范寶莉 王珍 任春雪 顧增惠 劉曉穎 王振英

（天津師范大學生命科學學院，天津 300387）

寶坻大蒜再生體系優(yōu)化及性能評估

范寶莉 王珍 任春雪 顧增惠 劉曉穎 王振英

（天津師范大學生命科學學院，天津 300387）

通過對分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進行優(yōu)化，完善了寶坻大蒜再生體系，確定最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 5.0 g/L+ NAA 1.0 g/L，最佳生根培養(yǎng)基為無激素的MS培養(yǎng)基。對再生植株進行細胞學鑒定及田間評估，未發(fā)現(xiàn)染色體變異，再生植株田間特性有利于提高光合效率。

寶坻大蒜；再生植株；葉夾角；鱗莖

大蒜（Allium sativum L.）屬于蔥屬蔥科家族，是最重要的蔬菜作物之一，可用于烹飪和醫(yī)療。近年來，由于其具有抗氧化、癌癥預防、肝臟保護、免疫調(diào)節(jié)和降低心血管疾病等功能［1-3］，其保健和藥用價值已被廣泛研究；大蒜含有超過2 000種生物活性組分［4］，還含有高濃度含硫化合物，如大蒜素［5］。

栽培大蒜是無性繁殖作物，由于其性器官不育，大約10%的收獲作物用于接下來的大田作物生產(chǎn)，且長期無性繁殖導致鱗莖易感染多種病毒，造成大蒜種性退化，使品質(zhì)降低產(chǎn)量下降。微繁技術(shù)可用來加速無性繁殖以生產(chǎn)大量的健康脫毒植株；并用于大量無性繁殖植物材料的低溫貯藏［6］。

植物細胞組織培養(yǎng)技術(shù)在植株再生和品種改良方面起到重要作用。近年來研究者主要以鱗莖［7-11］、氣生鱗莖［12］或花苞［13，14］等為外植體進行體外培養(yǎng)，建立了較為完善的組織培養(yǎng)體系。寶坻大蒜“六瓣紅”是津沽名優(yōu)特產(chǎn)，1973年寶坻大蒜種植面積被列入國家計劃并出口東南亞等國家，但寶坻大蒜的微繁研究相對滯后，主要以發(fā)芽葉［15，16］、花梗［17］等為外植體初步建立了植株再生體系，后期的試管苗移栽及大田評估鮮見報道。本研究在李轉(zhuǎn)春等［16］的體系基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化植株再生體系，提高了再生效率，并對移栽后的植株進行細胞學研究和田間評估，為寶坻大蒜微繁技術(shù)的完善和種質(zhì)創(chuàng)新奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為寶坻大蒜“六瓣紅”。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒 大蒜的鱗莖于4℃冷藏2周以激活發(fā)芽過程，選取生長健壯、無病蟲害的大蒜蒜頭，剝?nèi)ネ饷骥[葉，流水沖洗20 min左右，用蒸餾水沖洗1遍，0.1%的升汞消毒10 min，無菌水沖洗3次，濾紙吸干，再將其放在75%的無水乙醇中消毒10 min，用無菌水沖洗3次，濾紙吸干，備用。

1.2.2 微繁體系各培養(yǎng)基組分 參照李轉(zhuǎn)春［16］的方法略作改動，并對分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進行篩選和優(yōu)化（表1）。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同種類和濃度的激素，pH值為5.8；高溫高壓滅菌20 min；待冷卻至60℃時，分裝到200 mL的組培瓶中，每瓶約40 mL，封口備用。

表1 微繁體系培養(yǎng)基組分

接種前，紫外消毒30 min。切取大蒜發(fā)芽葉，接入愈傷組織誘導培養(yǎng)基，放于人工氣候箱中，日溫25℃，夜溫20℃暗培養(yǎng)。

每隔20-25 d繼代1次，選取繼代2次的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，每瓶10塊，每個處理20瓶，共設(shè)3個處理。培養(yǎng)條件為日溫25℃，夜溫20℃，光強1 500 Lx，光照時間14 h/d。將分化出不定芽的綠苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，誘導生根，生根培養(yǎng)基共設(shè)3個處理，記錄生根時間及生根率。

