張超 王祥紅 徐濤 李帥 錢浩 李帥 張增虎

（中國海洋大學海洋生命學院，青島　266003）

一株解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其抑菌條件研究

張超 王祥紅 徐濤 李帥 錢浩 李帥 張增虎

（中國海洋大學海洋生命學院，青島266003）

旨在從海洋環(huán)境中分離篩選抑制鱸魚病原鰻弧菌的拮抗菌，進行菌種鑒定，并對其抑菌條件及藥物敏感性進行研究。采用十字交叉劃線法和平板點種法篩選鱸魚病原鰻弧菌的拮抗菌，采用形態(tài)學、生理生化反應及16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析方法對分離拮抗菌進行鑒定，采用單因子變量法對拮抗菌WTD的最佳抑菌條件進行研究，采用平板藥敏紙片法對其藥物敏感性進行研究。結果顯示，從海洋環(huán)境樣品中分離出126株細菌，篩選出19株拮抗菌。其中菌株WTD的拮抗效果最強，細菌鑒定結果表明，該菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。最佳抑菌條件研究表明，該菌在溫度35℃、pH7、鹽度為1% NaCl的時候，拮抗效果最好。藥敏實驗結果表明，該菌對麥迪霉素等29種抗生素敏感，而對多粘菌素具有抗性。拮抗菌解淀粉芽孢桿菌WTD對鱸魚病原菌鰻弧菌有較強的抑制作用，具有潛在的應用價值。

解淀粉芽孢桿菌；鰻弧菌；抑菌作用；拮抗菌

近年來，我國的水產養(yǎng)殖業(yè)得到了迅速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大。由于養(yǎng)殖動物的殘餌、排泄物和死亡殘體等對近岸海水的污染，使養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境遭到破壞，直接危害了養(yǎng)殖對象，是暴發(fā)性病害頻繁發(fā)生的重要原因，給整個水產養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失，制約了水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展［1-5］。目前，為了防止病害發(fā)生，人們大量使用抗生素和化學藥物，但只能暫時抑制病害的發(fā)生，抗生素殺死或抑制了敏感細菌而保留了耐藥性的細菌［6，7］，破壞和干擾了養(yǎng)殖環(huán)境中自然微生物生態(tài)系統(tǒng)的平衡及養(yǎng)殖動物的微生態(tài)平衡［8，9］，反而增加了養(yǎng)殖動物感染病菌的機會?？股卦陴B(yǎng)殖動物體內的殘留影響了養(yǎng)殖產品的質量，在環(huán)境中的殘留會造成環(huán)境污染并最終對人類造成危害［10］。

通過在養(yǎng)殖水體及餌料中加入有益微生物（Probiotics）來調節(jié)和改善養(yǎng)殖海水生態(tài)環(huán)境及養(yǎng)殖生物微生態(tài)環(huán)境，提高養(yǎng)殖動物的免疫力，抑制病原微生物來控制和減少養(yǎng)殖動物病害的發(fā)生，是解決水產養(yǎng)殖病害問題的根本途徑［11］。

本研究從海洋環(huán)境中分離細菌，從中篩選出對養(yǎng)殖魚類病原菌鰻弧菌W-1有抑制作用的拮抗菌，并對抑菌作用較強的菌株WTD的抑菌條件和藥物敏感性進行研究，旨在為今后在水產養(yǎng)殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原弧菌 鰻弧菌（Vibrio anguillarum）W-1菌株由本實驗室分離于患病的日本花鱸（Lateolabrax japonicus）魚苗。

1.1.2 培養(yǎng)基 2216E海洋培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，磷酸鐵0.01 g，瓊脂粉20 g，陳海水1 000 mL，pH調節(jié)至7.6。高鐵碳水化合物培養(yǎng)基：每1升培養(yǎng)基中含有酵母膏10 g，蛋白胨5 g，可溶性淀粉20 g，瓊脂粉30 g，磷酸鐵5 g，pH調節(jié)至7.6。

1.2 方法

1.2.1 微生物的分離 用無菌采樣瓶采取樣水樣、泥樣和砂樣，樣品來自青島沿海海濱及養(yǎng)殖場、廈門和石島沿海。取水樣和泥樣用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋；無菌操作涂布2216E海洋瓊脂平板，置28℃溫箱培養(yǎng)2-7 d，取平板上的優(yōu)勢菌落進行平板劃線純化，獲得的菌種置于-80℃冰箱保藏。

