汪梁 劉旭平 譚文松

（華東理工大學(xué)　生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海　200237）

M ixture與響應(yīng)面法結(jié)合開發(fā)BHK-21細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)基

汪梁 劉旭平 譚文松

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

采用Mixture與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法開發(fā)BHK-21細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)室已知配方的6種培養(yǎng)基A-F的基礎(chǔ)上，通過Mixture實(shí)驗(yàn)篩選出BHK-21細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。利用響應(yīng)面法針對(duì)培養(yǎng)基中的幾種關(guān)鍵組分進(jìn)行濃度優(yōu)化，確定谷氨酰胺、酪氨酸、牛血清白蛋白和鈣離子的最優(yōu)濃度分別為3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。該無血清懸浮培養(yǎng)基能很好地支持BHK細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞最大活細(xì)胞密度可達(dá)140.21×105個(gè)/mL，比商業(yè)培養(yǎng)基提高了1.95倍。采用Mixture試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法能夠在較短的時(shí)間內(nèi)開發(fā)出適合BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)的無血清懸浮培養(yǎng)基，為采用BHK-21細(xì)胞大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)口蹄疫疫苗奠定了基礎(chǔ)。

BHK-21細(xì)胞；無血清懸浮培養(yǎng)基；Mixture實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；響應(yīng)面分析

口蹄疫是一種無國(guó)界傳播的全球性傳染病，可引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，故常被稱為“政治經(jīng)濟(jì)病”。其一旦暴發(fā)，能迅速演變?yōu)樯餅?zāi)害。大批的動(dòng)物被撲殺銷毀，引發(fā)更為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，容易造成社會(huì)的恐慌。對(duì)易感動(dòng)物進(jìn)行針對(duì)性的疫苗接種是控制口蹄疫傳播最有效的措施［1］。

近年來，隨著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)逐漸應(yīng)用于獸用疫苗的生產(chǎn)，動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)成為滅活口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）疫苗生產(chǎn)的發(fā)展方向［2，3］。憑借對(duì)病毒的高敏感性，BHK細(xì)胞自1962年建株以來已成為制備FMD疫苗所需病毒抗原的理想細(xì)胞系，被廣泛應(yīng)用于FMD疫苗生產(chǎn)［4，5］。傳統(tǒng)BHK細(xì)胞大多采用轉(zhuǎn)瓶低血清貼壁的培養(yǎng)方式［6］。傳統(tǒng)的有血清培養(yǎng)基盡管能向細(xì)胞提供生長(zhǎng)繁殖所必需的激素、生長(zhǎng)因子及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但每個(gè)批次的血清之間存在批間差異，且血清價(jià)格昂貴，容易被病毒和支原體感染［7，8］。此外，血清中大量存在的成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)給疫苗成品后期的分離純化帶來很大的困難。無血清培養(yǎng)基一般是在傳統(tǒng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加生長(zhǎng)因子、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)劑、維生素、微量元素以及植物蛋白水解物等來替代血清成分［9］。開發(fā)無血清懸浮培養(yǎng)基能夠簡(jiǎn)化純化和下游加工，降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害，提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，避免了血清批次之間差異的影響。

Mixture和響應(yīng)面都是基于合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)進(jìn)而解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)［10-13］。本實(shí)驗(yàn)在現(xiàn)有6種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上先采用Mixture方法開發(fā)適用于BHK細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，并針對(duì)幾種關(guān)鍵成分應(yīng)用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化其濃度，旨為基于BHK細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞株為敘利亞倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK-21（Baby Hamster Kidney cell-21）細(xì)胞，由合作企業(yè)提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 商業(yè)培養(yǎng)基：由合作企業(yè)提供；6種基礎(chǔ)培養(yǎng)基：從實(shí)驗(yàn)室已知配方的無血清培養(yǎng)基配方庫(kù)中挑選出6種培養(yǎng)基，配制結(jié)束后經(jīng)Millipore公司0.22 μm微孔濾膜過濾，并分別命名為A、B、C、D、E和F。其中A、B、C為實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的無血清培養(yǎng)基，專利號(hào)分別為CN201010022834.4、CN201410513086.8和 CN200810039305.8。D、E和F為參考國(guó)內(nèi)外與培養(yǎng)基相關(guān)的專利文獻(xiàn)結(jié)合BHK細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況計(jì)算獲得的無血清培養(yǎng)基，具體培養(yǎng)基配方，見表1。

