羅中欽程琳張茜陳國華

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京　100081；2.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾　041004；3.　北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京　100875）

絲狀真菌PCR模板DNA的快速制備方法

羅中欽1程琳2張茜3陳國華1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081；2.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾041004；3.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100875）

以尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為材料，旨為建立沸水浴獲得PCR模板DNA的新方法。】取少量真菌菌絲置于一定體積50 mmol/L NaOH溶液中沸水浴10 min，再加入1/10體積1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液，12 000 r/min離心后，上清用作PCR的DNA模板。結(jié)果顯示，該方法擴增效率高，擴增條帶清晰，且Taq酶適應(yīng)性強，適合快速制備絲狀真菌的模板DNA。該方法經(jīng)濟、簡單、快速、安全高效，可用于絲狀真菌轉(zhuǎn)化子的高通量篩選和菌株的快速鑒定。

絲狀真菌；尖孢鐮刀菌；PCR擴增；Taq DNA聚合酶

PCR技術(shù)，自1983 年美國人Kary Mullis發(fā)明以來，已經(jīng)成為分子生物學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域最基本、最重要的技術(shù)方法。如今，從基因擴增與基因檢測到基因克隆、基因改造、遺傳分析等都已離不開PCR技術(shù)［1，2］。另外，在病原微生物檢測、法醫(yī)鑒定、考古研究食品安全及品種鑒定等多領(lǐng)域PCR技術(shù)也發(fā)揮著重要作用［3-7］。

PCR方法的前提條件是獲得DNA或RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板。DNA的提取方法主要有十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfonate，SDS）提取法［8］和十六烷基三乙基溴化銨（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）提取法［9］，或者直接從試劑公司購買提取試劑盒。這些方法雖能得到較高質(zhì)量的DNA，但需樣品量較大，且操作步驟較繁瑣，效率低，難以滿足對大量樣品檢測的需求。另外，對于樣品檢測實驗需要的模板量少，常規(guī)DNA提取方法提取的大量DNA未被充分利用，造成了浪費。為解決以上問題，研究人員開發(fā)多種簡單、快速的獲得DNA模板的方法，如微量玻璃粉吸附、Chelex-100法、微波處理、TE緩沖液沸水煮、NaOH溶液處理等，通過處理植物葉片、真菌菌絲等樣品獲得模板DNA［10-16］。GE公司的Whatman FTA卡僅用一張卡片就可以完成室溫下DNA和RNA的采集、運輸、純化和儲存，為血樣、口腔細(xì)胞、植物DNA等樣本的保存和分析提供了簡單、可靠的方法［17，18］。但是，這些方法多為傳統(tǒng)方法的改良，程序較復(fù)雜或需要特殊的儀器、試劑或相關(guān)配套產(chǎn)品，因此成本較高。

對于絲狀真菌而言，遺傳轉(zhuǎn)化子篩選和野外樣本菌株鑒定往往需要對大量樣本進行PCR擴增，且所需的DNA模板量又很少，而絲狀真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜又無法使用普通的菌落 PCR［19，20］。因此，本研究以尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為材料，結(jié)合前人研究成果，建立一種用于絲狀真菌PCR模板DNA的快速制備方法，即利用NaOH溶液對絲狀真菌的菌絲進行簡單的沸水浴處理，再加入Tris-HCl中和即可得到適用于PCR 的 DNA 模板，該方法經(jīng)濟、簡單、快速、高效，旨在為絲狀真菌轉(zhuǎn)化子的高通量篩選和分離菌株的快速鑒定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗室保存的尖孢鐮刀菌甘藍(lán)?；虯8和其他絲狀真菌菌株18個。尖孢鐮刀菌和其他真菌菌株接種于含100 mg/L氨芐青霉素鈉和頭孢噻肟鈉的PDA平板上，28℃培養(yǎng)4 d，備用。

1.2 方法

1.2.1 菌絲處理 取 4個1.5 mL離心管，分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，Ⅰ號離心管加入無菌水50 μL，Ⅱ號離心管加入1×TE緩沖液50 μL，Ⅲ號離心管加入100 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）50 μL，Ⅳ號離心管加入50 mmol/L NaOH溶液50 μL。用無菌牙簽挑取少量菌絲到各離心管中，渦旋打散菌絲，沸水浴10 min。Ⅳ號離心管中再加入5 μL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液。12 000 r/min離心10 min。取上清至新離心管中，即為制備的模板DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 以1.2.1得到的DNA為模板，SDS提取法得到的100 ng/μL DNA（CK+）和無菌水（CK-）分別為陽性和陰性對照，引物選用2對真菌檢測的通用引物和10對尖孢鐮刀菌特異引物（表1）。Taq DNA聚合酶選自于5家公司：天根Taq DNA polymerase（ 貨 號：ET101-01-03）、TaKaRa Ex Taq（貨號：RR001A）、全式金 Easy Taq DNA polymerase（貨號AP111-01）、博邁德 Taq DNA polymerase（貨號：PC0101）和康為世紀(jì)Taq DNA polymerase（貨號：CW0680），編號為T1、T2、T3、T4和T5（編號順序與上述提到的公司順序無對應(yīng)關(guān)系）。除酶適應(yīng)性實驗中用到5種酶外，其余均使用酶T1。PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板2.0 μL（模板用量實驗中分別 用0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 μL），10×Taq buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，加ddH2O補足到20 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃ 3 min；95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30個 循 環(huán)；72℃ 8 min。PCR反應(yīng)完成后，向PCR產(chǎn)物中加入4 μL 6×loading buffer，混勻，取10 μL進行瓊脂糖電泳檢測，Marker為全式金trans2K Plus DNA Marker。

