黃漫華　葛鴻慶　陳文治　白有翼

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405；2.廣東省中醫(yī)院骨科，廣東廣州510370

葛根素誘導(dǎo)破骨細(xì)胞自噬的機制研究

黃漫華1葛鴻慶2陳文治2白有翼1

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405；2.廣東省中醫(yī)院骨科，廣東廣州510370

目的觀察葛根素（Pur）對破骨細(xì)胞自噬的影響，探討其誘導(dǎo)破骨細(xì)胞自噬的機制。方法采用骨髓干細(xì)胞分化的方式培養(yǎng)原代破骨細(xì)胞，并按加入Pur量的不同，分成10、50、100 μg/L的Pur組和空白對照組，采用免疫印跡技術(shù)（Western-Blot）檢測提取的自噬相關(guān)蛋白及Akt-mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果①10、50、100 μg/L濃度的Pur組與空白對照組比較，其膜型與胞質(zhì)型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3的比值（LC3Ⅱ/Ⅰ）均升高（P＜0.01）；10、100 μg/L濃度的Pur組與對照組比較，p62蛋白消耗均增加（P＜0.05）。②10、50、100 μg/L濃度的Pur組與空白對照組比較，酸化核糖體蛋白（p-s6）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）均消耗增多（P＜0.05）。結(jié)論Pur能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞自噬，Akt-mTOR通路或許是Pur誘導(dǎo)破骨細(xì)胞自噬的機制之一。

葛根素；破骨細(xì)胞；自噬；Akt-mTOR通路

葛根在最早的藥學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中便有記載，因其能治療“諸痹”等作用而成為治療骨質(zhì)疏松癥的一味常用而有效的中藥，它可增加骨密度和骨量，改善骨構(gòu)造而達(dá)到治療作用［1-2］。近年來研究顯示，中藥葛根在防治骨質(zhì)疏松癥的體內(nèi)外實驗方面都取得了良好的效果，而葛根素（puerarin，Pur）在葛根的提取物異黃酮類化合物中含量最高，是其特有的主要有效成分，因此Pur的作用機制研究成了研究葛根的熱點領(lǐng)域［3］。Pur能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞形成與分化［4］，增加血清堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)［5］，而且有文獻(xiàn)提出，Pur還能對破骨細(xì)胞的活性產(chǎn)生一定的抑制作用［6］。在分子水平上，有文獻(xiàn)指出，Pur能通過促進(jìn)自噬作用來保護(hù)1-甲基-4-苯基-吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷［7］。另外有研究提出，破骨細(xì)胞自噬水平的提高會對其活性及分化過程起負(fù)向調(diào)控作用［8］，但其具體機制尚未明確。本研究通過觀察不同濃度Pur組和不加入Pur的對照組對破骨細(xì)胞自噬的影響，探究其自噬的相關(guān)信號通路，旨在從分子水平上探討Pur對破骨細(xì)胞自噬的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

2月齡不分雌雄的昆明（KM）小鼠，無特定病原體（SPF）級，由廣東省中醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.2主要試劑及儀器

葛根素（阿拉丁公司，批號：CAS3681-99-0）；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素（美國，Hyclone公司）；BCA蛋白質(zhì)定量測定試劑盒（美國，Thermo公司）；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、酸化核糖體蛋白（ps6）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）和p62蛋白的單克隆抗體（美國，CST公司）；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（武漢博士德生物科技有限公司）；電泳儀和濕轉(zhuǎn)印儀（美國，Bio-Rad公司）；BNA-311/（2323）CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國，Espec公司）。

1.3細(xì)胞提取、培養(yǎng)及給藥方法

用原代培養(yǎng)破骨細(xì)胞的方式，采用骨髓干細(xì)胞定向分化的方法。將2月齡的KM小鼠斷頸處死后用75%醫(yī)用乙醇消毒，在無菌條件下取出小鼠的股骨與脛骨，用2 mL注射器抽出骨髓液，過濾后，按1×106細(xì)胞/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中。在初級培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和10%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液）中加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子（20 ng/ml），置于37℃恒溫、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換成次級培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、10%青鏈霉素、20 ng/ml的巨噬細(xì)胞集落刺激因子和50 ng/ml的核因子κB受體活化因子配體的α-MEM培養(yǎng)液），繼續(xù)在上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次新鮮的次級培養(yǎng)液，并依據(jù)細(xì)胞形態(tài)、抗酒石酸鹽磷酸酶染色法等方法鑒定出已分化的破骨細(xì)胞。將培養(yǎng)出的破骨細(xì)胞隨機分為4組：第1組為對照組，換液時不加入Pur；第2組為低劑量Pur組，按10 μg/L濃度加入Pur；第3組為中劑量的Pur組，按10 μg/L濃度加入Pur；第4組為高劑量的Pur組，按100 μg/L濃度加入Pur。繼續(xù)培養(yǎng)7 d后裂解細(xì)胞提取相關(guān)蛋白。