1.1.3 主要試劑 培養(yǎng)基配制所用的試劑中葡萄糖、氨基酸和維生素均購(gòu)自美國(guó)生命技術(shù)公司；各微量金屬鹽類物質(zhì)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；葡萄糖和氨含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所；乳酸濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 BHK細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中的培養(yǎng) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活性大于95%的BHK-21細(xì)胞移入50 mL離心管中，180×g離心5 min。棄上清，用實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基重懸后加入搖瓶（125 mL，Corning）中，工作體積30 mL，置于130 r/min的搖床，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。每24 h取樣，計(jì)數(shù)后1 000×g離心5 min。上清置于-20℃冰箱保存，用于代謝副產(chǎn)物分析。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基Mixture實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活性在95%以上的BHK-21細(xì)胞接種于125 mL搖瓶，接種方式見1.2.1，工作體積為30 mL。搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min，CO2濃度5%，溫度37℃，濕度85%。A-F分別為考察的6種培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中各培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的數(shù)字為這種培養(yǎng)基在工作體積中所占的體積百分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置35個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其中2個(gè)為對(duì)照組。其中除對(duì)照組以外的實(shí)驗(yàn)組所用培養(yǎng)基由6種培養(yǎng)基混合獲得。對(duì)照組的編號(hào)為33、34，所用培養(yǎng)基為商業(yè)培養(yǎng)基。接種后每24 h取樣計(jì)數(shù)，以最大活細(xì)胞密度和IVCC作為實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)值，考察響應(yīng)值的大小。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，見表2。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與因子最適濃度的確定 Mixture實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)前期谷氨酰胺（Gln）在48 h基本用盡，同時(shí)懸浮細(xì)胞存在結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。通過查閱文獻(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)Gln不僅是培養(yǎng)基中重要的碳源，還是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸［14-16］。同時(shí)鈣離子濃度能夠顯著影響細(xì)胞的結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，因此需要考察培養(yǎng)基中Gln和鈣離子的最優(yōu)濃度。此外，牛血清白蛋白（BSA）是血清的重要替代物，酪氨酸（Tyr）也是培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有顯著影響的組分［17-20］。為了進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基，選取Tyr、Gln、BSA和鈣離子，通過在高水平和低水平之間設(shè)置5個(gè)濃度梯度，確定4種組分的最佳配比及濃度。利用Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型分析，通過做響應(yīng)曲面圖的方式進(jìn)行考察。設(shè)計(jì)表見表3，其中各水平值1-5分別代表所配制的培養(yǎng)基中各組分對(duì)于相應(yīng)濃度的倍率。