1.2.2 拮抗菌的篩選

1.2.2.1 十字交叉劃線法 將海水養(yǎng)殖魚類病原菌（敏感菌）鱸魚致病鰻弧菌W-1在28℃培養(yǎng)24 h，在2216E海洋瓊脂平板上劃直線，劃線后馬上將待篩實驗菌株與敏感菌株垂直相交劃線，在28℃培養(yǎng)1-2 d，觀察有無抑菌區(qū)，有抑菌現(xiàn)象的為拮抗細菌。

1.2.2.2 平板點種法 將海水養(yǎng)殖魚類病原菌（敏感菌）鱸魚致病鰻弧菌在28℃培養(yǎng)24 h，用滅菌生理鹽水將斜面上的菌液洗下，用血球計數(shù)板將菌懸液濃度調至106Cell/mL的數(shù)量級，取0.1 mL菌液涂布于2216E海洋瓊脂平板上，將待篩菌株在此平板上點種或劃線，在28℃培養(yǎng)2-4 d，觀察有無抑菌圈，有抑菌圈的為拮抗細菌。

1.2.3 拮抗菌的細菌鑒定 根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的實驗方法，對菌株形態(tài)及理化特性進行鑒定［12］。利用分子生物學方法對細菌的16S rDNA進行提取與測序。抽取細菌DNA所用的試劑盒為上海生工生物工程技術服務公司生產的細菌基因組DNA抽提試劑盒（UNIQ-10柱式），具體方法參見說明書。PCR擴增16S rDNA基因采用通用引物，正向引物為：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物為：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3'。PCR反應體系為：TaKaRa Taq（5 U/μL）0.25 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Free）5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，模板DNA 1 μL，兩種引物各1 μL，雙蒸水34.75 μL。PCR反應條件為：96℃ 5 min，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min，-20℃保存。所得到的樣品序列送由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，利用NCBI進行blast分析，同現(xiàn)有細菌序列作比對。所用測序儀器為ABI-PRISM3730，測序試劑為BigDyeterminator v3.1。利用Mega5.2軟件繪制系統(tǒng)進化樹，確定菌株的系統(tǒng)進化地位。

1.2.4 拮抗菌抑菌條件的研究

1.2.4.1 pH對拮抗菌抑菌作用的影響 制備pH值分別為6、7、8和9的海洋瓊脂平板，分別取0.1 mL敏感菌W-1菌液（106Cell/mL）涂布于各種pH的2216E海洋瓊脂斜面上，將實驗菌株在此平板上點種，在28℃培養(yǎng)2-4 d，觀察抑菌圈大小，以抑菌圈直徑與菌落直徑比作為抑菌能力強弱標準。

1.2.4.2 溫度對拮抗菌抑菌作用的影響 取0.1 mL敏感菌W-1菌液（106Cell/mL）涂布于2216E海洋瓊脂平板上，將實驗菌株在此平板上點種，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃培養(yǎng)2-4 d，觀察抑菌圈大小，以抑菌圈直徑與菌落直徑比作為抑菌能力強弱標準。

1.2.4.3 鹽度對拮抗菌抑菌作用的影響 制備鹽度分別為0%NaCl、1%NaCl、2%NaCl、3%NaCl、4% NaCl、5%NaCl和6%NaCl的2216E海洋瓊脂平板，分別取0.1 mL敏感菌W-1菌液（106Cell/mL）涂布于各種鹽度的2216E海洋瓊脂平板上，將實驗菌株在此平板上點種，在28℃培養(yǎng)2-4 d，觀察抑菌圈大小，以抑菌圈直徑與菌落直徑比作為抑菌能力強弱標準。

1.2.5 拮抗菌的藥敏實驗 菌株WTD的藥敏實驗方法參照文獻［13］的方法進行。將海水養(yǎng)殖魚類病原菌（敏感菌）鱸魚致病鰻弧菌在28℃培養(yǎng)24 h，用滅菌生理鹽水將斜面上的菌液洗下，用血球計數(shù)板將菌懸液濃度調至106Cell/mL的數(shù)量級，取0.1 mL菌液涂布于2216E海洋瓊脂平板上，然后將藥敏片用鑷子輕輕夾住放在平板上，倒置在28℃培養(yǎng)相應的時間，觀察抑菌圈大小，并按照說明書確定是否有抑菌效果。

