宋燕子 賈彬 林柏成 胡章立 黃瑛

（深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　深圳市海洋藻類開發(fā)與應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室　深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳　518060）

萊茵衣藻?；o酶A合成酶cDNA克隆及其酵母表達(dá)

宋燕子 賈彬 林柏成 胡章立 黃瑛

（深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室深圳市海洋藻類開發(fā)與應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳518060）

旨在預(yù)測并克隆萊茵衣藻?；o酶A合成酶cDNA（cracs），分析其在酵母中的功能。RT-PCR克隆cracs序列，ClustalW和MEGA6.0軟件分別分析其編碼蛋白保守序列和進(jìn)化樹，表達(dá)并分析其在酵母YB525中的底物偏好性。結(jié)果表明，首次在萊茵衣藻中克隆獲得一個(gè)cracs，測序表明其序列大小為2 004 bp，編碼667個(gè)氨基酸，編碼蛋白crACS的預(yù)測分子量為72.3 kD，包含?；o酶A合成酶的兩個(gè)保守區(qū)：AMP-binding區(qū)和FACS區(qū)。進(jìn)化樹比對顯示，crACS與擬南芥的長鏈?；o酶A合成酶LACSs具有較高的同源性。酵母表達(dá)顯示cracs編碼蛋白能互補(bǔ)酵母YB525 LACS的缺陷表型，活化并優(yōu)先利用C16∶1和C14∶0。萊茵衣藻cracs編碼蛋白可活化外源脂肪酸，屬于酰基輔酶A合成酶家族。

萊茵衣藻；酰基輔酶A合成酶；酵母YB525；進(jìn)化樹；脂肪酸

酰基輔酶A合成酶（acyl-CoA synthetase，ACS）也稱為脂肪酸：CoA連接酶，一般情況下，ACS根據(jù)其脂肪酸底物的碳鏈長度而被分為短鏈ACS、中鏈ACS、長鏈ACS三類［1，2］。ACS廣泛存在于真核和原核生物中，多含兩個(gè)高度保守區(qū)域：AMP-binding domain和fatty acid acyl-coA synthetase（FACS）區(qū)。其中FACS區(qū)作為脂肪酸綁定位點(diǎn)，特異存在于中長鏈ACS中，對酶催化活性有重要影響［3，4］。ACS能將細(xì)胞內(nèi)脂肪酸活化成與之對應(yīng)的輔酶A硫酯底物，該底物能參與胞內(nèi)脂肪酸碳鏈延長、三脂酰甘油合成、蛋白脂?；?、脂肪酸氧化降解等過程［5］。

萊茵衣藻作為微藻研究的模式生物，已被廣泛地應(yīng)用于微藻油脂合成研究［6-8］，但其?；o酶A合成酶crACS卻鮮有報(bào)道，在油脂合成與代謝中的功能尚不明確。本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測一條萊茵衣藻?；o酶A合成酶基因，對其cDNA進(jìn)行克隆，并通過酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)初步研究其生物學(xué)功能，以期為萊茵衣藻油脂合成與分解代謝研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻株和菌株 萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii CC849）由本實(shí)驗(yàn)室藻種庫提供。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae YB525）由中國海洋大學(xué)潘克厚教授慷慨提供［9］。

1.1.2 酶及試劑 RNA提取試劑盒TaKaRa RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、酵母基因組提取試劑盒均購于TaKaRa生物工程（大連）有限公司。引物由上海生物工程有限公司合成。脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品購于上海安普生物科學(xué)儀器有限公司。尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基購于北京泛基諾科技有限公司。其他均為常規(guī)分子和化學(xué)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 萊茵衣藻生長培養(yǎng)基為TAP，培養(yǎng)溫度23℃，100 μE/m2/s，持續(xù)光照12 h/d；YB525生長培養(yǎng)基為YPD，篩選培養(yǎng)基為尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基添加2%（W/V）葡萄糖，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基添加2%半乳糖，功能分析培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加不同碳鏈長度的脂肪酸（分別為C12∶0、C14∶0、C16∶0、C16∶1和C18∶0，濃度100 μmol/L），培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速220 r/min。

1.2.2 總RNA的提取 取對數(shù)末期CC849藻液2 mL，去上清后用TaKaRa RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。經(jīng)Nanodrop ND2000和瓊脂糖凝膠電泳分析，質(zhì)量合格的RNA置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA克隆及序列分析 取1 μg CC849總RNA，用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成cDNA第1條鏈。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中同源物種?；o酶A合成酶序列XM_001702895，設(shè)計(jì)引物crACSF和crACSR（表1），使用GC buffer I、LA-Taq酶擴(kuò)增萊茵衣藻酰基輔酶A合成酶cDNA cracs。PCR條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后連接到pEASY-T1 simple載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆測序，測序正確的質(zhì)粒命名為cracs-T。

MEGA6.0分析基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Bootstrap方法重復(fù)1 000次分析，Neighbor-Joining算法構(gòu)建進(jìn)化樹。DNAMAN軟件分析cracs編碼蛋白的屬性。ClustalW分析保守序列。