表1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方表

實(shí)驗(yàn)編號(hào)　A　B　C　D　E　F 1　0.083　0.083　0.083　0.083　0.583　0.083 2 0 0 0 0 1 0 3　0.583　0.083　0.083　0.083　0.083　0.083 4　0.083　0.583　0.083　0.083　0.083　0.083 5　0　0　0.5　0　0.5　0 6 0 0 0 1 0 0 7 1 0 0 0 0 0 8　0.083　0.083　0.583　0.083　0.083　0.083 9 0 1 0 0 0 0 10　0.083　0.083　0.083　0.083　0.083　0.583 11　0.083　0.083　0.083　0.583　0.083　0.083 12　0　0.5　0　0　0.5　0 13 0　0　1　0　0　0 14　0　0　0　0　0.5　0.5 15　0　0　0　0.5　0.5　0 16 0　0　0　0　0　1 17 1　0　0　0　0　0 18　0.5　0　0　0　0.5　0 19　0　0.5　0　0　0　0.5 20　0　0　0　0.5　0　0.5 21　0　0　0.5　0.5　0　0 22　0.167　0.167　0.167　0.167　0.167　0.167 23 0　0　0　0　0　1 24 0　1　0　0　0　0 25 0　0　0　1　0　0 26　0.5　0　0.5　0　0　0 27　0.5　0.5　0　0　0　0 28　0　0　0.5　0　0　0.5 29　0.5　0　0　0.5　0　0 30 0　0　1　0　0　0 31　0　0.5　0　0.5　0　0 32　0　0.5　0.5　0　0　0 33　0.5　0　0　0　0　0.5

編號(hào)　Tyr　Gln　BSA　鈣離子1 2 2 4 4 2 2 2 2 2 3 4 4 4 2 4 3 3 3 3 5 3 1 3 3 6 4 4 4 4 7 2 4 4 4 8 4 4 2 4 9 3 3 3 3 10 4　2　4　2 11 3　3　1　3 12 2　4　2　2 13 1　3　3　3 14 4　2　2　4 15 3　3　3　1 16 4　2　4　4 17 2　2　4　2 18 3　3　3　3 19 5　3　3　3 20 2　4　2　4 21 3　3　3　3 22 2　2　2　4 23 2　4　4　2 24 4　2　2　2 25 3　3　3　3 26 3　3　5　3 27 3　5　3　3 28 3　3　3　3 29 4　4　2　2 30 3　3　3　5

1.2.4 優(yōu)化后培養(yǎng)基的驗(yàn)證 用優(yōu)化后關(guān)鍵組分濃度配制的無血清懸浮培養(yǎng)基在工作體積為30 mL的搖瓶中培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，考察并對(duì)比細(xì)胞在商業(yè)培養(yǎng)基和優(yōu)化后的無血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及代謝情況。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù) 由于細(xì)胞存在一定結(jié)團(tuán)的現(xiàn)象，因此計(jì)數(shù)前需先用少量胰酶消化5 min。以臺(tái)盼藍(lán)染色消化好的細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算活細(xì)胞密度和比生長(zhǎng)速率。

1.2.6 葡萄糖、氨和乳酸濃度的測(cè)定 采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量，脲酶-波氏比色法測(cè)定氨含量，氧化酶法測(cè)定乳酸濃度，均按試劑盒說明書操作。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

（2）活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間積分：IVCC=∫Xvdt（公式2）式中，IVCC（Integral of viable cell concentration over time）為活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分（108cells·d/L）。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基Mixture篩選實(shí)驗(yàn)

34種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞最大活細(xì)胞密度和IVCC兩組響應(yīng)值，見表4。根據(jù)響應(yīng)值的大小分析6種培養(yǎng)基的不同配比對(duì)響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明培養(yǎng)基C對(duì)細(xì)胞的最大活細(xì)胞密度和IVCC的影響顯著強(qiáng)于其他幾種培養(yǎng)基。利用Design-Expert軟件篩選得出BHK-21細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。

