張小藝+孟紅艷+彭敏+司皓+馬宏博

[摘要] 目的 構(gòu)建Toll樣受體（TLR）4基因慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的小干擾RNA（siRNA），觀察其對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383 TLR4的沉默效應(yīng)。 方法 設(shè)計(jì)4條針對(duì)TLR4基因的siRNA靶序列，經(jīng)合成、退火、酶切，與線性載體GV115連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）篩選陽性克隆、測(cè)序鑒定。共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒，分別感染NR8383細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)NR8383細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)。根據(jù)篩選結(jié)果，選取最有效的載體進(jìn)行病毒大量包裝。 結(jié)果 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，慢病毒載體構(gòu)建成功并獲得相應(yīng)的慢病毒，NR8383細(xì)胞感染慢病毒后，TLR4基因mRNA表達(dá)明顯下降，LV-TLR4-RNAi（Tgt-2）作用較明顯，敲減效率達(dá)到65%。 結(jié)論 成功構(gòu)建針對(duì)靶向大鼠TLR4基因的RNAi慢病毒載體，為進(jìn)一步研究TLR4信號(hào)通路在急性肺損傷中的作用奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] Toll樣受體（TLR4）；RNA干擾；慢病毒

[中圖分類號(hào)] R392 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）10（b）-0004-05

Construction of Lenti-TLR4-siRNA and its effect on rat alveolar macrophage NR8383

ZHANG Xiaoyi1 MENG Hongyan1 PENG Min1 SI Hao2 MA Hongbo1

1.Department of Traditional Chinese Medicine， Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University， Shandong Province， Ji′nan 250021， China； 2.School of Public Health， Shandong University， Shandong Province， Ji′nan 250012， China

[Abstract] Objective To construct the lentiviral vector-mediated small interfering RNA（siRNA） of TLR4， and examine the silent effect on the rat alveolar macrophage NR8383. Methods 4 siRNA sequences targeting TLR4 gene were designed. After synthesis， annealing and restriction enzyme digestion， TLR4-RNAi were ligated with GV115， transformed into competent bacterial cells， and confirmed by PCR and DNA sequencing. 293 T cells were co-transfected. The four kinds of recombinant lentiviruses were used to infect NR8383 cells， and the expression levels of TLR4 mRNA were detected by RT-PCR. According to the result， the most effective vector was selected for viruses amounts of packaging. Results 4 Lenti-TLR4-siRNA sequences were successfully inserted into the lentiviral vectors. The TLR4 expression in NR8383 cells infected with lentiviral vectors was significantly inhibited at mRNA levels when compared with that in the non-transfected and empty vector-transfected NR 8383 cells. The effect was most significant in NR8383 cells infected with LV-TLR4-RNAi（Tgt-2）. The TLR4 mRNA expression was decreased by 65%. Conclusion Successful construction of lentiviral vector RNAi on rat with targeted TLR4 gene lay the foundation for further studying the role of TLR4 signaling pathway in acute lung injury.

[Key words] Toll like receptor 4； RNA interference； Lentivirus

內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）是導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的重要因素，Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）是LPS信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的“門戶蛋白”[1]，其信號(hào)通路的過度激活是導(dǎo)致炎性反應(yīng)爆發(fā)失控的重要機(jī)制。TLR4可以選擇性識(shí)別LPS，LPS與單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞細(xì)胞膜上的TLR4結(jié)合，引起炎癥瀑布效應(yīng)[2]。調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路有可能成為膿毒癥的一種治療策略[3]。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）近年來取得相當(dāng)大的進(jìn)展，研究人員利用RNAi作為研究工具引入到細(xì)胞或整個(gè)生物RNAi試劑，用以識(shí)別新的細(xì)胞通路和潛在的藥物靶點(diǎn)[4]。慢病毒載體是一種高效率的轉(zhuǎn)基因和基因治療工具，其最大優(yōu)勢(shì)在于能夠感染分裂和靜止?fàn)顟B(tài)下的細(xì)胞，并且能夠高效、穩(wěn)定地整合于宿主細(xì)胞內(nèi)[5]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建TLR4 siRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染至大鼠巨噬細(xì)胞NR8383，并通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)TLR4 siRNA干擾的效果，為進(jìn)一步探討TLR4信號(hào)通路在ALI發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)試劑，Primer（R&F）合成、dsDNA oligo、293T細(xì)胞株、大腸埃希菌菌株DH5α、病毒載體均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供；Taq酶、SYBR Master Mixture購于TaKaRa；Age Ⅰ、EcoR Ⅰ、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer來自于NEB；QIAGEN Plasmid大抽Kit來自QIAGEN；Rnase Inhibitor、dNTP、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購于Promega；Lipofectamine 2000、Trizol購自Invitrogen；ECL-PLUS/Kit購于Amersham公司；positive clone測(cè)序由上海美季生物技術(shù)有限公司完成；胎牛血清、DMEM購自Gibco公司；Opti-MEM購自Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 TLR4基因RNAi慢病毒載體構(gòu)建

