王鳳軍劉莎莎馮俊麗

（1.庫爾勒出入境檢驗(yàn)檢疫局，庫爾勒 841000；2.浙江理工大學(xué)生物工程研究所，杭州 310018）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測四種蛀果性害蟲

王鳳軍1劉莎莎2馮俊麗2

（1.庫爾勒出入境檢驗(yàn)檢疫局，庫爾勒 841000；2.浙江理工大學(xué)生物工程研究所，杭州 310018）

蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟、梨小食心蟲及地老虎是危害新疆香梨等產(chǎn)品的重要害蟲，前3種也屬于國際上檢驗(yàn)檢疫重要蟲害。目前，國內(nèi)主要依靠蟲體的形態(tài)特征對其進(jìn)行鑒定，缺少分子生物學(xué)檢測手段，這限制了我國香梨等產(chǎn)品的生產(chǎn)和出口貿(mào)易發(fā)展。首先得到這4種害蟲的16S rDNA COI基因片段，在差異序列設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立快速分子檢測試驗(yàn)體系，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析檢測體系的重復(fù)性和靈敏性。結(jié)果表明，蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟、梨小食心蟲及地老虎最低檢出限分別在1.605×10-2、0.729×10-2、0.475×10-2和0.818×10-2ng/μL，滿足檢驗(yàn)檢疫日常檢測需求。為克服實(shí)際檢測過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)某一蟲的殘片樣本或者幾種蟲聚集在一起的混合樣本，使用了單頭、多頭DNA樣本及4種害蟲的混合DNA樣本進(jìn)行檢測分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的特異性，可靠性和可適用性。

蘋果蠹蛾；香梨優(yōu)斑螟；梨小食心蟲；地老虎；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

庫爾勒香梨是新疆巴州特色優(yōu)質(zhì)水果，已有1 400多年的栽培歷史，現(xiàn)種植面積約4.667×104hm2，作為新疆唯一獲準(zhǔn)進(jìn)入北美等高端市場的水果，已出口至東南亞、美洲、澳洲等20多個(gè)國家。在香梨出口貿(mào)易中，各主要香梨輸入國都與我方簽署有雙邊植物檢疫議定書，比較關(guān)注蘋果蠹蛾（Laspeyresiapomonella L.）、梨小 食心蟲（Grapholitha molesta Busck）、香梨優(yōu)斑螟（Euzophera pyriella Yang）等主要蟲害。

目前，憑借形態(tài)學(xué)特征只能區(qū)分成蟲和晚齡期害蟲，大多數(shù)有害生物較短暫的幼蟲階段很難依靠形態(tài)學(xué)特征精確區(qū)分。蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優(yōu)斑螟等有害生物的幼蟲基本在香梨采收時(shí)大量出現(xiàn)，有時(shí)僅剩殘?bào)w，而香梨輸入國對截獲的檢疫性有害生物和一般有害生物的貨物處理、制裁和出口限制等差別很大。此類害蟲的鑒定方法不成熟和分辨率低增加了香梨出口風(fēng)險(xiǎn)。近年來，國際上一些學(xué)者利用分子生物學(xué)方法對部分害蟲進(jìn)行鑒定，如新西蘭Chen等［1］利用跨物種PCR擴(kuò)增的方法，分析了蘋果蠹蛾、梨小食心蟲等4種近似種的33個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，用于區(qū)分這些昆蟲的種群和其基因流；美國Barcenas等［2］利用通用引物對蘋果蠹蛾、杏小卷蛾、櫻小卷蛾等幾種國際檢疫性害蟲COI基因一段保守性序列（約470 bp）進(jìn)行了克隆、測序、分析、比對，設(shè)計(jì)了針對每種害蟲的特異性熒光定量PCR引物和探針序列，能準(zhǔn)確檢測和區(qū)分這幾種害蟲。

為改變香梨在出口貿(mào)易中有害生物檢測鑒定的被動(dòng)局面，本研究建立了簡易可行、準(zhǔn)確快速的試驗(yàn)檢測平臺，能夠精確區(qū)分出口香梨中可能存在的形態(tài)學(xué)相似的有害生物，降低香梨出口風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟、梨小食心蟲、地老虎DNA均由庫爾勒出入境檢驗(yàn)檢疫局提供。