表4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基Mixture實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分析各組分對(duì)2個(gè)響應(yīng)值的影響后擬合出的線性方程為：最大活細(xì)胞密度= 23.67A +11.79B+ 38.30C+34.33D+23.04E+43.63F+14.61AB+132.47 AC-27.36AD+5.14AE+48.41AF+91.41BC+20.77BD +42.67BE+24.74BF+79.23CD+166.93CE+46.40CF +4.09DE+59.57DF+82.07EF；IVCC=114.33A+52.9 6B+154.99C+130.42D+95.06E+149.33F+66.86AB+ 238.42AC-61.05AD-4.23AE+110.29AF+243.46BC+ 164.16BD+152.41BE+121.59BF+347.55CD+624.29 CE+77.22CF+32.65DE+100.95DF +170.36EF。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用響應(yīng)面分析方法對(duì)Tyr、Gln、BSA和鈣離子進(jìn)行定量?jī)?yōu)化的結(jié)果，見表5，響應(yīng)面圖見圖1和圖2。以72 h內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)獲得的最大活細(xì)胞密度和IVCC作為考察對(duì)象，對(duì)培養(yǎng)基中Gln、Tyr、BSA和鈣離子進(jìn)行最優(yōu)化分析得出，其最優(yōu)濃度分別為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中相應(yīng)濃度的1倍、4倍、1倍、和1倍，濃度分別為3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。擬合得到多元回歸模型：最大活細(xì)胞密度=17.66Tyr +54.95Gln+20.60BSA +3.33Ca2+-1.93TyrGln-3.11Tyr-BSA+2.35TyrCa2+-2.74GlnBSA-2.29GlnCa2+-2.85 BSACa2+-3.78Tyr2-4.63Gln2+1.11BSA2+0.49（Ca2+）2-62.01；IVCC=64.72-15.30Tyr+17.06Gln+5.95BSA-2.60Ca2+-0.07TyrGln-1.86TyrBSA+2.22TyrCa2+-0.68GlnBSA-0.44GlnCa2+-1.70BSACa2++0.30Tyr2-1.66Gln2+1.30BSA2+0.0083（Ca2+）2。

2.3 BHK細(xì)胞在優(yōu)化后培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及代謝情況

將優(yōu)化后的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)BHK懸浮細(xì)胞，并和商業(yè)培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝情況進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖3所示。其中圖3-A、圖3-B兩圖為商業(yè)培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝情況，圖3-C、圖3-D兩圖為優(yōu)化后培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝情況。

生長(zhǎng)方面，接種后商業(yè)培養(yǎng)基中細(xì)胞幾乎沒有經(jīng)過延滯期即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)比生長(zhǎng)速率最大，約為0.75 d-1。隨后比生長(zhǎng)速率迅速下降，至108 h細(xì)胞比生長(zhǎng)速率下降至0 d-1，即進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。穩(wěn)定期維持時(shí)間很短，之后比生長(zhǎng)速率持續(xù)下降，即進(jìn)入細(xì)胞衰亡期。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)至96 h細(xì)胞密度達(dá)到最大值，為71.92×105cells/mL，之后細(xì)胞密度下降。以最優(yōu)化的Tyr、Gln、BSA和鈣離子濃度配制的無血清懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)BHK懸浮細(xì)胞同樣在96 h獲得最大活細(xì)胞密度140.21×105cells/mL，約為商業(yè)培養(yǎng)基的1.95倍，較商業(yè)培養(yǎng)基提高了94.95%。此外，優(yōu)化后培養(yǎng)基中細(xì)胞的穩(wěn)定期大概能夠維持72 h左右，較商業(yè)培養(yǎng)基延長(zhǎng)了48 h。因此，優(yōu)化后的培養(yǎng)基能夠改善后期細(xì)胞的維持狀況，提高細(xì)胞可獲得的最大活細(xì)胞密度。

代謝方面，商業(yè)培養(yǎng)基中BHK細(xì)胞生長(zhǎng)過程累積消耗18.88 mmol/L葡萄糖，累積產(chǎn)生乳酸19.47 mmol/L，乳酸對(duì)葡萄糖的得率約為1.03 mmol/mmol，整個(gè)培養(yǎng)過程共產(chǎn)生氨11.91 mmol/L。而優(yōu)化后培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)過程累積消耗葡萄糖41.16 mmol/L，累積產(chǎn)生乳酸25.27 mmol/L，乳酸對(duì)葡萄糖的得率約為0.61 mmol/mmol，整個(gè)培養(yǎng)過程共產(chǎn)生氨11.09 mmol/L。對(duì)比可見，優(yōu)化后的培養(yǎng)基增加了培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，且乳酸對(duì)葡萄糖的得率降為商業(yè)培養(yǎng)基的59.22%，這說明更多的葡萄糖用于細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3 討論