1.4蛋白質(zhì)印跡法（Western-blot）檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

采用Western-Blot檢測不同濃度Pur組和對照組LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Akt、p-Akt和p-s6的蛋白表達(dá)。提取各組細(xì)胞總蛋白，先用BCA（2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉）法進(jìn)行蛋白定量測定。加入上樣緩沖液，在95℃下變性10 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入LC3、p62、Akt、p-Akt和p-s6單克隆抗體，在4℃環(huán)境下過夜，接著用TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次，加入二抗，在室溫下孵育2 h，再次用TBST緩沖液洗膜。將得到的膜與電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑充分反應(yīng)后，曝光于X線膠片上，顯影、定影、掃描后進(jìn)行圖像分析。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對各個特異性條帶進(jìn)行累計吸光度檢測，最后以積分吸光度值（IOD）來表示。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用One-Way ANOVA檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同濃度Pur組和對照組破骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白的Western-blot檢測結(jié)果

與對照組比較，不同濃度Pur組LC3Ⅱ/Ⅰ比值均升高，且濃度越高，比值越大，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1～2。采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為實驗操作的標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，不同濃度Pur組和對照組相比，p62蛋白的消耗均增多，且10 μg/L與100 μg/L Pur組比對照組的p62/GAPDH比值小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.019、0.036）。見圖3～4。

圖1　不同濃度葛根素組和對照組LC3的Western-blot結(jié)果

圖2　不同濃度葛根素組和對照組LC3Ⅱ/Ⅰ值

圖3　不同濃度葛根素組和對照組的p62 Western-blot結(jié)果

圖4　不同濃度葛根素組和對照組的p62/GAPDH值

2.2不同濃度Pur組和對照組破骨細(xì)胞Akt-mTOR信號通路相關(guān)蛋白p-Akt、Akt和p-s6蛋白的Western-blot檢測結(jié)果

不同濃度Pur組的p-Akt/Akt比值與對照組相比均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖5～6。不同濃度Pur組的p-s6均受到明顯抑制（P＜0.01）；對p-s6蛋白進(jìn)行Western-blot檢測時，同樣使用GAPDH作為實驗操作的標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，不同濃度Pur組的p-s6/GAPDH比值與對照組相比均較小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖7～8。

圖5　不同濃度葛根素組和對照組的p-Akt、Akt的Western-blot結(jié)果

圖6　不同濃度葛根素組和對照組的p-Akt/Akt值

圖7　不同濃度葛根素組和對照組的p-s6 Western-blot結(jié)果

圖8　不同濃度葛根素組和對照組的p-s6/GAPDH值

3　討論

破骨細(xì)胞是一種廣泛存在于骨組織的高度分化多核巨細(xì)胞，其細(xì)胞足體固定在骨質(zhì)表面，能發(fā)揮骨吸收功能。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在正常人體的骨質(zhì)中處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦出現(xiàn)失衡，將會導(dǎo)致相應(yīng)的骨病，常見的是骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病，為臨床上常見的骨代謝病，主要由于破骨細(xì)胞的吸收增加和成骨細(xì)胞功能衰減導(dǎo)致的骨組織退行性變，因此治療上主要從如何抑制骨吸收和促進(jìn)骨生成方面考慮［9-12］。越來越多的文獻(xiàn)表明，在骨組織及各類骨細(xì)胞發(fā)育成熟過程中，甚至在骨類疾病中發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象，其通過調(diào)節(jié)自噬來影響，甚至可以改變骨組織中成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞之間的平衡，從而改善骨類疾病的預(yù)后，這已成為當(dāng)前研究的熱點［13］。細(xì)胞自噬是一位比利時科學(xué)家在1963年的溶酶體國際會議上首次提出的，是細(xì)胞內(nèi)主要的降解系統(tǒng)，通過將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)包裹并傳遞到溶酶體中進(jìn)行降解，產(chǎn)生氨基酸和能量，維持細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)與能量平衡，這對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生存至關(guān)重要［14］，能在細(xì)胞質(zhì)中形成雙層膜囊泡，將壞死的細(xì)胞器（線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）或長半衰期蛋白包裹，形成自噬小體，再將其運送至溶酶體，將小體內(nèi)容物水解消化，再釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)循環(huán)使用［15］。Pur能有效抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能［16］，能夠使破骨細(xì)胞的自噬作用加強，但其具體機制尚缺乏相關(guān)研究。