DNA提取試劑盒（Qiagen公司）；TaKaRa TaqTMHot Start Version（TaKaRa公司）；Recombinant Taq DNA Polymerase TaKaRa TaqTM（TaKaRa公司）；50 bp DNA Ladder（TaKaRa公司）；TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa公司）；TaKaRa Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）試劑盒（TaKaRa公司）。PCR儀：Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)：TANON公司；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；ND2000C核酸蛋白分析儀：美國熱電公司；1-14ED小型離心機(jī)：德國Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取 庫爾勒出入境檢驗(yàn)檢疫局在沙依東園藝場，庫爾勒市和農(nóng)二師各團(tuán)場注冊果園開展有害生物調(diào)查，收集蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優(yōu)斑螟等有害生物的幼蟲到成蟲各階段的蟲體及殘骸樣本，經(jīng)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定后分類保存；使用DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒提取總DNA，并經(jīng)DNA電泳和核酸蛋白分析儀檢測提取的質(zhì)量和濃度。樣品提取時(shí)所用的肌肉組織量：蘋果蠹蛾：單頭 2.5-5.0 mg，多頭（4-5只）16-18 mg；梨小食心蟲：單頭1 mg，多頭（12-13只）12-16 mg；香梨優(yōu)斑螟：單頭2 mg，多頭（3-5只）10 mg；地老虎：單頭10 mg；單頭加30 μL緩沖液進(jìn)行洗脫，多頭加60 μL緩沖液洗脫。DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物和探針設(shè)計(jì) 從NCBI數(shù)據(jù)庫檢索蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優(yōu)斑螟、地老虎COI特征序列，經(jīng)BLAST后用DNA-star等軟件比較其序列同源性，篩選出合理的目的片段基因后導(dǎo)入Primer premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，使用通用引物擴(kuò)增COI基因片段，通過克隆測序，比對分析序列差異性，并在差異性區(qū)域設(shè)計(jì)種屬特異性的引物，引物合成由TaKaRa（大連，中國）公司完成，表1所示。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列

1.2.3 目的基因的定性PCR擴(kuò)增檢測 用1.2.2設(shè)計(jì)的4對引物分別對4種樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測設(shè)計(jì)引物的特異性。反應(yīng)體系：在200 μL 薄壁管中依次加入10×LA PCR BufferⅡ2 μL，dNTP mixture 3.2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，Taq HS 0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)熱1 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增反應(yīng)液，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。將PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司測序，每種測序2-3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 DNA測序與探針設(shè)計(jì) 蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優(yōu)斑螟以及地老虎的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)分析后，通過NCBI中的BLAST比對，篩選出合理的目標(biāo)片段基因，再導(dǎo)入ABI Primer Express 3.0和DNAMAN軟件進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。在上下游引物間區(qū)域設(shè)計(jì)種屬特異性的熒光探針，委托TaKaRa公司合成，表2所示。

表2 本試驗(yàn)所用探針序列

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系（20 μL）含Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×） 10.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，探針（10 μmol/L）0.8 μL，ROX Reference Dye（50×） 0.4 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火/延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行反應(yīng)評估 4種蛀果害蟲的DNA經(jīng)系列梯度稀釋后擴(kuò)增，得出Ct值，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，判定反應(yīng)的效率、重復(fù)性和檢測范圍。本試驗(yàn)將4種DNA分別進(jìn)行5個(gè)濃度稀釋（1×、10×、100×、1 000×、104×），稀釋后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣本標(biāo)準(zhǔn)差（s），并分析結(jié)果。

1.2.7 單多頭DNA檢測 將每種DNA按單多頭分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢驗(yàn)DNA的單多頭取樣對后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)以及對引物探針特異性的影響。

1.2.8 DNA混合試驗(yàn)檢測 將4種DNA進(jìn)行混合，用4對引物以及對應(yīng)的探針擴(kuò)增，檢測混合樣本對擴(kuò)增反應(yīng)以及特異性的影響。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，由軟件ABI7500 Sequence Detection Software自動(dòng)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到各個(gè)反應(yīng)的Ct值。在1.2.6反應(yīng)結(jié)束后，制作關(guān)于DNA濃度對數(shù)和Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和R2值，檢測曲線的線性程度，以及推算出對應(yīng)的每種DNA的擴(kuò)增效率，檢測擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 普通定性PCR檢測結(jié)果

蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟、梨小食心蟲及地老虎的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)分析后，通過NCBI中的BLAST比對COI特征序列，序列同源性分別達(dá)99%（如與蘋果蠹蛾FJ217755.2、FJ217756.2和FJ217764.2等序列比對）、97%（如與香梨優(yōu)斑螟KC215198.1、KC442311.1和KC442309.1等序列比對）、99%（如與梨小食心蟲AB603521.1、HQ5384-66.1和JF733841.1等序列比對）、99%（如與地老虎JX392593.1、JX392592.1和JX392591.1等序列比對）。并且，用針對蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟、梨小食心蟲和地老虎COI特征序列設(shè)計(jì)的4組引物對應(yīng)擴(kuò)增4種COI序列片段，電泳結(jié)果（圖1）中都只出現(xiàn)一條帶，表明4對引物的擴(kuò)增特異性

