李 亞，趙四方，韓萍芳

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800;2.南通科技職業(yè)學(xué)院 環(huán)境與資源系，江蘇 南通 226007)

丙二酸單對(duì)硝基芐酯是一種重要的生物醫(yī)藥中間體，目前該物質(zhì)主要采用化學(xué)方法合成，如由丙二酸和對(duì)硝基芐醇經(jīng)過(guò)酯化、堿酸調(diào)和及精制等步驟制得［1－2］;或在丙二酸存在條件下，催化丙二酸雙酯水解得到［3］。這些反應(yīng)過(guò)程具有原料成本高，反應(yīng)能耗大，后處理程序復(fù)雜，產(chǎn)品純度較低等缺點(diǎn)，且易造成環(huán)境污染。酶催化技術(shù)，尤其是以固定化脂肪酶為催化劑直接催化酯化反應(yīng)可以有效解決這些問(wèn)題。固定化脂肪酶具有穩(wěn)定性高、易與底物及產(chǎn)物分離、可重復(fù)利用、提高脂肪酶的利用效率、降低反應(yīng)成本等眾多優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、化學(xué)化工及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［4-8］。然而，固定化脂肪酶催化酯化反應(yīng)為非均相反應(yīng)，液態(tài)底物容易在固定化脂肪酶顆粒表面形成邊界層，液相主體中的反應(yīng)底物必須穿過(guò)邊界層才能到達(dá)固定化脂肪酶分子表面，因而強(qiáng)化底物與固定化脂肪酶、底物與底物之間的傳質(zhì)是提升反應(yīng)速率的關(guān)鍵。

朱凱等［9］和 Liu等［10］研究發(fā)現(xiàn)超聲是一種增強(qiáng)傳質(zhì)作用的有效手段，有助于提升酶促反應(yīng)速率。在固定化脂肪酶催化酯化反應(yīng)中引入超聲，一方面有利于底物由液相主體傳遞到酶分子活性中心及產(chǎn)物的脫離，另一方面可以加速底物的溶解［11］。彭?xiàng)畹龋?2］研究發(fā)現(xiàn)超聲會(huì)影響脂肪酶的穩(wěn)定性。

筆者將超聲應(yīng)用于固定化脂肪酶Novozym 435催化合成丙二酸單對(duì)硝基芐酯反應(yīng)，考察超聲固定化脂肪酶協(xié)同作用對(duì)酯化反應(yīng)的影響，對(duì)超聲輔助Novozym 435催化合成丙二酸單對(duì)硝基芐酯反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并與常規(guī)恒溫振蕩水浴方式下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，以期為合成丙二酸單對(duì)硝基芐酯提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

Novozym 435固定化脂肪酶(BR)，南京奧多福尼生物技術(shù)有限責(zé)任公司;丙二酸(AR)、對(duì)硝基芐醇(AR)、甲苯(AR)、甲醇(色譜純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為自制去離子水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CS-3型水聽(tīng)器，中科院聲學(xué)研究所;DGCI-1200型超聲處理器(含換能器)，無(wú)錫德嘉電子有限公司;HN型超聲波發(fā)生器，無(wú)錫市華能超聲電子有限公司;SR8型示波器，江蘇揚(yáng)中電子儀器廠;DSHZ-300A型旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Summit高效液相色譜儀，美國(guó)戴安公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丙二酸單對(duì)硝基芐酯含量測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定丙二酸單對(duì)硝基芐酯含量，具體分析條件為采用Alltech-C18色譜柱，柱溫為40℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)254 nm，以0.02 mol/L甲醇-磷酸緩沖溶液(體積比7∶3)為流動(dòng)相，流速為 0.6 mL/min，取樣量為 20 μL［13］。

1.2.2 丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率計(jì)算

丙二酸單對(duì)硝基芐酯的收率計(jì)算見(jiàn)式(1)。

式中:n為實(shí)際得到丙二酸單對(duì)硝基芐酯的物質(zhì)的量，mmol;N為理論丙二酸單對(duì)硝基芐酯的物質(zhì)的量(以對(duì)硝基芐醇加入量計(jì))，mmol。

1.2.3 反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)酶促合成丙二酸單對(duì)硝基芐酯的影響

在100 mL三角瓶中加入0.4 g Novozym 435，振蕩使酶分散均勻?？焖偌尤?.5 g對(duì)硝基芐醇和0.34 g丙二酸及一定體積甲苯溶劑，分別置于振蕩水浴(180 r/min)或連續(xù)作用的超聲反應(yīng)器(聲強(qiáng)為0.5 W/cm2)中反應(yīng)，考察反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響。

1.2.4 底物濃度和Novozym 435濃度對(duì)酶促合成丙二酸單對(duì)硝基芐酯的影響

分別在超聲聲強(qiáng)0.5 W/cm2、頻率20 kHz、溫度30℃、反應(yīng)時(shí)間5 h作用下和溫度45℃、反應(yīng)時(shí)間8 h的振蕩水浴中考察對(duì)硝基芐醇濃度和Novozym 435濃度對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響。