1.2.3 試管苗的馴化及移栽 生根后的試管苗，待其長到3片真葉、生根3-4條時，室溫開瓶煉苗，7-10 d后從試管中取出，洗去根部培養(yǎng)基將其移栽至滅菌的珍珠巖、蛭石和泥炭土（1∶3∶6）中，移栽后保持日溫25℃，夜溫15℃，在組織培養(yǎng)室中放置30 d壯苗，之后移栽到大田。

1.2.4 細胞學研究 為了確定本研究中大蒜愈傷組織途徑再生植株的遺傳穩(wěn)定性，取不同再生階段分生組織（愈傷組織、分化后的不定芽、試管苗根尖）進行細胞學觀察。將不同材料固定于卡諾固定液中，1 mol/L HCl 60℃水解8 min，卡寶品紅染色8 min，壓片鏡檢。

1.2.5 田間數(shù)據(jù)評估 隨機選取田間種植的栽培大蒜植株以及再生植株各30株，進行數(shù)據(jù)測量及生理生化指標測定，計算平均值。

株高：植株收獲后，測量植株基部到最高的葉片的距離。葉夾角：收獲后，測量植株倒3葉與莖的銳角角度。葉間距：收獲后，測量植株倒2葉與倒3葉之間的距離。鱗莖直徑：用游標卡尺測量收獲植株鱗莖直徑。

葉綠素含量：田間栽培16周后，對栽培大蒜、再生植株分別進行取材，用打孔器在第3片葉子的4-6 cm、6-8 cm和8-10 cm葉段分別進行打孔，將打下來的小圓片分別裝入管中，標記1，2，3管，向每管中加入浸提液（丙酮∶乙醇=1∶1）10 mL，放置在黑暗條件下72 h，分別測量每管在663、645 nm處的分光光度值，計算葉綠素含量。每管重復測量3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 試管苗的形成

大蒜發(fā)芽葉接種28 d左右可以誘導出愈傷組織；將繼代兩次的愈傷組織接入分化培養(yǎng)基，每瓶10塊愈傷組織，每處理20瓶，共設(shè)3個處理；分化后的苗接入生根培養(yǎng)基，每處理50管，共3個處理。試管苗形成過程如圖1所示，愈傷組織分化率見表2，生根率見表3。

表2 不同培養(yǎng)基對分化率的影響

表3 不同培養(yǎng)基對生根率的影響

大蒜發(fā)芽葉橫切為2 mm左右薄片（圖1-A）接種1周后，外植體表面結(jié)構(gòu)疏松，周圍組織變成淺黃色，有一定的光澤。接種2周后，有微小的愈傷組織顆粒形成。接種4周左右，外植體表面已經(jīng)形成雪花狀、質(zhì)地疏松的愈傷組織（圖1-B）。

圖1 試管苗形成過程

將愈傷組織接入繼代培養(yǎng)基，選擇繼代2周的愈傷組織分別接入3種分化培養(yǎng)基，在分化培養(yǎng)基中首先形成綠點和嫩芽（圖1-C），最終形成健壯的苗（圖1-D）。每天觀察分化情況，每3 d記錄數(shù)據(jù)，計算分化率。第一次出現(xiàn)綠點的先后順序分別為分化培養(yǎng)基3、2和1，時間分別為8、11和16 d。從表2可以看出，分化培養(yǎng)24 d后，分化培養(yǎng)基3的分化率達到了50%，而分化培養(yǎng)基1的分化率為26%，分化培養(yǎng)基2的分化率為35%，當愈傷組織分化培養(yǎng)39 d后，分化培養(yǎng)基3的分化率達到了100%，分化培養(yǎng)基1為68%，分化培養(yǎng)基2為80%。最終分化培養(yǎng)基1的分化率為74%，分化培養(yǎng)基2的分化率為94%。結(jié)果表明，分化培養(yǎng)基3的分化率最高，且分化速度快。細胞分裂素可促進細胞生長和分化，誘導不定芽的形成。因此，適當提高細胞分裂素與生長素的濃度比，有利于不定芽的分化。

將分化后的健壯苗移入生根培養(yǎng)基中，由表3可見，生根培養(yǎng)基1中在6 d左右即可生根，48 d后生根率91.1%，根系發(fā)達且均為實生根（圖1-E）；生根培養(yǎng)基2中9 d左右生根，最終生根率63.3%，根系少，主要形成小鱗莖（圖1-F）；生根培養(yǎng)基3中的生根速度最慢（圖1-G），且最終生根率僅為32.1%。因此，選用不添加任何激素的MS培養(yǎng)基為最佳生根培養(yǎng)基。

