北京市藥品檢驗(yàn)所（北京市保健食品化妝品檢驗(yàn)中心）（100035）王似錦 劉文杰 張光華 牛振東 井良義 江志杰 高春

北京市藥品檢驗(yàn)所（北京市保健食品化妝品檢驗(yàn)中心）微生物室近些年參加了多項(xiàng)國(guó)內(nèi)和國(guó)際的能力驗(yàn)證，均取得了滿意的結(jié)果。此次，本室參加了由英國(guó)LGC（Laboratory of the Government Chemist政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室）組織的食品成分及微生物檢測(cè)（QSM-Quality in Microbiology PT）的第219輪第27號(hào)雙歧桿菌的計(jì)數(shù)試驗(yàn)（27 Bifidobacterium），并獲得了滿意的結(jié)果。下面將本次能力驗(yàn)證的結(jié)果和分析匯報(bào)如下，希望可以供相關(guān)的檢驗(yàn)、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和機(jī)構(gòu)作參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HFsafe-1500生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；厭氧盒和厭氧產(chǎn)氣袋（日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社）；KB720型生化培養(yǎng)箱（德國(guó)賓得）；奧林巴斯BX61顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）。ABI Veriti PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）

1.2 樣品 由LGC提供，西林瓶裝凍干粉。

1.3 稀釋液和培養(yǎng)基 稀釋液：ISO 29981-2010[1]標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的稀釋液QSR液（Quarter-strength Ringer’s solution），該稀釋液主要用于乳及乳制品的微生物檢驗(yàn)。QSR液的配制方法及滅菌條件：氯化鈉2.25g，氯化鉀0.105g，氯化鈣0.06g，碳酸氫鈉0.05g，溶解于1000ml水中，調(diào)節(jié)pH值于滅菌過(guò)后在6.9±0.2，滅菌條件121℃，15min。

培養(yǎng)基：ISO 29981-2010[1]標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的TOS瓊脂培養(yǎng)基，使用前需添加莫匹羅星鋰鹽。該培養(yǎng)基中含的TOS為一種通過(guò)β-半乳糖甘酶水解乳糖得到的混合物，該混合物能夠有效的促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)[1][2]。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.35-2010[3]中規(guī)定的改良MRS培養(yǎng)基，使用前添加莫匹羅星鋰鹽。培養(yǎng)基的配置和滅菌均按照標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定進(jìn)行。

附圖1 雙歧桿菌革蘭氏染色鏡檢顯微鏡圖

附表1 LGC能力驗(yàn)證雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果

附表2 雙歧桿菌計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證結(jié)果

2 方法

2.1 雙歧桿菌計(jì)數(shù)

2.1.1 稀釋液的制備 按照LGC提供的作業(yè)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行操作，取QSR液10 mL加入供試品西林瓶中，充分振搖，室溫放置60min，作為10g供試品。取10g供試品，加QSR液90 mL充分振搖作為1∶10的均勻稀釋液，取1∶10稀釋液1mL，置上述緩沖液9 mL中，即為1∶102的稀釋液，以此類推，制成1∶104的稀釋液。

2.1.2 雙歧桿菌計(jì)數(shù) 分別吸取1∶104、1∶103、1∶102及1∶10稀釋液各0.1ml分別置于添加了莫匹羅星鋰鹽的改良MRS瓊脂平板或添加了莫匹羅星鋰鹽的TOS瓊脂平板上，用L形棒進(jìn)行表面涂布，平行2份，同時(shí)分別取0.1ml稀釋液同法操作，作為空白對(duì)照，置37℃厭氧培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。以上操作分別重復(fù)3次。

2.2 雙歧桿菌的鑒定16S rDNA基因測(cè)序鑒定方法 采用快速DNA提取檢測(cè)試劑盒提取DNA，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物27f 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’1492r：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系： PCR MasterMix 20μl，純化水16μl，引物27f 1μl，引物1492r1μl，模板2μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min，之后的35個(gè)循環(huán)包括94℃ 預(yù)變性30 sec，55℃“退火”30sec，72℃延伸1min。35個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min，最后4℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物直接送到公司測(cè)序，測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。

3 結(jié)果與討論

3.1 雙歧桿菌的計(jì)數(shù)結(jié)果 由附表1可知，添加莫匹羅星鋰鹽的TOS瓊脂培養(yǎng)基的結(jié)果為2700cfu/g，略高于添加莫匹羅星鋰鹽的MRS瓊脂培養(yǎng)基2500cfu/g的結(jié)果。而且，同樣培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果，TOS培養(yǎng)基培養(yǎng)中生長(zhǎng)的菌落較大，而MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落較小，需要延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至72h。選擇添加了莫匹羅星鋰鹽的TOS瓊脂培養(yǎng)基的結(jié)果2700cfu/g為最終提交結(jié)果。

3.2 雙歧桿菌的鑒定結(jié)果 選取TOS培養(yǎng)基上的典型的單菌落，劃線于TOS培養(yǎng)基上，于37℃厭氧培養(yǎng)72h，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，結(jié)果見(jiàn)附圖1。該菌為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，成棒狀，略彎曲。通過(guò)16SrDNA基因序列的鑒定方法，得到該菌的鑒定結(jié)果為短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）。

3.3 雙歧桿菌計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證結(jié)果的反饋 結(jié)果提交約50天后，LGC將此次能力驗(yàn)證結(jié)果返回，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

Z值：由能力驗(yàn)證的指定值和能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算的偏倚的標(biāo)準(zhǔn)化度量。Z值的計(jì)算公式為：

其中，X為添加量（理論真值），x為本實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，SDPA（Standard deviation for proficiency assessment）為能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差，該值由組織者提供。|Z|≤2為結(jié)果滿意，2＜|Z|＜3為問(wèn)題結(jié)果，|Z|≥3為不滿意結(jié)果。

由附表2可知，本實(shí)驗(yàn)室此次能力驗(yàn)證采用添加莫匹羅星鋰鹽的TOS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)的方法，結(jié)果為2700cfu/g，Z值為0.37，為滿意結(jié)果，其中LGC給出的添加量（理論真值）為2000cfu/g。

4 結(jié)論

含有雙歧桿菌的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑作為食品或保健食品被廣泛使用，這類產(chǎn)品的質(zhì)量與其中含有的雙歧桿菌的數(shù)量直接相關(guān)，因此，雙歧桿菌數(shù)一般認(rèn)為是檢驗(yàn)這類產(chǎn)品的指標(biāo)性成分[4]。但是，雙歧桿菌的培養(yǎng)需要較高的營(yíng)養(yǎng)條件和較嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，因此，雙歧桿菌計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)?zāi)芰惋@得尤為重要。

北京市藥品檢驗(yàn)所（北京市保健食品化妝品檢驗(yàn)中心）微生物室通過(guò)參加英國(guó)LGC組織的食品成分及微生物檢測(cè)（QSM-Quality in Microbiology PT）的第219輪第27號(hào)雙歧桿菌的計(jì)數(shù)試驗(yàn)（27 Bifidobacterium），取得了滿意的結(jié)果（Z=0.37）。微生物室通過(guò)此次國(guó)際能力驗(yàn)證，提高了雙歧桿菌計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)?zāi)芰?，再次證明了培養(yǎng)基、環(huán)境以及人員等各系統(tǒng)能夠保證出具科學(xué)有效可靠的數(shù)據(jù)，在加強(qiáng)能力建設(shè)的道路上又邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。