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果

利用所選擇的引物和探針序列進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，得到的擴(kuò)增曲線（圖2），每一組引物和探針只能擴(kuò)增目的DNA，其余對照樣品無熒光信號，結(jié)果表明設(shè)計(jì)的引物和探針可以保證擴(kuò)增的特異性。

2.3 重復(fù)性和靈敏性檢測結(jié)果

根據(jù)熒光定量PCR反應(yīng)得到的Ct值，繪制出了4個(gè)檢測基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。標(biāo)準(zhǔn)曲線R2分別為0.998 9、0.997 6、0.990 0和0.973 8，斜率分別為-3.351 1、-3.275 3、-3.402 0和-3.105 4，計(jì)算出4個(gè)檢測基因在檢測濃度范圍內(nèi)的擴(kuò)增效率分別為98.79%、101.98%、96.74%和109.9%。結(jié)果表明，蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟、梨小食心蟲及地老虎DNA溶液分別在1.605×10-2-160.5、0.729×10-2-72.9、0.475×10-2-47.52和0.818×10-2-81.78 ng/μL的檢測范圍內(nèi)，熒光定量PCR起始模板濃度和Ct值之間具有較好的線性關(guān)系。由此確定這4個(gè)檢測基因分別在模板質(zhì)量濃度為1.605×10-2、0.729×10-2、0.475×10-2和0.818×10-2ng/μL時(shí)為有效擴(kuò)增，即該質(zhì)量濃度為最低檢出限。

圖1 引物對應(yīng)擴(kuò)增蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟、梨小食心蟲和地老虎COI DNA的定性PCR檢測結(jié)果

圖2 蘋果蠹蛾（A）、香梨優(yōu)斑螟（B）、梨小食心蟲（C）和地老虎（D）COI 基因片段的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

2.4 四種害蟲的熒光定量PCR檢測

將所建立的熒光定量PCR檢測體系應(yīng)用于蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟、梨小食心蟲和地老虎的日常檢測。將這4種害蟲的單、多頭DNA樣品和混合DNA樣品分別用4組引物和探針組合擴(kuò)增，結(jié)果顯示各樣品只有特異的引物和探針組合才能得到擴(kuò)增，各個(gè)反應(yīng)的PCR擴(kuò)增Ct值匯總?cè)绫?所示。

3 討論

蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優(yōu)斑螟等有害生物的幼蟲基本在香梨采收時(shí)大量出現(xiàn)，有時(shí)僅剩殘?bào)w，而香梨輸入國對截獲的檢疫性有害生物和一般有害生物的貨物處理、制裁和出口限制等差別很大。針對此類害蟲的鑒定方法不成熟和分辨率低大大增加了香梨出口的風(fēng)險(xiǎn)。檢疫性害蟲的傳統(tǒng)鑒定方法是通過形態(tài)學(xué)特征來識別，主要依賴于經(jīng)驗(yàn)豐富的昆蟲分類學(xué)專家。但對于殘片、蟲卵、形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分的幼蟲，形態(tài)學(xué)的鑒定就受到局限，同時(shí)鑒定所需時(shí)間長，不適合檢驗(yàn)檢疫部門快速檢疫通關(guān)的要求［3］。近年來，以COI 條形碼為目的片段，通過設(shè)計(jì)特異引物的特異性PCR檢測鑒定方法已經(jīng)開始用于一些昆蟲種類的鑒定和區(qū)分［4-6］。

圖3 蘋果蠹蛾（A）、香梨優(yōu)斑螟（B）、梨小食心蟲（C）和地老虎（D）DNA溶液在檢測范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 四種害蟲熒光定量PCR檢測結(jié)果

在熒光定量PCR試驗(yàn)分析體系的建立過程中，引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵一步，要考慮到諸多因素。其中，Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，以55-80℃為宜，上下游引物間的Tm值差異最好在10℃以內(nèi)。G+C含量一般以40%-60%為好，上下游引物間的G+C含量差異在20%以內(nèi)最好，這樣可以適當(dāng)提高引物的特異性。一般退火溫度比Tm值低5-15℃［7］。另外，要避免引物中含有連續(xù)的G或C，但在引物的末端可以含G或C。本試驗(yàn)采用的4對引物的退火溫度大多控制在56℃左右，這樣就保證了它們在同樣的PCR體系中能很好的擴(kuò)增，達(dá)到檢測目的。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的優(yōu)化過程中，采用了適當(dāng)提高退火溫度的方法，盡可能保證引物的特異性。本試驗(yàn)所建立的熒光定量PCR擴(kuò)增體系對蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟、梨小食心蟲和地老虎的檢測特異性強(qiáng)，每組引物和探針只能擴(kuò)增目的DNA，其他干擾DNA無熒光信號。