1.2.5 超聲對(duì)酶促合成丙二酸單對(duì)硝基芐酯的影響

在3.0 g/L Novozym 435、4.0 g/L對(duì)硝基芐醇、反應(yīng)時(shí)間為5 h、反應(yīng)溫度為30℃條件下，考察超聲對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率和Novozym 435重復(fù)使用性能的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響

考察振蕩水浴和超聲作用時(shí)反應(yīng)時(shí)間對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知:在25℃的振蕩水浴中，產(chǎn)物丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，反應(yīng)8 h趨于穩(wěn)定，最大收率為38.7%。超聲作用下和振蕩水浴中，產(chǎn)物丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率隨時(shí)間變化趨勢(shì)基本相同。但與振動(dòng)水浴相比，超聲作用下反應(yīng)5 h即達(dá)到平衡，最大收率為62.3%，提升產(chǎn)物收率的同時(shí)，有效縮短了反應(yīng)時(shí)間。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率影響結(jié)果

溫度是影響化學(xué)反應(yīng)的重要因素，溫度升高有利于加速反應(yīng)，但是在酶催化反應(yīng)中，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶變性失活?？疾煺袷幩『统曒椪諚l件下，反應(yīng)溫度對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:在振蕩水浴中和超聲作用下，最佳反應(yīng)溫度分別為45和30℃。這是因?yàn)橹久笇?duì)溫度較為敏感，低溫不利于酶活的發(fā)揮，產(chǎn)物收率較小;高溫致使脂肪酶失活，產(chǎn)物收率下降較明顯。在超聲輔助條件下，當(dāng)溫度超過(guò)40℃時(shí)，丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率下降較為顯著。這可能是因?yàn)楦邷貤l件利于超聲空化作用的發(fā)生，劇烈的空化作用破壞了脂肪酶的空間構(gòu)象，導(dǎo)致其催化活力下降，產(chǎn)物收率降低［14］。因此，后續(xù)超聲輔助酶促酯化反應(yīng)都在30℃下進(jìn)行。

2.3 對(duì)硝基芐醇濃度對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率影響

在對(duì)硝基芐醇和丙二酸摩爾比為1∶1、4.0 g/L Novozym 435條件下，考察超聲作用下和振蕩水浴中底物對(duì)硝基芐醇濃度對(duì)酶促酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知:在振蕩水浴中，當(dāng)對(duì)硝基芐醇質(zhì)量濃度為6.0 g/L時(shí)，丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率達(dá)到最大值62.4%。劉輝等［15］研究表明，對(duì)硝基芐醇對(duì)酶促酯化反應(yīng)有促進(jìn)作用，而酸對(duì)酶促酯化反應(yīng)起抑制作用。因醇酸摩爾比固定，增加對(duì)硝基芐醇濃度，丙二酸濃度隨之增大，過(guò)高濃度的丙二酸降低反應(yīng)體系的pH，導(dǎo)致脂肪酶的活性降低，抑制酶促反應(yīng)的進(jìn)行，丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率降低。在超聲輔助酶促酯化反應(yīng)過(guò)程中，對(duì)硝基芐醇質(zhì)量濃度為4.0 g/L時(shí)，產(chǎn)物丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率達(dá)到最大值78.1%，超聲有效強(qiáng)化了傳質(zhì)，增加了底物之間及底物與酶的接觸幾率，進(jìn)而增加了反應(yīng)速率，且丙二酸濃度相對(duì)較低，對(duì)反應(yīng)抑制作用較弱，因此產(chǎn)物收率相對(duì)較高。

圖3 對(duì)硝基芐醇濃度對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響Fig.3 Effects of 4-nitrobenzyl alcohol concentration on mono-p-nitrobenzyl malonate yield

2.4 Novozym 435用量對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響

作為酯化反應(yīng)的催化劑，脂肪酶濃度是影響酶促反應(yīng)的關(guān)鍵因素。增大脂肪酶濃度，即增大酶的活性位點(diǎn)與底物接觸的幾率，因此產(chǎn)物收率增大。但是，固定化酶價(jià)格相對(duì)較高，因此在酶促酯化反應(yīng)中需綜合考慮其成本。對(duì)超聲輔助和振蕩水浴中酶促酯化反應(yīng)的催化劑Novozym 435濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知:在振蕩水浴中和超聲作用下，Novozym 435質(zhì)量濃度分別為4.5和3.0 g/L時(shí)，丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率達(dá)到穩(wěn)定。說(shuō)明該濃度下的固定化脂肪酶分子周圍的底物濃度已達(dá)到平衡，繼續(xù)增加其濃度，對(duì)反應(yīng)平衡影響較小;超聲作用的傳質(zhì)效果高于振蕩作用，有效增大了酶與底物的接觸幾率，因而在提升產(chǎn)物收率的同時(shí)減少了脂肪酶用量，節(jié)約了反應(yīng)成本。