2 結果

2.1 拮抗菌的篩選

以鰻弧菌W-1為敏感菌對分離的菌株進行逐一進行拮抗實驗，共篩選到19株拮抗菌，其中菌株1-B2、1-B1、2-A1、5-C1、5-C2和5-C3分離自青島石老人海水養(yǎng)殖場的海水，菌株SMD、SMB2-2和SN1D分離自石島海水，菌株XM5-2、XM8-1和XM9-2分離自廈門海水，菌株QX、QE、QF和QQ分離自青島棧橋海泥，菌株CB分離自青島近海海水，菌株WTE和WTD分離自青島第二海水浴場的海水。從細菌采集的地點及分離得到的拮抗菌數(shù)目來看，可以得出在海水養(yǎng)殖場中拮抗菌的數(shù)目最多，其中菌株5-C3、XM5-2、XM9-2和WTD拮抗能力比較強，而菌株WTD的拮抗抑菌能力最強，作為進一步研究的菌株（表1）。菌株WTD對敏感菌W-1在2216E海洋瓊脂培養(yǎng)基平板上的抑菌效果，見圖1和圖2。

表1 拮抗菌菌株來源及對敏感鰻弧菌w-1的抗菌效果

圖1 拮抗菌菌株WTD抑制敏感菌株W-1生長的抑菌圈照片（平板點種法，點種的菌為WTD）

2.2 拮抗菌WTD的菌種鑒定

2.2.1 拮抗菌WTD的形態(tài)特征 菌株在2216E海洋瓊脂平板上培養(yǎng)24 h后，菌體呈長桿狀，Gram染色為陽性，染色均勻，有鞭毛，鞭毛周生，具運動性，專性好氧，可形成內生芽孢，芽孢橢圓形，不膨大，位于菌體中央。菌落圓形，白色，不透明，邊緣不整齊，在2216E海洋瓊脂培養(yǎng)基上不產生色素，在含高鐵的碳水化合物培養(yǎng)基中可以產生普切明紅色色素。

2.2.2 拮抗菌WTD的生理生化反應特征 細菌WTD的部分生理生化反應結果（表2）表明，菌株WTD不發(fā)光、發(fā)酵葡萄糖產氣、產生吲哚、檸檬酸鹽利用陰性、V. P. 反應陽性、甲基紅反應陰性、硫化氫產生陽性，過氧化氫酶、氧化酶、淀粉酶陽性、明膠酶弱陽性，苯丙氨酸脫氫酶、藻膠酶陰性、卵磷脂酶、酪蛋白酶、脲酶陽性，O/F反應葡萄糖為氧化型，D-半乳糖、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、棉籽糖、蔗糖和D-蕈糖為F型。

圖2 拮抗菌菌株WTD抑制敏感菌株W-1生長的抑菌圈照片（十字交叉劃線法，橫線為W-1）

表2 菌株WTD的部分生理生化反應特征

2.2.3 細菌的16S rDNA序列的分析 菌株WTD的16S rDNA序列經過測定后提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號是HM146083，利用NCBI的Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進行比對，確定為芽孢桿菌屬細菌。其中與其擬合度為96%以上的細菌種類有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）擬合度99%，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）擬合度99%，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）擬合度97%，短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）擬合度96%。利用Mega.5.2軟件進行分析，基于Neibour-Joining法構建進化樹（對于序列中的空缺部分，采用完全刪除的方法處理）。結果（圖3）顯示，細菌WTD株與解淀粉芽孢桿菌的親緣關系較近。

圖3 基于16S rRNA基因的進化分析

2.2.4 細菌種的確定 由16S rDNA的分析、形態(tài)及生理生化反應實驗結果，可以得出WTD屬于芽孢桿菌屬，可能屬于枯草芽孢桿菌或者是解淀粉酶芽孢桿菌，但是根據(jù)伯杰氏手冊第8版，枯草芽孢桿菌不產生卵磷脂酶，所以WTD屬于解淀粉酶芽孢桿菌。

2.3 拮抗菌抑菌作用條件分析

2.3.1 pH對細菌拮抗效果的影響 不同pH條件下WTD對敏感菌株W-1的拮抗作用（圖4）顯示，在pH值為7時菌株的抑菌作用最大，并隨著pH值得升高或降低，抑菌作用減小。

圖4 不同pH條件下菌株WTD拮抗效果

2.3.2 鹽度對細菌拮抗效果的影響 不同鹽度下WTD對敏感菌株W-1拮抗作用（圖5）顯示，在鹽度為1%NaCl的時候拮抗效果最好，隨著鹽度減小或者增大，拮抗效果均減弱。