2 結(jié)果

2.1 不同方法制備的DNA模板PCR擴增效率比較

用4種方法制備的模板DNA進行PCR擴增，結(jié)果如圖1所示。用1×TE緩沖液沸水浴（方法Ⅱ）制備的模板DNA和50 mmol/L NaOH溶液沸水浴后再加1/10體積1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液（方法Ⅳ）制備的模板DNA與陽性對照（CK+）擴增結(jié)果一致，2對通用引物及5對特異引物都能得到清晰的電泳條帶，而100 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）沸水?。ǚ椒á螅┲苽涞哪０錎NA只有通用引物擴增得到了清晰的條帶，特異引物擴增只得到微弱的條帶，無菌水沸水?。ǚ椒á瘢┲苽涞哪０錎NA只有18S rDNA通用引物得到微弱條帶，其余引物均沒有條帶。所以，方法Ⅱ和Ⅳ所制備的模板DNA，用T1酶進行擴增，能得到理想的結(jié)果。

表1 PCR引物

圖1 不同方法制備的尖孢鐮刀菌DNA模板PCR擴增結(jié)果

2.2 DNA模板對Taq DNA聚合酶的適應(yīng)性

用實驗室常用的5個不同公司的Taq DNA聚合酶，以方法Ⅱ和Ⅳ所制備的DNA為模板進行PCR，結(jié)果如圖2所示。方法Ⅳ得到的模板DNA用5個公司的酶擴增都能得到清晰條帶，但條帶亮度有所不同，而以方法Ⅱ得到的模板DNA，只有用T1酶才能擴增出條帶。所以，方法Ⅱ所得到的模板DNA可以用來進行PCR檢測，但需要選擇活性較高的酶，做檢測前需要進行預(yù)備實驗，檢驗所用酶是否能用于該方法制備的模板DNA；而方法Ⅳ得到的模板DNA對酶的適應(yīng)性較好，5種酶都可用，比方法Ⅱ更具優(yōu)勢。

圖2 不同方法制備的尖孢鐮刀菌模板DNA用不同Taq DNA聚合酶的PCR擴增結(jié)果

2.3 不同模板用量對PCR結(jié)果的影響

由于使用沸水浴制備的模板DNA都是微量的，無法準(zhǔn)確測得其濃度，故而使用不同模板DNA溶液體積進行實驗。用方法Ⅳ制備的模板DNA 0.2-8.0 μL進行PCR反應(yīng)，結(jié)果（圖3）顯示，模板用量為2 μL時，條帶最清晰，模板量高于或低于2 μL條帶亮度減弱。這是由于該方法制備的模板DNA中含有其他雜質(zhì)（如NaOH、Tris-HCl等），當(dāng)加入的模板量高時會抑制Taq酶的活性，模板量低，DNA量少，條帶也較弱。因此，使用方法Ⅳ制備的模板DNA時，用量控制在1-4 μL為佳。

圖3 方法IV制備的尖孢鐮刀菌不同模板DNA用量PCR擴增結(jié)果

2.4 不同大小片段的PCR擴增

以方法Ⅳ制備的DNA為模板，重新選用5對擴增片段大小不同的引物，進行PCR擴增，結(jié)果（圖4）顯示，擴增大小從396-1978 bp均得到單一清晰條帶，片段范圍已能滿足真菌檢測的需要。

圖4 方法IV制備的尖孢鐮刀菌模板DNA不同大小DNA片段的PCR擴增結(jié)果

2.5 方法Ⅳ在其他絲狀真菌菌株鑒定中的應(yīng)用

選用本實驗室保存的絲狀真菌菌株18個，挑取菌絲用方法Ⅳ制備模板DNA，擴增其18S rDNA和 ITS片段，結(jié)果如圖5所示。18個菌株與陽性對照一樣都能得到清晰單一的條帶，說明方法Ⅳ除可以制備尖孢鐮刀菌模板DNA外，對其他絲狀真菌也可以制備適合PCR的模板。