圖4 Novozym 435濃度對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響Fig.4 Effects of Novozym 435 concentration on mono-p-nitrobenzyl malonate yield

2.5 超聲頻率對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響

Entezari等［16］研究認(rèn)為，改變超聲頻率會(huì)改變穩(wěn)態(tài)空化泡，超聲振動(dòng)過(guò)程產(chǎn)生的輻射壓力和微射流會(huì)對(duì)脂肪酶分子和酶促化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生影響。在超聲聲強(qiáng)為0.5 W/cm2時(shí)，考察超聲頻率對(duì)酶促酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知:超聲頻率較低時(shí)，丙二酸對(duì)硝基芐酯收率較高，20和24 kHz的超聲作用下酶促酯化反應(yīng)產(chǎn)物收率分別為77.1%和81.6%。超聲頻率高于28 kHz，產(chǎn)物收率隨超聲頻率的增加而減小。這可能是因?yàn)轭l率增加，超聲空化氣泡的存在周期縮短，空化核來(lái)不及成長(zhǎng)為空化泡;在低頻超聲作用下，空化泡的存在周期較長(zhǎng)，有利于脂肪酶分子形成活性更強(qiáng)的空間構(gòu)象，催化活力增強(qiáng)，產(chǎn)物丙二酸單對(duì)硝基芐酯的收率較高［17］。從節(jié)約成本考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用20 kHz超聲。

圖5 超聲頻率對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic frequency on mono-p-nitrobenzyl malonate yield

2.6 超聲聲強(qiáng)對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響

聲強(qiáng)是超聲酶促酶促酯化反應(yīng)的重要影響因素，超聲強(qiáng)度低對(duì)反應(yīng)過(guò)程傳質(zhì)促進(jìn)作用小，超聲強(qiáng)度過(guò)高又會(huì)造成脂肪酶失活［18－19］?？疾斐晱?qiáng)度對(duì)Novozym 435催化酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。超聲強(qiáng)度采用量熱法測(cè)定［20］，超聲頻率為20 kHz。由圖6可知:當(dāng)超聲聲強(qiáng)小于0.8 W/cm2時(shí)，酯化產(chǎn)物丙二酸單對(duì)硝基芐酯的收率隨著超聲聲強(qiáng)的增加而迅速增大，超聲聲強(qiáng)為0.8 W/cm2時(shí)達(dá)到最大值89.7%，聲強(qiáng)超過(guò)0.8 W/cm2，產(chǎn)物收率降低。這可能是因?yàn)檫m宜強(qiáng)度的超聲作用強(qiáng)化了傳質(zhì)，阻止固定化脂肪酶分子周圍形成水膜，加速酶促反應(yīng)。但是，超聲聲強(qiáng)過(guò)高，劇烈的超聲空化作用會(huì)破壞脂肪酶分子的空間構(gòu)象，導(dǎo)致脂肪酶蛋白的變性失活［21］，丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率減小。

圖6 超聲聲強(qiáng)對(duì)丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic intensity on mono-p-nitrobenzyl malonate yield

此外，固定化脂肪酶價(jià)格昂貴，重復(fù)利用可以降低酶促反應(yīng)成本。在超聲輔助酶促反應(yīng)最佳條件下，重復(fù)使用Novozym 435催化合成丙二酸單對(duì)硝基芐酯，考察超聲對(duì)固定化脂肪酶重復(fù)使用性能的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知:Novozym 435重復(fù)使用8次后，丙二酸單對(duì)硝基芐酯收率仍可達(dá)到69.3%，說(shuō)明超聲輔助作用于固定化脂肪酶催化合成丙二酸單對(duì)硝基芐酯反應(yīng)較為穩(wěn)定。

3 結(jié)論

圖7 超聲作用對(duì)固定化脂肪酶重復(fù)使用性能的影響Fig.7 Effects of ultrasonic treatment on reusability of immobilized lipase

研究了超聲輻照作用下非水介質(zhì)中固定化脂肪酶Novozym 435催化促丙二酸和對(duì)硝基芐醇合成丙二酸單對(duì)硝基芐酯的反應(yīng)，考察了超聲作用對(duì)酶促酯化反應(yīng)的影響，對(duì)超聲作用下酶法合成反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并與振蕩水浴條件下的酶促反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比。當(dāng)反應(yīng)溫度為30℃、Novozym 435質(zhì)量濃度為3.0 g/L時(shí)，對(duì)硝基芐醇質(zhì)量濃度為4.0 g/L，底物摩爾比1∶1時(shí)，在頻率為 20 kHz、聲強(qiáng)為0.8 W/m2的超聲作用下反應(yīng)5 h，產(chǎn)物丙二酸單對(duì)硝基芐酯最大收率為89.7%。與振蕩水浴相比，溫度降低了15℃，時(shí)間縮短了3 h，酶用量減少了1.5 g/L，而產(chǎn)物收率增加了 18.2%。超聲作用下Novozym 435重復(fù)應(yīng)用于酯化反應(yīng)8次，產(chǎn)物收率仍達(dá)到69.3%。

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