2.2 試管苗的煉苗及移栽

生根后的試管苗，待其長到3片真葉、生根3-4條時，室溫開瓶煉苗，7-10 d后將小植株從試管中取出（圖2-A），洗去根部培養(yǎng)基將其移栽至滅菌的珍珠巖、蛭石和泥炭土（1∶3∶6）中（圖2-B），移栽后保持日溫25℃，夜溫15℃，在組織培養(yǎng)室中放置30 d壯苗，之后移栽到大田（圖2-C），移栽成活率在95%以上。

圖2 試管苗煉苗

2.3 細胞學試驗結(jié)果

為了檢驗試管苗的遺傳穩(wěn)定性，對組織培養(yǎng)不同時期以及正常栽培的大蒜根尖進行細胞學分析。圖3顯示了栽培大蒜根尖不同時期染色體以及試管苗形成不同時期染色體觀察結(jié)果。試管苗不同時期染色體數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，每個時期隨機選取10個視野（不重復），每個視野觀察100個細胞，所觀察的細胞樣本數(shù)量至少為1 000個，未觀察到染色體異常現(xiàn)象，說明本研究的培養(yǎng)體系既利于試管苗生長，提高了試管苗形成比率，又不影響試管苗的正常發(fā)育，未發(fā)生遺傳變異現(xiàn)象。

圖3 栽培大蒜根尖及試管苗不同時期染色體

2.4 田間數(shù)據(jù)評估

隨機選取了栽培大蒜和再生植株各30株，測量了成熟植株的株高、葉夾角、葉間距、鱗莖直徑，測定了葉片葉綠素含量，計算平均值，數(shù)據(jù)見表4。圖4顯示了兩種大蒜植株形態(tài)（圖4-A，圖4-B）及再生植株鱗莖狀態(tài)（圖4-C，圖4-D）。普通栽培大蒜的株高、葉夾角和鱗莖直徑較再生植株大，葉間距與葉綠素含量較再生植株小。再生植株葉夾角小，上部直立，透光率高，可以為中下部葉片提供更多光照，提高植株凈光合速率；葉間距大利于增強通風透光性，光合活性增強；葉綠素含量高，能夠提高光合作用效率，利于植株生長。再生植株鱗莖直徑稍小于普通大蒜，但蒜瓣緊實，分瓣情況為典型的四六瓣，符合寶坻大蒜特征。

表4 田間試驗數(shù)據(jù)

圖4 成熟的大蒜葉片及鱗莖

3 討論

組織培養(yǎng)方法是大蒜等無性繁殖作物在短期內(nèi)大量繁殖的有效途徑，優(yōu)化組織培養(yǎng)體系能夠提高大蒜的再生效率，改善再生植株品質(zhì)，最終用于作物育種改良。本研究在前人的經(jīng)驗基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化組織培養(yǎng)體系，改良分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基激素配比，大大提高了分化效率和生根效率，并縮短了分化及生根時間。Motte［18］認為芽再生是微繁過程中很重要的一步，富含細胞分裂素的芽誘導培養(yǎng)基利于不定芽的形成。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進一步提高了細胞分裂素含量，增加了細胞分裂素與生長素的濃度比，從而縮短了分化時間，提高了分化效率。利用無激素的MS培養(yǎng)基誘導生根，利于實生根的形成。本研究對微繁過程的不同階段分生組織進行細胞學觀察，未發(fā)現(xiàn)異常染色體。