表1 引物序列

1.2.4 YB525表達(dá)載體構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶Kpn I和 Xho I分別雙酶切質(zhì)粒pYES2和cracs-T，酶切產(chǎn)物pYES2和cracs回收后進(jìn)行酶連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過PCR、雙酶切和測序驗(yàn)證正確的重組載體被命名為pYES2-cracs。

1.2.5 YB525轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定 將重組載體pYES2-cracs和pYES2以電轉(zhuǎn)化的方法［10］轉(zhuǎn)入YB525，30℃培養(yǎng)一周，用篩選培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)選取轉(zhuǎn)化子并培養(yǎng)后提取基因組DNA，以表1引物VF/VR對其進(jìn)行PCR鑒定和測序分析。pYES2和pYES2-cracs的酵母陽性轉(zhuǎn)化子分別命名為YPES2和YPACS。

1.2.6 crACS在YB525中的表達(dá)與功能驗(yàn)證 篩選培養(yǎng)基30℃，220 r/min培養(yǎng)YPES2和YPACS至對數(shù)中后期，收集100 mL菌體，2 mol/L山梨醇洗兩次，誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h。取100 μL培養(yǎng)液接種于10 mL功能分析培養(yǎng)基，培養(yǎng)240 h后測定其OD600值。

2 結(jié)果

2.1 cDNA克隆及序列分析

克隆cDNA序列片段及將其連接到pEASY-T1 simple載體后的雙酶切結(jié)果如圖1所示，測序顯示其大小為2 004 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號為XM_001702895的序列一致。根據(jù)核苷酸序列測定結(jié)果和比較基因組學(xué)分析，推測出該基因包含16個(gè)外顯子，15個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子均以GT開始并以AG結(jié)尾，基本符合內(nèi)含子的特征。該基因外顯子與內(nèi)含子的分布，見圖2。DNAMAN分析表明，cracs編碼的蛋白質(zhì)含有667個(gè)氨基酸殘基，推測其分子量為72.3 kD，等電點(diǎn)為6.87。

圖1 萊茵衣藻cracs的RT-PCR產(chǎn)物（A）和cracs-T（B）雙酶切產(chǎn)物凝膠電泳分析

圖2 cracs基因示意圖

用Bioedit軟件比對crACS與擬南芥等9個(gè)物種的10條ACS氨基酸序列，結(jié)果（圖3）顯示crACS存在兩段高度保守的區(qū)域。保守序列分別為“YTSGTTGDPK”和“DGXXHTGDXGXXXXXGXLK-IIDRKK”，前者為AMP-binding蛋白家族成員中高度保守的AMP-綁定位點(diǎn)，該序列普遍存在于所有已報(bào)道的?；罨赋易宄蓡T中，后者恰為脂肪酸的綁定位點(diǎn)FACS區(qū)。這兩個(gè)保守區(qū)基本存在于所有物種的中長鏈ACS中。因此，初步推測crACS為萊茵衣藻?；o酶A合成酶。

圖3 萊茵衣藻crACS與其他物種的ACS比對的部分結(jié)果

2.2 進(jìn)化樹分析

基于crACS與擬南芥、三角褐指藻等9個(gè)物種的23條ACS蛋白序列繪制的進(jìn)化樹（圖4）顯示，所有的ACS都起源于同一個(gè)祖先。萊茵衣藻crACS與 擬 南 芥AtLACS1、AtLACS2、AtLACS3、AtLACS4、AtLACS5及甘藍(lán)型油菜BnLACS同屬一個(gè)進(jìn)化分支，而與擬南芥AtLACS6、AtLACS67、AtLACS68、AtLACS9聚類于不同的進(jìn)化分支。進(jìn)化樹還顯示crACS與人、褐家鼠、銅綠假單胞菌的ACS的親緣均較遠(yuǎn)。此外，兩個(gè)超長鏈ACS AAC17118.1/ NP_003636處于進(jìn)化分枝的最外圍，與crACS的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，據(jù)此推測crACS不屬于超長鏈ACS。

圖4 萊茵衣藻CC849 crACS與其他8個(gè)物種22條ACS的進(jìn)化樹

2.3 YB525轉(zhuǎn)化子的鑒定

YPES2、YPACS 基因組PCR結(jié)果（圖5）顯示，分別得到約160 bp和約2 000 bp的基因片段，測序結(jié)果表明PCR結(jié)果與cracs序列完全一致。

圖5 YB525轉(zhuǎn)化子YPES2和YPACS的鑒定

圖6 培養(yǎng)10 d YPES2和YPACS的生長狀況

2.4 萊茵衣藻crACS功能驗(yàn)證

YB525是ACS基因部分缺失的酵母，不能以脂肪酸為唯一碳源生長，轉(zhuǎn)入具有ACS功能的外源基因后可恢復(fù)生長。YPES2、YPACS在YB525中的功能驗(yàn)證結(jié)果（圖6）顯示，YPACS在含有C14∶0和C16∶1的功能分析培養(yǎng)基上生長良好，而YPES2在所有的功能分析培養(yǎng)基中基本不生長，表明cracs轉(zhuǎn)入后成功互補(bǔ)了YB525 ACS基因的缺陷。此外，YPACS在含有C12∶0、C16∶0或C18∶0的功能分析培養(yǎng)基中都不能正常生長，說明crACS具有底物偏好性。因此，萊茵衣藻crACS具有?；o酶A合成酶活性。