1.2.1.1 siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì) 針對(duì)TLR4目的基因靶基因序列，采用Invitrogen軟件（https：//rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/）設(shè)計(jì)4個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列。見表1。

表1 TLR4 siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

1.2.1.2 RNAi慢病毒載體構(gòu)建 工具載體選擇GV115，框架結(jié)構(gòu)為hU6-MCS-CMV-EGFP，酶切位點(diǎn)：Age Ⅰ，EcoR Ⅰ。合成含干擾序列的DNA oligo，經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)Age Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后的載體連接。見表2。

1.2.1.3 克隆制備與鑒定 通過T4 DNA ligase將酶切回收的載體和DNA片段進(jìn)行鏈接反應(yīng)，將鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的DH5α細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子重懸于10 μL LB溶液，使用GV115通用引物，進(jìn)行菌落PCR鑒定實(shí)驗(yàn)。將PCR陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)結(jié)果比對(duì)，確認(rèn)測(cè)序引物與鑒定引物中的上游引物相同即為構(gòu)建成功的TLR4目的基因RNAi慢病毒載體。測(cè)序結(jié)果通過Chromas軟件進(jìn)行分析。PCR鑒定陽性克隆的引物為：上游5′-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3′，下游5′-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3′。PCR鑒定的分組為1：陰性對(duì)照（ddH2O）；2：陰性對(duì)照（空載）；3：Marker自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；4：TLR4-RNAi轉(zhuǎn)化子（a：Tgt-1；b：Tgt-2；c：Tgt-3；d：Tgt-4）。

1.2.2 RNAi慢病毒小量包裝

制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集293T細(xì)胞上清液，過濾離心后取病毒濃縮液，分裝后保存在病毒管中，-80℃保存，取1支以熒光法進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測(cè)定。

1.2.3 慢病毒感染細(xì)胞

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞大鼠肺巨噬細(xì)胞株NR8383購自ATCC公司，培養(yǎng)于含15%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、L-谷氨酰胺（2 mmo/L）、NaHCO3（1.5 g/L）的Ham′s F12培養(yǎng)基中，細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 NR8383細(xì)胞慢病毒感染 將處于對(duì)數(shù)生長期的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，接種于6-well培養(yǎng)板培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%，按設(shè)計(jì)組別分別加入慢病毒顆粒進(jìn)行NR8383細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)，12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如無明顯細(xì)胞毒性，連續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基。感染3 d后熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)，熒光率達(dá)80%以上，收集細(xì)胞，感染效率低于80%的實(shí)驗(yàn)組，重新進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。見表3。

1.2.4 qPCR內(nèi)源篩靶

收集生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞，提取RNA，總RNA抽提根據(jù)Trizol操作說明書進(jìn)行。RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，按照M-MLV操作說明書進(jìn)行，采用RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。TLR4上游引物序列：5′-ATGAGGACTGGGTGAGAAACG-3′，下游引物序列：5′-ATGCCAGAGCGGCTACTCA-3′，擴(kuò)增長度：247 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列：5′-TTCAACGG-CACAGTCAAGG-3′，下游引物序列：5′-CTCAGCAC-CAGCATCACC-3′，擴(kuò)增長度：114 bp。用TP800序列檢測(cè)系統(tǒng)軟件（TaKaRa公司）制作擴(kuò)增曲線并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，依據(jù)2-ΔΔCt數(shù)據(jù)分析法，比較各組TLR4基因mRNA表達(dá)水平。

1.2.5 有效靶點(diǎn)慢病毒大量包裝及驗(yàn)證內(nèi)源性目的基因表達(dá)敲減

根據(jù)RT-PCR結(jié)果，篩選出敲減效率最高的1個(gè)RNAi有效靶點(diǎn)，進(jìn)行慢病毒大量包裝。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陽性克隆的PCR鑒定

