約為356 bp，包括兩端的部分內(nèi)含子區(qū)域，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 7.4 μL，上游和下游引物各0.4 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 11 μL，模板DNA 0.8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min，-4℃保存。PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR-SSCP分析 取2 μL的PCR產(chǎn)物加入8 μL的上樣緩沖液（980 mL/L去離子甲酰胺，0.25 g/L溴 酚 藍(lán)，0.25 g/L二 甲 苯 青，pH8.0、0.01 mol/L EDTA），105℃變性10 min，迅速冰浴5 min后上樣于濃度為14%的100 g/L（Acr∶Bis的質(zhì)量比為39∶1）的非變性聚丙烯酰胺凝膠，18℃、260 V電泳21 h，銀染法顯色后拍照。

觀察電泳結(jié)果，選取條帶不同的PCR產(chǎn)物送往北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用Popgene 1.32軟件計(jì)算基因型頻率（Genotype frequency）、基因頻率（Allele frequency）、基因雜合度（Heterozygosity，He）、有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）以及進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡的χ2檢驗(yàn)等；用PIC_Calc 0.6軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）；使用Lasergene7.1軟件包中的Meg-Align軟件進(jìn)行同源性分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［14］。

2 結(jié)果

2.1 NGB基因第3外顯子的PCR擴(kuò)增

甘肅河西5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）與預(yù)擴(kuò)增片段大小一致且條帶清晰明亮，可直接用于SSCP分析。

圖1 西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的PCR擴(kuò)增

2.2 SSCP檢測(cè)

SSCP檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，甘肅河西5個(gè)地區(qū)的283頭西門(mén)塔爾雜交類群中共發(fā)現(xiàn)AA、AB、AC、AD、AE 5種基因型，受A、B、C、D、E 5個(gè)等位基因控制。

圖2 西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子PCR-SSCP檢測(cè)

對(duì)具有多態(tài)性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子356 bp的核苷酸序列，其中A等位基因序列與普通牛（登錄號(hào)：AC_000167.1）的相應(yīng)序列一致。將不同等位基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)（圖3），發(fā)現(xiàn)與A等位基因相比，B等位基因在第128 bp處發(fā)生了G→A突變，但未引起氨基酸序列的變化，為同義突變；C等位基因在第214 bp處發(fā)生了G→A突變，導(dǎo)致甘氨酸（Gly）突變?yōu)榻z氨酸（Ser）；D等位基因在第232 bp處發(fā)生了C→T突變，導(dǎo)致精氨酸（Arg）突變?yōu)樯彼幔═rp）；E等位基因在第233 bp處發(fā)生了G→A突變，導(dǎo)致精氨酸（Arg）突變?yōu)楣劝滨０罚℅ln），在第75 bp和第78 bp處（即內(nèi)含子區(qū)域）分別發(fā)生了C→T和C→G突變。

2.3 遺傳多樣性分析

5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子等位基因的基因型頻率和基因頻率分布，見(jiàn)表1。群體中發(fā)現(xiàn)AA、AB、AC、AD、AE 5種基因型，受A、B、C、D、E 5個(gè)等位基因控制。甘州、武威、金昌西門(mén)塔爾雜交類群中均只檢測(cè)到AA、AB兩種基因型，高臺(tái)西門(mén)塔爾雜交類群檢測(cè)到AA、AE兩種基因型，臨澤西門(mén)塔爾雜交類群檢測(cè)到AA、AB、AC、AD 4種基因型，5個(gè)地區(qū)均只發(fā)現(xiàn)AA一種純合基因型，其余均為雜合型。A等位基因和AA基因型的頻率在5個(gè)群體中最高，為優(yōu)勢(shì)基因和優(yōu)勢(shì)基因型。5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子多態(tài)性群體遺傳結(jié)構(gòu)分布，見(jiàn)表2。遺傳雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）是評(píng)價(jià)群體遺傳變異的重要指標(biāo)，不同的遺傳參數(shù)體現(xiàn)各群體的遺傳差異性。由表2可知，武威地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群的群體雜合度和有效等位基因數(shù)最大，表示其遺傳多樣性最豐富，遺傳變異程度最高，具有較大的遺傳選擇潛力；甘州西門(mén)塔爾雜交類群的群體雜合度和有效等位基因數(shù)最低，其遺傳變異程度最小。多態(tài)信息含量（PIC）是衡量標(biāo)記多態(tài)性較好的指標(biāo)，不同地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群的PIC值在0.015 9-0.058 2之間，甘肅河西5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群均表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25）。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，5個(gè)地區(qū)的西門(mén)塔爾雜交類群均處于平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

