羅斌 盧建遠(yuǎn) 馬力 胡亮 劉霜 楊珂?zhèn)?字向東

（西南民族大學(xué)　國(guó)家民委動(dòng)物科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都　610041）

山羊Apaf-1和Apaf-2基因的cDNA克隆、序列分析及組織表達(dá)

羅斌 盧建遠(yuǎn) 馬力 胡亮 劉霜 楊珂?zhèn)?字向東

（西南民族大學(xué)國(guó)家民委動(dòng)物科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610041）

采集5只多胎金堂黑山羊和5只單胎藏山羊在發(fā)情期的卵巢、垂體等組織樣，進(jìn)行Apaf-1和Apaf-2基因的cDNA克隆、序列分析，以及定量PCR技術(shù)對(duì)其mRNA進(jìn)行組織表達(dá)量研究。結(jié)果表明，克隆出Apaf-1基因長(zhǎng)度為3 750 bp，編碼1 249個(gè)氨基酸，Apaf-2基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為318 bp，編碼105個(gè)氨基酸。這兩個(gè)基因在兩種山羊中序列相同，沒(méi)有突變，且在5種組織中的表達(dá)均無(wú)差異。表明凋亡基因Apaf-1和Apaf-2在動(dòng)物的進(jìn)化中比較保守，與山羊多羔性狀的相關(guān)性需要進(jìn)一步研究。

山羊；Apaf-1基因；Apaf-2基因；定量PCR

山羊產(chǎn)羔率是一個(gè)低遺傳力的數(shù)量性狀，其遺傳力只有0.1左右［1］，所以用常規(guī)育種技術(shù)難以改良產(chǎn)羔數(shù)性狀，而產(chǎn)羔率主要取決于每個(gè)發(fā)情周期中母羊的排卵數(shù)。山羊在出生前，卵巢上便形成了大量原始卵泡。初情期前，卵泡雖能發(fā)育，但不能成熟排卵，當(dāng)發(fā)育到一定程度時(shí)，便閉鎖（atresia）退化［2］。初情期后，在每個(gè)發(fā)情周期中可發(fā)育的卵泡多達(dá)幾十個(gè)，但單胎品種最終能發(fā)育到成熟排卵的卵泡一般只有1-2個(gè)，其余卵泡中途閉鎖死亡，而多胎品種則有多個(gè)卵泡能發(fā)育到成熟排卵［3］。藏山羊發(fā)育較慢，性成熟較晚，一年1胎［4，5］，金堂黑山羊一年2-3胎［6］，在分子水平上對(duì)這兩種山羊繁殖性能進(jìn)行比較研究具有重要意義。