載體上的引物進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其大小和完整性，每個(gè)序列陽性克隆各取3個(gè)樣品菌種送上海美季公司測(cè)序，結(jié)果通過Chromas軟件進(jìn)行分析。鑒定電泳結(jié)果顯示，TLR4 vshRNA片段已經(jīng)成功插入質(zhì)粒，挑選的陽性克隆菌液測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)要求的DNA序列完全一致。見圖1。

2.2 慢病毒滴度測(cè)定

測(cè)定前1 d為293T細(xì)胞鋪板，每孔加4×104個(gè)細(xì)胞，在Eppendorf管中加入90 μL無血清培養(yǎng)基，將10 μL病毒原液加入到第1個(gè)管中，混勻后取10 μL加入到第2個(gè)管中，如此分別稀釋為1/10～1/100萬，感染293T細(xì)胞，24 h后加入完全培養(yǎng)基100 μL，4 d后，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，通過GFP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定LV-TLR4-RNAi（Tgt-1、2、3、4）的滴度分別為5×108、4×108、4×108、5×108 TU/mL。

2.3 慢病毒感染細(xì)胞

感染后16 h更換培養(yǎng)基，感染后96 h熒光拍照。圖2顯示各組慢病毒成功感染NR8383細(xì)胞。

圖2 熒光顯微鏡下慢病毒感染NR8383細(xì)胞GFP的表達(dá)（100×）

2.4 RT-PCR內(nèi)源篩靶

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，NR8383細(xì)胞中，相對(duì)于陰性對(duì)照組，KD2組TLR4基因敲減效率達(dá)到65%（P < 0.05）（圖3，封三），認(rèn)為是KD2有效靶點(diǎn)。

2.5 病毒大量包裝后的靶點(diǎn)再次驗(yàn)證

根據(jù)RT-PCR篩選結(jié)果，選取敲減效率最高的KD2號(hào)靶點(diǎn)進(jìn)行病毒的大量包裝后，經(jīng)定量PCR測(cè)定，在NR8383細(xì)胞中，相對(duì)于NC、KD2組TLR4基因敲減效率達(dá)到90.1%（P < 0.05）。

3 討論

ALI發(fā)病的關(guān)鍵是一種肺內(nèi)過度性、失控性的炎性反應(yīng)，多種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)相互的激活與釋放，導(dǎo)致瀑布式的炎性反應(yīng)，形成肺的過度損傷[6-7]。研究表明，ALI患者TLR4的表達(dá)水平與急性肺部炎癥程度及氣道上皮細(xì)胞的損傷、肺部中性粒細(xì)胞增加相關(guān)[8]。TLR4可以早期識(shí)別侵入體內(nèi)的細(xì)菌啟動(dòng)炎性反應(yīng)，核因子（NF）-κB、激活蛋白-1（AP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等的激活均為其下游事件，最終導(dǎo)致多種炎性因子的瀑布式釋放，放大炎癥效應(yīng)[9]。研究證實(shí)，TLR4基因缺陷小鼠對(duì)內(nèi)毒素的敏感性明顯下降，肺組織病理損傷和肺水腫程度減輕[10]，以TLR4基因?yàn)榘悬c(diǎn)，從上游調(diào)控這種瀑布式的炎癥效應(yīng)，可為治療急性感染性疾病提供一種新的策略[11]。

RNAi技術(shù)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的基因沉默技術(shù)，RNAi能夠非常特異地降解與之序列相應(yīng)單個(gè)內(nèi)源基因mRNA，相對(duì)少量的dsRNA就可以使表型達(dá)到缺失突變體程度，抑制基因表達(dá)效率很高[12-14]，已成為研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的良好工具。RNAi技術(shù)在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)增強(qiáng)免疫反應(yīng)、控制炎癥和治療自身免疫性疾病中都發(fā)揮了作用[15]。

RNAi的沉默效應(yīng)與基因的轉(zhuǎn)染效率密切相關(guān)[16]?；蜣D(zhuǎn)染的方法可分為病毒轉(zhuǎn)染和非病毒轉(zhuǎn)染，常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體[17]。慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞，轉(zhuǎn)移基因片段容量較大，目的基因表達(dá)時(shí)間較長，還可整合到宿主細(xì)胞的染色體基因組上，不易引發(fā)宿主免疫反應(yīng)[18-20]，已成為基因功能研究及基因治療領(lǐng)域中熱門的基因轉(zhuǎn)移載體[21]。