圖5 不同鹽度條件下菌株WTD的拮抗效果

2.3.3 溫度對細菌拮抗效果的影響 不同溫度下WTD對敏感菌株W-1拮抗作用（圖6）顯示，在溫度為35℃的時候拮抗效果最好，隨著溫度的上升和下降，拮抗效果均下降。而在溫度為15℃和20℃的時候，鰻弧菌W-1和菌株WTD均生長良好，沒有拮抗效果。

圖6 不同溫度下菌株WTD的拮抗效果

2.4 拮抗菌的藥敏實驗

拮抗菌WTD的藥敏實驗結果（表3）顯示，菌株WTD對麥迪霉素、氟哌酸、奧復星、丙氟哌酸、萬古霉素、復方新諾明、痢特靈、氯霉素、氯潔霉素、菌必治、先鋒必素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、復達欣、強力霉素、美滿霉素、紅霉素、青霉素、苯唑青霉素、氨芐青霉素、氧哌嗪青霉素、羧芐青霉素、先鋒霉素、先鋒霉素V、先鋒霉素VI、頭孢膚肟和四環(huán)素敏感，而對多黏菌素具有抗性。

3 討論

分離的所有拮抗菌中，菌株1-B2、1-B1、2-A1、5-C1、5-C2和5-C3是采自青島石老人養(yǎng)殖場的海水樣本，菌株SMD、SMB2-2和SN1D采自石島樣本，菌株XM5-2、XM8-1和XM9-2來自廈門海水樣，菌株QX、QE、QF和QQ取自青島棧橋泥樣，菌株CB取自青島近海水樣，菌株WTE、WTD取自青島第二海水浴場的水樣。從細菌采集的地點及分離得到的拮抗菌數(shù)目來看，可以得出在海水養(yǎng)殖場中拮抗菌的數(shù)目最多，這可能與養(yǎng)殖場病原細菌數(shù)目較多有關。其中SN1D 鑒定為芽孢桿菌屬，WTD、XM9-2和5-C3均被鑒定為解淀粉酶芽孢桿菌，但是從及生理生化反應上三者均存在著差異，可能是菌株本身存在差異。

對解淀粉芽孢桿菌的報道多見于對真菌的抑制，王英國等［14］從堆肥中分離到一株解淀粉酶芽孢桿菌，可以產生抗菌多肽類物質抑制尖孢鐮刀菌、草莓蛇病菌、毛霉和黑曲霉等多種真菌。郝建安等［15］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌的抗真菌物質是一種蛋白質分子，抑真菌作用是在孢子萌發(fā)階段使真菌新生菌絲畸形。王德培等［16］從青貯玉米秸稈飼料中分離得到一株解淀粉芽孢桿菌BI2，該菌主要抑制絲狀真菌，對細菌無抑制作用，其培養(yǎng)36 h的上清液能明顯抑制黃曲霉孢子萌發(fā)及菌絲生長。段春華等［17］從核桃林地土壤中分離得到一株拮抗解淀粉芽孢桿菌SDF-005，該菌對5種植物炭疽病菌絲生長均具有較強的抑制作用，其代謝產物可以破壞病原菌菌絲壁結構，引起菌絲膨大、畸變、扭曲、菌絲壁消解。馮金龍等［18］對解淀粉芽孢桿菌S27的生物學功能進行了研究，結果表明該菌對馬鈴薯枯萎病菌（Fusarium tricinctum）、馬鈴薯絲核病菌（Rhizoctonia solani）和馬鈴薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）都有良好的抑制作用，可致菌絲膨大，斷裂及溶解等。經實驗檢測本研究分離的解淀粉芽孢桿菌WTD菌株對青霉和曲霉的生長無抑制作用，需要進一步的實驗確定其對病原真菌有無抑制作用。