本研究通過觀察Pur對破骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白（LC3和p62蛋白）和Akt-mTOR信號通路相關(guān)蛋白（Akt、p-Akt和p-s6蛋白）表達(dá)的影響，證實Pur能有效促進(jìn)破骨細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)Akt-mTOR信號通路對該自噬變化有重要作用。LC3是哺乳動物自噬相關(guān)基因8（ATG8）的同源物，當(dāng)自噬激活時，LC3被剪切為LC3Ⅰ，然后被激活進(jìn)而轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ，而后者是自噬泡膜的重要組成部分，因此，LC3Ⅱ/Ⅰ在一定程度上能代表自噬的激活程度［17］。p62（SQSTM1）是自噬活性的標(biāo)記蛋白，反映自噬泡的清除速率，該蛋白表達(dá)增高則提示自噬流受抑制［18］。Akt-mTOR通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和凋亡的一種重要通路，而Akt蛋白在這條通路中起十分重要的作用［19］。Akt蛋白可以在多種酶和轉(zhuǎn)錄因子的作用下活化，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。Akt蛋白磷酸化后成為p-Akt蛋白，通過復(fù)雜的反應(yīng)后可以阻止部分調(diào)控蛋白的負(fù)調(diào)控，進(jìn)而激活蛋白翻譯，加快細(xì)胞生長而發(fā)揮抗凋亡作用。有研究結(jié)果顯示，p-Akt蛋白表達(dá)水平高，則凋亡細(xì)胞數(shù)少，p-Akt蛋白表達(dá)水平低，則凋亡細(xì)胞數(shù)多［20］；所以Akt蛋白和p-Akt蛋白是AktmTOR通路的重要調(diào)節(jié)蛋白。p-s6蛋白是Akt-mTOR通路活化的效應(yīng)蛋白，對p-s6蛋白的測量可以在很大程度上了解Akt-mTOR通路的激活情況。本研究中不同濃度Pur組較空白對照組均表現(xiàn)出LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高，而且隨著Pur濃度的增高，其比值也相應(yīng)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與此同時，10 μg/L和100 μg/L Pur組的p62蛋白與空白對照組比較，其消耗明顯增加，因此認(rèn)為，Pur有可能通過促進(jìn)自噬表達(dá)的水平而抑制破骨細(xì)胞的活性。通過檢測Pur對破骨細(xì)胞AktmTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，不同濃度Pur組與對照組相比，細(xì)胞的Akt蛋白和p-Akt蛋白的表達(dá)均有不同程度下降，而代表Akt-mTOR通路活化程度的p-s6蛋白表達(dá)減少，說明Pur對Akt-mTOR信號通路的相關(guān)蛋白具有抑制作用，這可能是Pur誘導(dǎo)自噬細(xì)胞激活的關(guān)鍵信號通路之一。

本實驗結(jié)果從分子水平上說明Pur有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞自噬的作用，而Akt-mTOR信號通路可能是Pur誘導(dǎo)破骨細(xì)胞自噬變化的機制之一，但Akt-mTOR信號通路是否為其有效的主要通路，仍需后續(xù)實驗從不同角度驗證其作用，另外其他相關(guān)信號通路是否也參與此過程，還有待進(jìn)一步研究。

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Mechanism study of autophagy in osteoclasts induced by puerarin

HUANG Manhua1GE Hongqing2CHEN Wenzhi2BAI Youyi1
1.The Second Clinical Medical College，Guangzhou University of TCM，Guangdong Province，Guangzhou510405，China；2.Department of Traumatology&Orthopedics，Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Province，Guangzhou510370，China

Objective To investigate the signaling pathway of puerarin on osteoclasts through autophagy.Methods Osteoclasts were derived from bone marrow stem cells and divided into four groups based on the treated with different concentration of puerarin（0，10，50，100 μg/L groups）.Expression of LC3Ⅱ/Ⅰ，p62，Akt，p-Akt and p-s6 were analyzed by Western-Blot.Results①Increased LC3Ⅱ/Ⅰlevel（10，50，100 μg/L groups）and decreased p62 expression（10，100 μg/L groups）were observed in puerarin-treated groups compared with normal group（P＜0.01 or P＜0.05）.②Puerarin inhibited the expression of p-Akt，Akt and p-s6（P＜0.05）.Conclusion Puerarin can promote the autophagy of osteoclasts and may regulate via Akt-mTOR signaling pathway.

Puerarin；Osteoclasts；Autophagy；Akt-mTOR signal transduction pathway

R285.5

A

1673-7210（2015）05（c）-0020-04

2015-02-25本文編輯：李亞聰）

黃漫華（1988-），男，廣州中醫(yī)藥大學(xué)2012級中醫(yī)骨傷科學(xué)在讀碩士研究生；主要研究方向：中醫(yī)藥治療骨科疾病。

葛鴻慶（1974-），男，博士，副主任醫(yī)師，副教授；主要研究方向：創(chuàng)傷骨科。