Apaf-1（Apoptotic protease activating factor-1）即凋亡蛋白酶活化因子-1和Apaf-2是體內(nèi)重要的凋亡激活劑。細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD）的一種表現(xiàn)形態(tài)。1996年在細(xì)胞凋亡研究中，首次揭示出兩個(gè)與凋亡密切相關(guān)的蛋白Apaf-1和Apaf-2。而Apaf-1的cDNA是Zou等［7］在1997年克隆出來(lái)的，并證實(shí)是線蟲(chóng)CED-4的人類同源物，它在哺乳動(dòng)物線粒體依賴性凋亡通路和胚胎發(fā)育中至關(guān)重要，電子顯微鏡確認(rèn)的Apaf-1分散于細(xì)胞質(zhì)中，而不是在線粒體或其他的細(xì)胞器［8］。Apaf-1在細(xì)胞凋亡中處于核心地位，其功能涉及有細(xì)胞增殖、分化和凋亡等各個(gè)方面［9，10］。人體內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)均以Apaf-1為靶而調(diào)節(jié)凋亡體。Apaf-2是細(xì)胞色素C（CytC），是一個(gè)線粒體起源的細(xì)胞凋亡信號(hào)，進(jìn)行線粒體CytC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［11］，參與Apaf-1和Casp-9等因子結(jié)合構(gòu)成凋亡體。正常狀態(tài)下CytC不能通過(guò)外膜，而在NO、過(guò)氧化物酶等因子的誘導(dǎo)下線粒體發(fā)生聚集，CytC便釋放到胞質(zhì)中［12］。排卵前卵泡發(fā)育過(guò)程中涉及一系列的細(xì)胞增殖和凋亡事件，目前對(duì)卵泡細(xì)胞增殖機(jī)制的研究比較深入。有研究結(jié)果顯示不同綿羊、山羊品種FSH和LH的血清濃度及其受體在卵巢中的表達(dá)量與其排卵率之間無(wú)顯著相關(guān)性［13，14］，而對(duì)卵泡發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究則未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)單胎山羊和多胎山羊Apaf-1和Apaf-2基因進(jìn)行序列分析和組織表達(dá)分析，以期為研究山羊多胎機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 本實(shí)驗(yàn)選取健康藏山羊、金堂黑山羊各5只，金堂黑山羊選自四川金堂，連續(xù)3胎產(chǎn)3羔山羊品種；藏山羊選自四川省理縣，連續(xù)3胎單羔的單胎山羊品種。由于藏山羊一般在秋季發(fā)情，且較晚，所以本實(shí)驗(yàn)在10月份對(duì)選取的10只羊同期發(fā)情處理：將孕酮陰道栓（CIDR）放入山羊陰道內(nèi)，11 d后取出，取出前一天肌肉注射氯前列醇納2 mL，在取出CIDR后40 h左右進(jìn)行屠宰山羊，屠宰后采取垂體、子宮、卵巢、輸卵管和肝臟組織樣于已經(jīng)標(biāo)記的凍存管中，迅速投入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要酶及試劑 孕酮陰道栓（CIDR）產(chǎn)自新西蘭，前列腺素產(chǎn)自加拿大；2×Taq PCR MasterMix、動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、DNA Marker DL2000均購(gòu)自上海天根生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas（MBI）公司；X-Gal、IPTG、氨芐青霉素、克隆載體pMD19-T Vector 購(gòu)自大連寶TaKaRa生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自康迪生物技術(shù)有限公司，八連管、蓋子及SsoAdvancedTMSYBRòGreenSupermix購(gòu)自百樂(lè)公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 同一時(shí)間將10只羊（金堂黑山羊和藏山羊各5只）的5種組織：子宮、卵巢、輸卵管、垂體和肝，采用Trizol法提取RNA［15］；cDNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Thermo Scientific RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit進(jìn)行合成。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 目前羊中暫無(wú)Apafs基因序列的公布，所以參照牛的Apafs基因，根據(jù)GenBank中已公布的牛Apaf-1和Apaf-2（CYCS）基因序列（登錄號(hào)NM001191507和NM001046061），利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5設(shè)計(jì)克隆引物和熒光定量引物，定量引物參照牛的基因和克隆出的山羊的全基因序列跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。其中，Apaf-1采用分段克隆的策略設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，設(shè)計(jì)3對(duì)引物分段擴(kuò)增cDNA片段，引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2.3 山羊Apafs基因的PCR擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL：上下游引物（20 pmol/L）cDNA模板各1 μL，2×Taq PCR Master Mi×12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，退火溫度Apaf-1三個(gè)片段分別是50.6℃、54.4℃和54.4℃，Apaf-2是58℃ 40 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳后，按照愛(ài)思進(jìn)生物工程有限公司膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。

1.2.4 克隆測(cè)序及生物信息學(xué)分析 將膠回收產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T Vector于16℃連接12 h。將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素（Amp）的LB固體平板上，于37℃恒溫箱培養(yǎng)12 h。挑選白色單克隆菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)16 h，并進(jìn)行菌液PCR鑒定，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，挑選陽(yáng)性克隆菌液金堂和藏山羊的各2 mL送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 克隆及定量引物序列

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 將提取的山羊5個(gè)組織的總mRNA，運(yùn)用Real-time PCR方法檢測(cè)不同組織mRNA以及內(nèi)參β-actin基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系為10 μL：上下游引物各0.8 μL、模板dDNA 0.5 μL、SYBR Green Supermix 5 μL、ddH2O 2.9 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，61.2℃退火20 s，65℃延伸5 s，40個(gè)循環(huán)；65℃延伸5 min；4℃保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS17.0及Excel2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Pfaffi［16］法分析Apaf-1、Apaf-2基因在兩種山羊不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為：

其中，E1表示目的基因的擴(kuò)增效率；E2表示內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率；Ct1表示對(duì)照樣本中目的基因的CT值與實(shí)驗(yàn)樣本中目的基因CT值之差，Ct2表示對(duì)照樣本中內(nèi)參基因的CT值與實(shí)驗(yàn)樣本中內(nèi)參基因的CT值之差。

2 結(jié)果

2.1 Apafs基因膠回收結(jié)果

吸取5 μL Apafs基因膠回收產(chǎn)物與1 μL loading buffer混勻，對(duì)其進(jìn)行電泳檢測(cè)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶。結(jié)果（圖1）顯示，第1、2泳道與預(yù)期大小1 942 bp基本一致，第3、4泳道與預(yù)期大小1 369 bp基本一致，第5、6泳道與預(yù)期大小774 bp基本一致；第7、8泳道為金堂黑山羊和藏山羊Apaf-2基因目的條帶，與預(yù)期大小639 bp基本一致，且目的條帶較明亮，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