圖3 西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子等位基因的核苷酸序列比對(duì)

表1 5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的基因頻率和基因型頻率

表2 NGB基因第3外顯子多態(tài)性群體遺傳結(jié)構(gòu)

2.4 西門(mén)塔爾牛雜交類群NGB基因編碼區(qū)核苷酸序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

西門(mén)塔爾牛雜交類群與8個(gè)物種NGB基因編碼區(qū)核苷酸序列同源性，見(jiàn)表3。西門(mén)塔爾雜交類群與牦牛和綿羊的同源性最高，分別為98.3%、99.2%，與野豬、猴、人、黑猩猩、兔、雞同源性依次降低，分別為92.5%、93.3%、92.5%、91.7%、91.7%、72.5%。9個(gè)物種NGB基因編碼區(qū)核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖4。西門(mén)塔爾雜交類群與牦牛和綿羊親緣關(guān)系最近，而與野豬、猴、人、黑猩猩、兔、雞親緣關(guān)系依次漸遠(yuǎn)，其NGB基因編碼區(qū)核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與生物進(jìn)化的物種樹(shù)以及動(dòng)物分類學(xué)觀點(diǎn)也基本一致。

表3 西門(mén)塔爾雜交類群與8個(gè)物種NGB基因編碼區(qū)核苷酸序列同源性（%）比較

圖4 九個(gè)物種NGB基因編碼區(qū)核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

本研究采用PCR-SSCP方法分析了甘肅河西5個(gè)地區(qū)283頭西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的遺傳多態(tài)性，研究結(jié)果顯示，河西不同地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子具有一定的遺傳多樣性。共發(fā)現(xiàn)6個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)（75 bp C→ T，78 bp C→ G，128 bp G→ A，214 bp G→A，232 bp C→T，233 bp G→A），其中第75 bp和第78 bp處突變位點(diǎn)落在內(nèi)含子區(qū)域，可能會(huì)對(duì)NGB基因的表達(dá)調(diào)控產(chǎn)生一定的影響。其余4處突變位點(diǎn)均落在外顯子區(qū)域，第128 bp處的核苷酸突變未導(dǎo)致氨基酸的改變，為同義突變。第214 bp處的核苷酸突變導(dǎo)致甘氨酸（Gly）突變?yōu)榻z氨酸（Ser），第232 bp處的核苷酸突變導(dǎo)致精氨酸（Arg）突變?yōu)樯彼幔═rp），第233 bp處的核苷酸突變導(dǎo)致精氨酸（Arg）突變?yōu)楣劝滨０罚℅ln），這些氨基酸突變形成的原因可能與河西各地區(qū)的生態(tài)環(huán)境、地理?xiàng)l件和選育方法等不同有關(guān)。其中第232 bp處的核苷酸突變導(dǎo)致精氨酸（Arg）突變?yōu)樯彼幔═rp），其側(cè)鏈上增加了苯環(huán)結(jié)構(gòu)，可能引起蛋白質(zhì)的空間位阻效應(yīng)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這些氨基酸的突變是否會(huì)對(duì)整個(gè)NGB的功能及其在群體中的遺傳效應(yīng)產(chǎn)生影響，還有待更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