3 討論

ACS廣泛存在于真核和原核生物中，并在脂肪酸代謝過程中起重要作用，越來越多的研究表明，ACS與脂肪酸碳鏈延長、三脂酰甘油合成和脂肪酸β-氧化降解等途徑緊密相關(guān)［5，12］。目前一些高等植物、細(xì)菌和微藻的LACS家族基因已經(jīng)被克隆和分析［13-16］，其中油菜LACS參與油脂的合成，銅綠假單胞菌LACS可以催化長鏈脂肪酸且參與脂肪酸β-氧化反應(yīng)，假微型海鏈藻LACS與DHA、EPA的代謝關(guān)系密切。因此，克隆萊茵衣藻cracs及分析其編碼蛋白的功能，有助于了解萊茵衣藻脂肪酸和油脂代謝調(diào)控機(jī)制。

萊茵衣藻crACS進(jìn)化樹比對發(fā)現(xiàn)，crACS與擬南芥AtLACS1-5在同一個(gè)進(jìn)化分枝，而與AtLACS6 -7處于臨近分枝。擬南芥的LACS家族成員各具不同的功能，其中AtLACS1-3不僅能利用酵母的脂肪酸還具有脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶的功能［11，17］。Faldua［18］進(jìn)一步研究表明AtLACS6和AtLACS7編碼的過氧化酶體ACS蛋白參與脂肪酸β-氧化。因此，可推測crACS參與脂肪酸的合成途徑。進(jìn)化樹還顯示crACS與進(jìn)化樹中所有的長鏈ACS分布于一個(gè)大分枝，與進(jìn)化樹中兩個(gè)超長鏈ACS（AAC17118.1/ NP_003636.2）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此認(rèn)為crACS不是超長鏈?；o酶A合成酶。

微 擬 球 藻 的LACS NOLACS偏 好C14∶0、C16∶0、C18∶0等脂肪酸底物，且優(yōu)先利用長鏈脂肪酸［9］。YPES2和YPACS的生長狀況所示的研究結(jié)果與此相似，crACS偏好利用C16∶1、C14∶0等長鏈脂肪酸作為底物，這些長鏈脂肪酸是萊茵衣藻脂肪酸的主要成分，說明crACS可能活化萊茵衣藻中的長鏈脂肪酸并參與其代謝反應(yīng)。一般同一個(gè)物種中存在多個(gè)ACS，如擬南芥［11］和三角褐指藻［19］中分別分離鑒定了9個(gè)和5個(gè)ACS。目前本研究僅克隆并初步分析了萊茵衣藻的1個(gè)ACS，未來將進(jìn)一步研究crACS的功能并尋找更多的crACS同工酶，同時(shí)將通過基因調(diào)控crACS，研究其對脂肪酸合成與代謝的影響。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法首次從萊茵衣藻中預(yù)測并克隆一個(gè)?；o酶A合成酶的cDNA序列，酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該基因能互補(bǔ)缺陷型酵母YB525，具有?；o酶A合成酶的活性，能活化外源脂肪酸。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

cDNA Cloning and Yeast Expression of Acyl-CoA Synthetase of Chlamydomonas reinhardtii

Song Yanzi Jia Bin Lin Baicheng Hu Zhangli Huang Ying
（Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresource and Eco-environmental Science，Shenzhen Engineering Laboratory of Marine Algae Biotechnology，College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen518060）

This work aims to predict and clone cDNA of Chlamydomonas reinhardtii a cyl-CoA synthetase（gene cracs）， and analyze its function in yeast Saccharomyces cerevisiae YB525. The cracs sequence was cloned by RT-PCR， its conserved sequence of encoded protein and phylogenetic tree were analyzed with ClustalW and MEGA6.0， then the substrate specificity in YB525 of expressed gene was analyzed. As the results， a cracs was cloned for the first time with sequence of 2 004 bp and encoded a 72.3 kD protein crACS of 667 amino acids containing two conserved regions of including acyl-CoA synthetase：the AMP-binding domain and the FACS motif. The phylogenetic tree analysis indicated that crACS shared high homology with LACs of Arabidopsis thaliana. Yeast expression experiments showed that crACS restored acyl-CoA synthetase deficient phenotype of YB525 and assimilated foreign palmitoleic acid and myristic acid. Conclusively， cracs of C. reinhardtii can activate exogenous fatty acid and belongs to acyl-CoA synthetase family.

Chlamydomonas reinhardtii；acyl-CoA synthetase；yeast YB525；phylogenetic tree；fatty acid

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.016

2015-01-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31100582，31470431），中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2014M562199），深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JCYJ20120613112512654）

宋燕子，女，碩士研究生，研究方向：海洋生物學(xué)；E-mail：swallowsong@163.com

黃瑛，女，博士，副教授，研究方向：藻類生物能源；E-mail：huangy@szu.edu.cn