圖1 Apaf-1和Apaf-2基因PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

2.2 Apafs基因的核苷酸序列分析

測(cè)序結(jié)果顯示，兩種山羊的基因序列無(wú)堿基變化。將獲得的基因序列提交NCBI，Apaf-1基因全長(zhǎng)CDS為3 750 bp，登錄號(hào)KP245916；Apaf-2基因CDS全長(zhǎng)是318 bp，登錄號(hào)KMB823520。通過(guò)DNAman分析金堂黑山羊和藏山羊與其他物種Apaf-1和Apaf-2基因CDS區(qū)的核苷酸序列同源性，Lasergene建立同源圖，結(jié)果（圖2和圖3）顯示，Apaf-1基因CDS區(qū)的核苷酸序列與綿羊（XM_004006637）、牛（NM_001191507.1）、野豬（XM_003481742）、馬（XM_005606535）、家貓（XM_003989131）、人（AF-149794.1）、獼猴（XM_001086717.2）和褐家鼠（AF218388）的同源性分別為99.4%、97.3%、92.3%、91.5%、91.5%、86.9%、86.7%和84.2%；Apaf-2基因CDS區(qū)的核苷酸序列與綿羊（XM_004013157.1）、藏羚羊（NM_005976593.1）、牛（NM_001046061.2）、野 豬（NM_001129970.1）、 虎 鯨（XR_183516.1）、家馬（HQ889872.1）、狼（NM_001197045.1）和黃家鼠（XM_005340301.1）、小家鼠（NM_007868.4）、人類（NM_018947.5）的同源性分別為99.7%、 99.4%、98.4%、94%、93.1%、92.1%、91.2%、91.2%、90.3%和89.3%。

圖2 山羊Apaf-1基因的同源性分析

圖3 山羊Apaf-2基因的同源性分析

用MEGA6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Apaf-1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果（圖4）表明，山羊和綿羊親緣關(guān)系最近，山羊先與綿羊聚為一類，再與牛聚為一類，與野豬聚為一類，然后與馬聚成一大類后，最后與人、猴、鼠為一類；Apaf-2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果（圖5）表明，山羊和綿羊親緣關(guān)系最近，山羊先與綿羊聚為一類，與牛聚為一類，然后與虎鯨、家馬、狼聚為一類，最后與人、黃家鼠和小鼠為一類，這與哺乳動(dòng)物的進(jìn)化程度一致。

圖4 藏山羊和金堂黑山羊Apaf-1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖5 藏山羊和金堂黑山羊Apaf-2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 氨基酸序列分析

克隆獲得的山羊Apaf-1基因CDS全長(zhǎng)3 747 bp，用ExPASy在線對(duì)其蛋白質(zhì)組成進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼1 249個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為142.0 kD，等電點(diǎn)（p I）為5.94，其氨基酸組成中亮氨酸的含量最高，占11.2%，分子式為C6302H9874N1716O1885S67；該基因編碼的蛋白質(zhì)為中性蛋白，既有親水性也有疏水性，存在于細(xì)胞質(zhì)中。Apaf-2基因CDS全長(zhǎng)315 bp，編碼105個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為14.5 kD，p I5.31，丙氨酸含量最高為32.7%；在第15、第80和第97位氨基酸附近，該蛋白質(zhì)為疏水，其余部分為親水，共價(jià)結(jié)合于線粒體內(nèi)膜。

2.4 Apafs基因定量結(jié)果的分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time PCR）的方法，以β-actin為參照，對(duì)Apaf-1和Apaf-2基因在藏山羊和金堂黑山羊5個(gè)組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（圖6，圖7）表明，Apaf-1和Apaf-2的mRNA在山羊輸卵管、卵巢、子宮、垂體、肝中都有表達(dá)；金堂黑山羊的Apaf-1在卵巢和輸卵管中表達(dá)量較高，藏山羊的Apaf-2基因在肝臟和子宮中表達(dá)量較高，總體上Apaf-1相對(duì)表達(dá)量低于Apaf-2，但兩個(gè)品種間差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 Apaf-1基因在藏山羊和金堂黑山羊不同組織中的相對(duì)表達(dá)量（x-±s）