根據(jù)核苷酸突變位點(diǎn)的不同，形成了AA、AB、AC、AD、AE 5種基因型，受A、B、C、D、E 5個(gè)等位基因控制。甘州、武威、金昌西門(mén)塔爾雜交類群發(fā)現(xiàn)了AA、AB 2種基因型，高臺(tái)西門(mén)塔爾雜交類群發(fā)現(xiàn)了AA、AE 2種基因型，臨澤西門(mén)塔爾雜交類群發(fā)現(xiàn)了AA、AB、AC、AD 4種基因型。在第233 bp位點(diǎn)只有高臺(tái)西門(mén)塔爾雜交類群發(fā)現(xiàn)了E等位基因，第214 bp和第232 bp位點(diǎn)僅臨澤西門(mén)塔爾雜交類群發(fā)現(xiàn)了C、D等位基因，可能與這兩個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群的育成歷史有關(guān)，高臺(tái)西門(mén)塔爾雜交類群中的E等位基因和臨澤西門(mén)塔爾雜交類群中的C、D等位基因是雜交培育過(guò)程中固定下來(lái)的，而其它地區(qū)的西門(mén)塔爾雜交類群中并未檢測(cè)到C、D、E等位基因，說(shuō)明高臺(tái)和臨澤西門(mén)塔爾雜交類群與其它地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群之間的基因交流很少，屬于封閉群體。甘肅河西5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群中僅發(fā)現(xiàn)一種AA型純合體，其基因型頻率遠(yuǎn)高于AB、AC、AD和AE基因型，可能是由于等位基因B、C、D和E在進(jìn)化及群體遺傳過(guò)程中受到一定的選擇壓力，其純合個(gè)體因某種原因被自然選擇或人工選擇所淘汰，導(dǎo)致其純合型在群體遺傳過(guò)程中被稀釋或消失，閆永紅等［15］推測(cè)該過(guò)程可能是一種完全淘汰隱性基因的選擇效應(yīng)，而A等位基因在長(zhǎng)期的人工選育過(guò)程中則受到正向選擇，處于優(yōu)勢(shì)地位。A等位基因的基因頻率范圍為0.966 7-0.991 9，屬于優(yōu)勢(shì)等位基因。其余4個(gè)等位基因的基因頻率范圍為0.008 1-0.033 3，其等位基因頻率極低，原因可能是甘肅河西地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群不斷地進(jìn)行雜交改良，隨著代數(shù)的增加而導(dǎo)致等位基因B、C、D、E逐漸被稀釋。在甘肅河西地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了第128 bp處G/A的轉(zhuǎn)換、第214 bp 處G/A的轉(zhuǎn)換、第232 bp處 C/T的轉(zhuǎn)換、第233 bp處G/A的轉(zhuǎn)換，這4處突變類型均為轉(zhuǎn)換，說(shuō)明其突變類型比較保守，有利于保持其群體的遺傳穩(wěn)定性。

多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne）都可用來(lái)度量群體內(nèi)遺傳變異，其值的高低反映了群體內(nèi)個(gè)體的均質(zhì)度，其數(shù)值越高，說(shuō)明遺傳變異性就越大，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，具有較大的選擇潛力，應(yīng)用于遺傳育種效果越好。根據(jù)PIC＞0.5為高度多態(tài)，PIC＜0.25為低度多態(tài)，0.25＜PIC＜0.5則為中度多態(tài)［16］。本研究中，甘肅河西5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子基因座位均呈現(xiàn)低度多態(tài)（PIC＜0.25），說(shuō)明5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群在此基因座位的遺傳多樣性偏低，這可能由于甘肅河西地區(qū)引進(jìn)西門(mén)塔爾牛時(shí)間較短，繁育次數(shù)和代數(shù)不多，導(dǎo)致基因多樣性較低。武威地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群的群體雜合度和有效等位基因數(shù)最大，遺傳多樣性最豐富，遺傳變異程度最高，遺傳潛力大；甘州地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群的群體雜合度和有效等位基因數(shù)最低，其遺傳變異程度最小，說(shuō)明該地區(qū)的西門(mén)塔爾雜交類群遺傳一致性較好。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，甘肅河西5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），可能是由于這5個(gè)地區(qū)的西門(mén)塔爾雜交類群經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的雜交改良，選擇壓力相對(duì)趨于穩(wěn)定，因此在人工選擇、遷徙和遺傳漂變等各種因素的作用下該基因座位處于動(dòng)態(tài)平衡中。