本研究成功構(gòu)建了4個(gè)TLR4基因RNAi慢病毒表達(dá)載體，具有較高滴度，4種慢病毒載體感染大鼠肺巨噬細(xì)胞NR8383后，TLR4基因mRNA表達(dá)量均明顯下降，其中LV-TLR4-RNAi（Tgt-2）抑制作用最明顯，使mRNA表達(dá)下降65%，將2號(hào)靶點(diǎn)進(jìn)行病毒的大量包裝后，TLR4基因敲減效率達(dá)到90.1%，表明本研究構(gòu)建的慢病毒RNAi表達(dá)載體在NR8383細(xì)胞內(nèi)能有效地沉默TLR4基因表達(dá)，為后續(xù)研究TLR4信號(hào)通路在ALI發(fā)病過程中的作用及中藥干預(yù)的靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] S？覿emann MD，Weichhart T，Zeyda M，et al. Tamm-Horsfall glycoprotein links innate immune cell activation with adaptive immunity via a Toll-like receptor-4 dependent mechanism [J]. J Clin Invest，2005，115（2）：468-475.

[2] 王晶晶，楊敬平，齊明祿.TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路與膿毒癥相關(guān)性研究[J].臨床肺科雜志，2015，20（4）：725-727.

[3] Wittebole X，Castanares-Zapatero D，Laterre PF. Toll-like receptor 4 modulation as a strategy to treat sepsis [J]. Mediators Inflamm，2010，2010：568396.

[4] Stephanie EM，Jennifer AS，Caroline ES，et al. RNAi screening comes of age：improved techniques and complementary approaches [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（9）：591-600.

[5] 張曼，孫秀萍，宋銘晶.慢病毒載體用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2014，8（10）：1949-1953.

[6] 李玉梅，衛(wèi)洪.ALI/ARDS抗炎治療研究的策略與展望[J].中國病理生理雜志，2009，25（4）：813-816，825.

[7] 雷馬文，王德明.miRNA：急性肺損傷中新的調(diào)控分子[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（11）：27-28.

[8] Togbe D，Schnyder-Candrian S，Schnyder B，et al. TLR4 gene dosage contributes to endotoxin-induced acute respiratory inflammation [J]. J Leukoc Biol，2006，80（3）：451-457.

[9] 唐婧，莫中成，王德明.TLR4在急性肺損傷中的作用[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2013，41（5）：516-519.

[10] 張進(jìn)祥，王慧，徐建波，等.Toll樣受體4在急性肺損傷中的作用[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2006，15（8）：692-695.

[11] 王娜，張雪梅，陳立杰.TLR4信號(hào)通路與炎癥相關(guān)性疾病[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2015，19（5）：857-860.

[12] Moffat J，Sabatini DM. Building mammalian signalling pathways with RNAi screens [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7（3）：177-187.

[13] 李再新，王慧.RNAi作用機(jī)制及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].四川理工學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，18（3）：19-21.

[14] Chad VP，George AC，Robert LC，et al. RNA interference in the clinic：challenges and future directions [J]. Nat Rev Cancer，2011，11（1）：59-67.

[15] Chih-PM，YenYL，ChienFH，et al. Immunological research using RNA interference technology [J]. Immunology，2007，121（3）：295-307.

[16] 阮靜，王旭，李煜生，等.沉默Toll樣受體4基因表達(dá)的RNAi慢病毒載體的構(gòu)建[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（20）：3693-3696.

[17] 陳巖，賴垂金，李雯，等.不同基因轉(zhuǎn)染方法對(duì)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2015，23（2）：166-169.

[18] 喻鈞，潘鐵成，魏翔，等.TLR3基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，42（2）：167-171.

[19] 丁震宇，梁后杰.慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2009，38（4）：15-19.

[20] 孟凡榮，陳琛，萬海粟，等.慢病毒載體及其研究進(jìn)展[J].中國肺癌雜志，2014，17（12）：870-876.

[21] Pluta K，Kacprzak MM. Use of HIV as a gene transfer vector [J]. Acta Biochim Pol，2009，56（4）：531-595.

（收稿日期：2015-06-08 本文編輯：李亞聰）