圖7 Apaf-2基因在藏山羊和金堂黑山羊不同組織中的相對(duì)表達(dá)量（x-±s）

3 討論

細(xì)胞凋亡（PCD）［17］對(duì)于多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持，抵御外界各種因素的干擾等起著重要的作用。近年來(lái)，對(duì)細(xì)胞凋亡的研究已從聚焦細(xì)胞核的改變，轉(zhuǎn)向?qū)τ诰€粒體呼吸鏈變化的研究。在細(xì)胞凋亡的研究［18］中揭示出3個(gè)與凋亡密切相關(guān)的蛋白細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程，包括Apaf-1、細(xì)胞色素c（Cytc/Apaf-2）和Casp-9（Apaf-3）3個(gè)成員，參與激活caspase，通過(guò)與Bcl-2家族等蛋白因子的相互作用來(lái)調(diào)控PCD進(jìn)程。Apaf-1與凋亡抑制基因是獨(dú)立的，如Bcl-2通過(guò)胱天蛋白酶非依賴性機(jī)制保護(hù)線粒體功能，從而保護(hù)細(xì)胞，但不依賴于Apaf-1［19］。而Apaf-2（細(xì)胞色素C，cytochrome C，Cytc）是呼吸鏈中的一個(gè)基本成分，在氧化還原和能量代謝中起著重要的作用，同時(shí)細(xì)胞色素C是線粒體啟動(dòng)凋亡程序的關(guān)鍵物質(zhì)［20］。Gabriel等［21］給細(xì)胞注射外源性Cytc后發(fā)現(xiàn)線粒體調(diào)節(jié)的凋亡通路可不依賴Apaf-1/Casp-9，而由線粒體膜釋放凋亡誘導(dǎo)因子AIF介導(dǎo)完成。本實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)分析證實(shí)了Apaf-1蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中，與Kirsten等［22］的研究結(jié)果一致，人的Apaf-1基因位于染色體12q23，Apaf-2蛋白為水溶性蛋白，位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)。

與凋亡相關(guān)的基因很多，但在哺乳動(dòng)物上很少通過(guò)凋亡因子來(lái)研究對(duì)繁殖的影響。本實(shí)驗(yàn)在兩種山羊不同組織中對(duì)凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1和Apaf-2基因進(jìn)行克隆、定量表達(dá)在多胎和單胎上進(jìn)行對(duì)比，兩個(gè)基因核苷酸序列無(wú)差異，表達(dá)也沒(méi)有差異，與綿羊同源性達(dá)99.7%和99.4%。藏山羊和金堂黑山羊Apaf-1和Apaf-2基因編碼區(qū)序列與牛、人、小鼠、褐家鼠均有較高的同源性，說(shuō)明Apaf-1和Apaf-2基因在哺乳動(dòng)物中均具有較高的保守性。根據(jù)Apaf-1和Apaf-2基因編碼區(qū)核苷酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和同源圖，山羊和綿羊親緣關(guān)系最近，其次為藏羚羊、牛，各個(gè)分支置信度高，表明系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果可靠。Apaf-1和Apaf-2的mRNA在研究的兩個(gè)山羊品種的卵巢、子宮、輸卵管、肝臟和垂體都有表達(dá)，但品種間無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明這兩個(gè)基因不是影響單胎和多胎的主要基因。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)首次克隆了山羊Apaf-1基因和Apaf-2基因，高繁金堂黑山羊與低繁藏山羊的這兩種基因CDS編碼區(qū)序列無(wú)核苷酸差異，山羊和其他物種有著很高的同源性，這兩種基因在生物進(jìn)化上高度保守。Apaf-1基因包含一個(gè)3 750 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼1 249個(gè)氨基酸；Apaf-2基因CDS為318 bp編碼105個(gè)氨基酸。兩個(gè)基因在兩種山羊的表達(dá)無(wú)顯著差異。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

cDNA Cloning，Sequence Analysis and Tissue Expression of Apaf-1 and Apaf-2 Gene of Goats

Luo Bin Lu Jianyuan Ma Li Hu Liang Liu Shuang Yang Kewei Zi Xiangdong
（The Key Laboratory of Animal Science of State Ethnic，Affairs Commission，Southwest University for Nationalities，Chengdu610041）

We collected the pituitary， ovary and other tissue samples of 5 Tibetan goats and 5 Jintang black goats at estrus stage， cloned cDNA of Apaf-1 and Apaf-2， analyzed their sequences， and investigated their mRNA expression of tissues by qPCR. The results showed that：the coding region sequence（CDS）of goat Apaf-1 gene was 3 750 bp long encoding 1 249 amino acids， and the CDS of Apaf-2 gene was 318 bp encoding 105 amino acids. The two genes showed the same sequences in both of goats， no mutation and no differential expression in 5 tissues. Our data suggested that gene Apaf-1 and Apaf-2 in animal’s evolution were conservative， and the correlation with the trait of goat’s prolificacy needs further studies.

goat；Apaf-1 gene；Apaf-2 gene；qPCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.017

2014-12-21

西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目（CX2014SZ71）

羅斌，男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖；E-mail：romben@sina.com

字向東，碩士，教授，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖；E-mail：zixd@sina.com