本研究顯示，西門(mén)塔爾雜交類群與牦牛和綿羊NGB基因編碼區(qū)核苷酸序列的同源性最大，親緣關(guān)系最近，而與野豬、猴、人、黑猩猩、兔、雞的同源性依次降低，親緣關(guān)系也依次漸遠(yuǎn)。說(shuō)明NGB基因編碼區(qū)在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過(guò)程中存在一定的差異性，可能會(huì)導(dǎo)致NGB基因發(fā)生遺傳變異。為進(jìn)一步探討西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因的遺傳特性提供一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)運(yùn)用PCR-SSCP方法對(duì)甘肅河西5個(gè)地區(qū)西門(mén)塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子進(jìn)行了多態(tài)性分析，結(jié)果表明，該基因座位共發(fā)現(xiàn)5個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)，受A、B、C、D、E 5個(gè)等位基因控制，存在AA、AB、AC、AD、AE 5種基因型。A等位基因和AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因和優(yōu)勢(shì)基因型。該基因座位在5個(gè)地區(qū)的西門(mén)塔爾雜交類群群體中PIC值均呈低度多態(tài)（PIC＜0.25）。NGB基因編碼區(qū)在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過(guò)程中存在一定的差異性，可能會(huì)導(dǎo)致NGB基因發(fā)生遺傳變異。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Genetic Variation Study of NGB Gene Exon 3 of Simmental Cattle Hybrid Taxon in Gansu Hexi Regions

Liang Chunhua1，3Liu Xia2，3Sun Xuejing1，3Luo Yuzhu3Gao Xuejin2Du Xiaohua1，3
（1. Gansu Agricultural University College of Veterinary Medicine，Lanzhou 730070；2. Gansu Agricultural University College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；3. Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070）

This study was designed to systematically analyze the genetic polymorphism and variability of NGB gene exon 3 of 283 Simmental cattle hybrid taxon in Gansu Linze， Ganzhou， Wuwei， Jinchang， and Gaotai. DNA fragment containing the exon 3 and part of intron of NGB gene was amplified and genotyped using PCR single-strand conformational polymorphism（SSCP） method. Representative alleles were sequenced for verification of their variations in DNA sequences. The results displayed that there were 5 alleles（A， B， C， D and E）detected， combined five genotypes as AA， AB， AC， AD and AE. Among them， samples from Ganzhou， Wuwei and Jinchang were detected AA and AB genotypes， AA and AE genotypes in Gaotai and AA， AB， AC and AD genotypes in Linze. Allele A was the predominant allele and AA was the predominant genotype in five breeds. Sequence of the SSCP showed 6 mutations in the DNA fragment（75 bp C→T， 78 bp C→G，128 bp G→A， 214 bp G→A， 232 bp C→T， and 233 bp G→A）. In which， C→T at 75 bp and C→G at 78 bp were located in intron，while the other mutations were located in exon. G→A mutation at 214 bp， C→T mutation at 232 bp and G→A mutation at 233 bp were lead to Gly→Ser， Arg→Trp and Arg→Gln， respectively. Chi-square testing indicated the three gene mutation were all in Hardy-Weinberg equilibrium（P＞ 0.05）. Population genetics analysis showed the polymorphism information content were 0.0582， 0.0196， 0.0196， 0.0161 and 0.0159 in Linze， Ganzhou， Wuwei， Jinchang， Gaotai， respectively， which was at low polymorphism（PIC ＜0.25）.

Simmental cattle hybrid taxon；NGB gene；exon；genetic variation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.018

2014-10-29

甘肅省高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（2013），甘肅省教育廳研究生導(dǎo)師項(xiàng)目（1102-04）

梁春花，女，碩士研究生，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)；E-mail：liang835216@163.com

杜曉華，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)；E-mail：duxh@gsau.edu.cn