表3 拮抗菌WTD的藥敏試驗結果

利用拮抗微生物抑制水體中病原微生物的生長，使病原菌的濃度低于其致病濃度，進行水產養(yǎng)殖病害的防治，是國內外水產養(yǎng)殖病害控制的熱點［19-22］。曹海鵬等［19］從養(yǎng)殖池污泥中分離篩選了一株解淀粉芽孢桿菌G1，該菌表現(xiàn)出了對鱘源病原性嗜水氣單胞菌的良好拮抗作用，其最適生長pH為7，最適生長溫度為30℃，與本研究報道菌株WTD生長條件相近。本實驗采用平板點種法從分離菌株中篩選對病原菌鰻弧菌W-1的拮抗菌，即將待測菌株直接點種到涂有病原菌的平板上，此方法不僅可以直接觀察到拮抗菌通過分泌拮抗物質產生的抑菌區(qū)，還可通過抑菌圈的大小，定量比較拮抗菌抑菌活性的強弱［21］。在以不同pH、鹽度、溫度比較拮抗菌抑菌活性的強弱時，應當同時考慮不同培養(yǎng)條件對病原菌的生長的影響。傅松哲等［22］從海洋沉積物中分離到兩株拮抗弧菌，短小芽孢桿菌H2和地衣芽孢桿菌H4，它們對需鈉弧菌的生長都具有顯著的抑制作用，對凡納濱對蝦的現(xiàn)場實驗結果表明，加入菌株短小芽孢桿菌H2可顯著提高凡納濱對蝦的存活時間。需要對本研究分離的解淀粉芽孢桿菌菌株WTD進行模擬養(yǎng)殖實驗證明該菌的生物安全性。

解淀粉芽孢桿菌可產生抑菌蛋白類、脂肽類抗生素、大環(huán)內酯類、寡肽酶、肽類和聚酮化合物等［23，24］，可抑制病原真菌和細菌的生長，另外，解淀粉芽孢桿菌是一種對人畜相對安全的細菌，使其有望作為益生菌在畜牧水產養(yǎng)殖中得到應用。本研究分離的解淀粉芽孢桿菌菌株WTD對鱸魚病原菌鰻弧菌W-1具有較強的抑制作用，實驗中發(fā)現(xiàn)其冷凍干燥的上清液對鰻弧菌W-1具有明顯的拮抗效果，拮抗物質在50℃、80℃和100℃處理后依然表現(xiàn)出拮抗效果，說明該物質對熱具有穩(wěn)定性，同時用蛋白酶K處理后也依舊表現(xiàn)出抑菌活性。說明該抑菌物質不是蛋白質類物質，需要對菌株拮抗鰻弧菌物質進行進一步的研究才能確定其性質。必須對分離菌株WTD的拮抗機理、菌種拮抗條件及菌種安全性實驗等進一步的研究才有望進入應用階段。

4 結論

本研究從青島、廈門和石島的海洋環(huán)境中分離了126株細菌，從中篩選出19株對鱸魚病原菌鰻弧菌W-1具有拮抗作用的細菌，其中抑菌作用較強的菌株WTD鑒定為解淀粉芽孢桿菌。該菌的最佳抑菌作用條件為溫度35℃，pH值為7，鹽度為1%NaCl。藥敏實驗結果表明，該菌對麥迪霉素等29種抗生素敏感，而對多黏菌素具有抗性。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation and Identification of Bacillus amyloliquefaciens WTD and the Optimal Conditions of Its Antim icrobial Activity

Zhang Chao Wang Xianghong Xu Tao Li Shuai Qian Hao Li Shuai Zhang Zenghu
（College of Marine Life，Ocean University of China，Qingdao266003）

This work is to isolate and screen the antagonistic bacteria from sea environment which can inhibit the growth of the seaperch’s pathogenic bacterium Vibrio anguillarum W-1， and investigate the optimal conditions of its antimicrobial activity as well as the drug sensitivity. The methods of plate crossing streaking and point-inoculating were used to screen the antagonistic bacteria. The morphology，physiological and biochemical reactions and 16S rDNA phylogenetic analysis were applied for the identification of antagonistic bacteria. The onevariable method was utilized to optimize the antimicrobial conditions of the antagonistic bacteria. Total 126 strains of bacteria were isolated from the coast of Qingdao， Xiamen and Shidao， and 19 antagonistic bacteria were screened. The bacterial strain WTD with the optimal antagonistic activity was identified as Bacillus amyloliquefaciens. Under the optimal conditions of 35℃， salinity 1% NaCl， and pH 7， the antagonistic effect was the best. The drug sensitivity test revealed that the bacterium was sensitive to 29 antibiotics such as midecamycin， but resistant to polymyxin. As a conclusion， the antagonistic strain B. amyloliquefaciens WTD can efficiently inhibit the growth of the seaperch’s pathogenic bacterium V. anguillarum， and has the potential application value in the aquaculture.

Bacillus amyloliquefaciens；Vibrio anguillarum；antimicrobial activity；antagonistic bacteria

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.024

2014-12-25

張超，男，博士研究生，研究方向：海洋有益菌及病毒學；E-mail：zhangchao@ips.ac.cn

王祥紅，男，博士，研究方向：海洋微生物學；E-mail：xhwang@ouc.edu.cn