本研究采用了Mixture實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法開發(fā)適于BHK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。結(jié)果顯示，該組合方法能快速地利用現(xiàn)有的培養(yǎng)基開發(fā)出適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，并能夠針對(duì)關(guān)鍵組分進(jìn)行濃度優(yōu)化進(jìn)而獲得理想的培養(yǎng)基配方，是一種簡(jiǎn)便高效的培養(yǎng)基開發(fā)方法。

通過Mixture實(shí)驗(yàn)以最大活細(xì)胞密度和IVCC為考察指標(biāo)初步篩選出能夠維持BHK細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并確定6種培養(yǎng)基的混合比例分別為A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。針對(duì)Tyr、Gln、BSA和鈣離子進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析確定4種物質(zhì)的最佳添加比例和濃度，并最終確定一種適合BHK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。將優(yōu)化后的培養(yǎng)基和商業(yè)培養(yǎng)基比較發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的BHK懸浮細(xì)胞最大活細(xì)胞密度較商業(yè)培養(yǎng)基提高了94.95%，且乳酸對(duì)葡萄糖的得率降為商業(yè)培養(yǎng)基的59.22%。表明該培養(yǎng)基優(yōu)化過程已成功使BHK細(xì)胞生長(zhǎng)擺脫了對(duì)血清的依賴，為采用BHK細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)口蹄疫疫苗奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過Mixture實(shí)驗(yàn)法確定各種培養(yǎng)基的最優(yōu)混合方式，并利用響應(yīng)面法確定關(guān)鍵組分的最優(yōu)濃度，最終開發(fā)出適于BHK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。優(yōu)化后的培養(yǎng)基能改善細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，符合大規(guī)模生產(chǎn)的需要。

圖1 四種關(guān)鍵組分對(duì)BHK細(xì)胞最大活細(xì)胞密度影響的響應(yīng)面圖

圖2 四種關(guān)鍵組分對(duì)BHK細(xì)胞IVCC影響的響應(yīng)面圖

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圖3 BHK細(xì)胞在商業(yè)培養(yǎng)基和優(yōu)化后培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和代謝情況

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Optim ization of Suspended Serum-free M edium for BHK-21 Cells by Combining M ixture w ith Response Surface Analysis

Wang Liang Liu Xuping Tan Wensong
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai200237）

This study is to optimize the suspended serum-free medium for BHK-21 cells by combining Mixture experiment design with response surface analysi（sRSA）. Based on 6 media A-F of known formulation in the laboratory， the optimal combination of the medium with A：B：C：D：E：F = 0：0：11：0：9：0 was screened by the Mixture test. The contents of several key constituents in the medium were optimized by RSA， and the optimal concentrations of glutamine， tyrosine， bovine serum albumin（BSA）and calcium ion were 3 mmol/L， 2.5 g/L， 0 g/L and 0 mmol/L respectively. The serum-free medium effectively supported the suspending growth of BHK cells. The maximum viable cell density of BHK cells in cell suspension culture reached 140.21×105cells/ml， which was 1.95 times in basal medium. The suspended serum-free medium for BHK-21 cells was developed by combining Mixture experiment design with RSA， which lays a foundation for the industrial production of footand-mouth disease（FMD）vaccine while using BHK-21 cells.

BHK-21 cells；suspended serum-free medium；Mixture experiment design；response surface analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.009

2015-06-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21206040，21406066），國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA02A303），國(guó)家重大專項(xiàng)（2013ZX10004003-003-003），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（WF1214035）

汪梁，女，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)；E-mail：aaa098503013@163.com

劉旭平，E-mail：xupingliu@ecust.edu.cn；譚文松，E-mail：wstan@ecust.edu.cn