檢出限是指檢測系統(tǒng)中可檢測的最低分析物濃度，又稱分析靈敏度［8］，分為定性和定量檢測低限，其中定性檢測低限可再分為絕對和相對檢測低限兩種。絕對檢測低限是指能被檢測到的最低數(shù)量的原始模板拷貝或濃度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過建立模板DNA濃度稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢出限。將標(biāo)準(zhǔn)曲線上的斜率代入公式E=10（-1/slope）-1，計(jì)算擴(kuò)增效率，理想的擴(kuò)增效率應(yīng)在90%-110%之間［9，10］，本研究4個(gè)檢測基因擴(kuò)增效率分別為98.79%、101.98%、96.74%和109.9%，在可接受的PCR擴(kuò)增效率范圍內(nèi)［9］。在最高稀釋度的樣品中，4個(gè)檢測基因均得到擴(kuò)增，Ct值接近檢測臨界限（Ct=35）［8，11］，結(jié)果表明本試驗(yàn)建立的分子檢測體系靈敏度較高，4種害蟲的最低檢出限分別在1.605×10-2、0.729×10-2、0.475×10-2和 0.818× 10-2ng/μL，滿足檢驗(yàn)檢疫日常檢測需求。

由于在實(shí)際檢測過程中，經(jīng)常出現(xiàn)某一蟲的殘片樣本或者幾種蟲聚集在一起的混合樣本，本試驗(yàn)使用了單頭、多頭DNA樣本及4種害蟲的混合DNA樣本進(jìn)行檢測分析，驗(yàn)證了該方法的特異性，可靠性和可適用性。此外，在實(shí)際的檢驗(yàn)檢疫工作中，對于未知害蟲樣本，為節(jié)約試劑和縮短檢測時(shí)間，有可能需要用多對引物和探針組合來進(jìn)行檢測。

4 結(jié)論

本研究通過設(shè)計(jì)引物和探針，DNA測序，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，建立了蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優(yōu)斑螟和地老虎4種害蟲分子生物學(xué)鑒定方法，克服了只能通過形態(tài)學(xué)鑒定的限制。本試驗(yàn)還通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、單多頭檢測以及混合DNA檢測，多方面驗(yàn)證引物和探針的特異性，檢測體系的重復(fù)性和靈敏性。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Rapid Identification of Four Kinds of Decay Fruit Moths by Real-time Fluorescence Quantitative PCR

Wang Fengjun1Liu Shasha2Feng Junli2
（1. Korla Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Korla 841000；2. Institute of Bioengineering，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou，Zhejiang 310018）

Laspeyresia pomonella， Euzophera pyriella Yang， Grapholitha molesta and Blank cutworm are important pets of fragrant pears and other fruits in Xinjiang， and they are also internationally important pests on inspection and quarantine. However， the identification relies mainly on morphological characters up to date. The lack of molecular detection methods greatly limits the international export trading of fragrant pears and related products. The 16S rDNA COI fragments from the four pests were cloned and sequenced. Then， specific primers and probes were designed according to the sequencing data， and the fluorescence Real-time quantification PCR detection system was established. The results demonstrates the limits of detection concentration of Laspeyresia pomonella， Euzophera pyriella Yang， Grapholitha molesta and Blank cutworm in this system are respectively 1.605×10-2，0.729×10-2，0.475×10-2and 0.818×10-2ng/μL， meeting the demand of inspection and quarantine routine testing. To overcome the residual bodies of some insects and some pieces mixed samples， or several insects together mixed samples appeared in actual testing process， DNA extracted from single， multiple and mixed pest samples were detected and evaluated， further verifying the specificity of this method， the reliability and applicability.

Laspeyresia pomonella；Euzophera pyriella Yang；Grapholitha molesta；Blank cutworm；Real-time fluorescence quantitative PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.011

2014-09-26

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局資助項(xiàng)目（2012IK290），庫爾勒市重點(diǎn)科技項(xiàng)目

王鳳軍，女，碩士，工程師，研究方向：植物病害和轉(zhuǎn)基因檢測；E-mail：wfj0808@126.com，劉莎莎為共同第一作者

馮俊麗，女，博士，研究方向：病原微生物的分子檢測、檢驗(yàn)檢疫害蟲的分子鑒定；E-mail：fengjunli0722@foxmail.com