圖5 其他絲狀真菌菌株18S rDNA及ITS擴增結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)果表明，方法Ⅳ可以制備優(yōu)質(zhì)的PCR模板DNA。實際應(yīng)用中可以根據(jù)需要減少或加大NaOH溶液體積，再用1/10體積的1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液中和即可，根據(jù)體積變化適當(dāng)增加或減少菌絲量。

用NaOH溶液直接處理粗樣品的方法在水稻、小麥和海洋浮游生物等研究中都有應(yīng)用，如汪秀峰等［16］用250 mmol/L的NaOH溶液處理水稻葉片，處理過后用HCl和Tris-HCl中和，而后取出處理過的水稻葉片作為PCR模板，但該法每次PCR得用1小塊葉片，加大了樣品的使用量，同時也給PCR增加了額外的步驟；劉鵬等［13］用100 mmol/L的NaOH溶液處理小麥幼葉，但還需經(jīng)酚氯仿抽提，異丙醇沉淀，比傳統(tǒng)方法只是省去了液氮速凍和樣品研磨，還不夠簡化；劉泳等［14］用125 mmol/L的NaOH處理海洋浮游生物，25℃處理8 h以上，然后99℃加熱10 min，再加入HCl、Tris-HCl和TritonX-100混合，再次99℃加熱10 min，此法雖簡化了步驟，但是耗時過長。以上的方法與本研究建立的方法相似，但都不夠簡化，這可能與樣品的復(fù)雜性相關(guān)，有些步驟不可或缺，否則無法達(dá)到PCR模板的要求。對于絲狀真菌，陳吉良等［12］建立了一種用10%（W/V）的無菌 Chelex-100 樹脂溶液經(jīng)沸水浴制備PCR模板DNA的方法，但樣品在處理前需要液氮適當(dāng)研磨。此法步驟簡單，但需要特殊試劑，成本相對較高；潘力等［15］也建立了一種微波處理置于 10 × TE 緩沖液中的菌絲獲得DNA的方法，但未對該方法獲得的模板DNA進行Taq DNA聚合酶適應(yīng)性的研究，而本研究發(fā)現(xiàn)TE處理（方法Ⅱ）的樣品具有Taq酶選擇性，只適用于少數(shù)Taq DNA聚合酶。

相對于上述方法，本研究建立的方法具有以下優(yōu)點：（1）直接從菌落挑取菌絲，不需要液體培養(yǎng)，不需要磨樣，減化了實驗步驟，大大減少了實驗時間，同時也減少了被污染的幾率；（2）不需使用液氮，只需普通的NaOH和Tris-HCl試劑，且用量少，儀器需要普通離心機、水浴鍋或者電磁爐即可，成本低廉；（3）實驗人員可避免接觸酚、氯仿等毒性有機試劑，安全可靠。

4 結(jié)論

本研究以尖孢鐮刀菌為材料，通過對4種方法的比較篩選，建立了一種快速制備絲狀真菌PCR模板DNA的方法。該方法制備模板DNA，無需液氮和研磨，只需少量50 mmol/L NaOH溶液及1 mol/L Tris-HCl，沸水浴10 min及離心10 min即可，可采用實驗室常用的各種Taq DNA聚合酶擴增出18S rDNA和ITS片段及400 bp-2 000 bp大小范圍的特異片段。另外，本法也適用于其他絲狀真菌，可為實驗室大量絲狀真菌的轉(zhuǎn)化子及菌株的鑒定提供經(jīng)濟、 簡單、 快速、 安全和高效的方法。。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

A Rapid M ethod of Preparing DNA Tem p late of Filamentous Fungi for PCR Am p lification

Luo Zhongqin1Cheng Lin2Zhang Xi3Chen Guohua1
（1. Institude of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081；2. College of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen041004；3. College of Life Science，Beijing Normal University，Beijing100875）

This work aims to establish a novel method of extracting DNA template of filamentous fungi for PCR amplification with boilingwater bath and Fusarium oxysporum as raw material. The procedures of this method are as the following：exposing the fungal mycelia in certain volume of 50 mmol/L NaOH solution under boiling water bath， adding 1/10 volume of 1mol/L Tris-HCl（pH8.0）buffer， centrifuging it at 12 000 r/min for 10 min， and using the supernatant as the DNA template for PCR amplification. Results demonstrated that the efficiency of PCR amplification with the DNA template prepared by the method was high， the amplified bands were clear， and adaptability to various Taq DNA polymerases was strong；This indicated that the method was suitable for the preparation of DNA template of filamentous fungi. Conclusively， this method is economic， simple， rapid， safe and high-efficient， and can be utilized for high-throughput screening of filamentous fungal transformants and rapid identification of isolated strains.

filamentous fungi；Fusarium oxysporum；PCR amplification；Taq DNA polymerase

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.010

2015-01-09

國家自然科學(xué)基金項目（31301618）

羅中欽，男，博士，研究方向：蔬菜病原微生物致病機理；E-mail：lzhqin@163.com

陳國華，女，博士，研究方向：蔬菜抗病育種；E-mail：chenguohua01@caas.cn