再生植株性能評價中最為重要的是大田性能的評估，以確保其是否優(yōu)于傳統(tǒng)作物。前期的研究主要集中于實驗室中再生體系的優(yōu)化，有關(guān)大蒜再生植株在大田種植中的性能評估報道較少，還未見寶坻大蒜的相關(guān)報道。本研究首次報道了寶坻大蒜在大田種植中以及鱗莖成熟后的相關(guān)指標，進一步完善了寶坻大蒜再生植株的特性評價。再生植株與普通大蒜植株相比，葉夾角減小、葉間距與葉綠素含量增大，這些特征有利于更好地利用光能，提高光合效率，進一步提高產(chǎn)量。王元東、呂麗華等［19，20］認為葉夾角小的植株，上部葉片直立上沖，截光能力低，群體透光率高，可以為中下部葉片提供更多光照，便于葉片充分高效利用光能，提高植株凈光合速率，從而提高產(chǎn)量。葉間距越大，越有利于減小田間郁閉，增強群體通風透光性，中上層葉片受光條件越好，越有利于葉片達到較高的光合活性；同時也越有利于中下部葉片的光合作用，增強全株的光能利用率。同時葉綠素含量較普通植株高，有利于光合效率的提高。組織培養(yǎng)過程中充足的營養(yǎng)供給使再生植株對外界脅迫具有更強的抵御能力。本研究補充完善了寶坻大蒜微繁體系，為寶坻大蒜快繁和種質(zhì)創(chuàng)新打下更為堅實的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以寶坻大蒜為試驗材料，對分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進行優(yōu)化，進一步完善了寶坻大蒜再生體系。最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 5.0 g/L+NAA 1.0 g/L，最佳生根培養(yǎng)基為無激素的MS培養(yǎng)基，分化率為100%，生根率為91.1%。對植株再生不同階段的分生組織進行細胞學觀察，未發(fā)現(xiàn)染色體變異現(xiàn)象。

分別對栽培大蒜和再生植株進行田間評估，再生植株的株高、葉夾角和鱗莖直徑小于栽培大蒜，葉間距與葉綠素含量大于栽培大蒜，利于提高光合效率。

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（責任編輯 李楠）

ISAAA信息

2014年是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第19年， 轉(zhuǎn)基因作物種植面積持續(xù)增加。28個國家（20個發(fā)展中國家， 8個發(fā)達國家）的1 800萬農(nóng)民種植了1.81億公頃（ 4.48億英畝） 的轉(zhuǎn)基因作物， 比2013年27個國家的1.75億公頃有所增長。中國轉(zhuǎn)基因作物種植面積世界排名第6位， 種植面積為390萬公頃 ， 種植的轉(zhuǎn)基因作物包括棉花、木瓜、白楊、番茄、甜椒。

孟加拉國是種植轉(zhuǎn)基因作物的新成員。2013年10月， 孟加拉國首次批準了Bt 茄子的種植， 小農(nóng)戶們于2014年 1月開始 Bt 茄子的商業(yè)化。 美國于2014年11月批準了另一種糧食作物 InnateTM馬鈴薯， 相比傳統(tǒng)馬鈴薯， 它的潛在致癌物質(zhì)丙烯酰胺含量更低， 挫傷損失更少。2014年11月， 一種新的轉(zhuǎn)基因作物苜蓿（事件KK179） 在美國獲批種植， 其木質(zhì)素減少了22%， 從而具有更高的可消化性和生產(chǎn)率。在美國種植的第一種耐旱玉米2014年的種植面積比2013年的5萬公頃增加5倍以上， 達到27.5萬公頃。

轉(zhuǎn)基因作物在1995年至2014年間產(chǎn)生了多重重大效益： 采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使化學農(nóng)藥的使用率降低了37%，作物產(chǎn)量提高了22%， 農(nóng)民利潤增加了68%。

（數(shù)據(jù)來源： 基因農(nóng)業(yè)網(wǎng) ）

Optimization and Performance Evaluation of the Regeneration System of the Baodi Garlic

Fan Baoli Wang Zhen Ren Chunxue Gu Zenghui Liu Xiaoying Wang Zhenying
（College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

The regeneration system of Baodi garlic was improved by optimizing the differentiation medium and rooting medium. The optimal differentiation medium was MS +6-BA 5.0 g/L + NAA 1.0 g/L and the best medium for rooting was MS medium without hormones. No chromosomal aberration was observed according to the results of the cytological identification and field assessment of the plant regeneration. The field features indicated the improvement of the photosynthetic efficiency of the plant regeneration.

Baodi garlic；plant regeneration；leaf angle；bulb

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.014

2014-07-25

天津市農(nóng)委重點項目（5KN13001），天津師范大學應用開發(fā)研究基金項目，天津市科委面上項目（14JCYBJC29900）

范寶莉，女，碩士，高級實驗師，研究方向：細胞遺傳學；E-mail：fbl1216@126.com

王振英，女，博士，教授，研究方向：植物抗性分子生物學；E-mail：skywangzy@mail.tjnu.edu.cn