李玉明，肖 亮，李 薇，劉 劍

（衡陽師范學院化學與材料科學學院，湖南 衡陽 421008）

臍橙的營養(yǎng)既豐富又全面，含有大量的維生素C 和胡蘿卜素，具有很高的營養(yǎng)保健價值。人體不能合成維生素C，維生素C 的生理功能主要有抗壞血病，保證膠原蛋白的正常合成，保護牙齦，預防動脈硬化，抗氧化作用[1]，治療貧血，防癌，提高人體的免疫力[2]，提高機體的應急能力等[3]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-10Avp 高效液相色譜儀，UV2501 紫外- 可見分光光度儀，AS3120 超聲波脫氣裝置，AP-01 真空抽濾裝置，電子分析天平。

維生素C 標樣（含量為99.7%），純水（自制），甲醇（色譜純），磷酸（分析純），臍橙（市售）。

1.2 實驗方法

1.2.1 流動相的配制

將純水用0.45μm 微孔濾膜真空抽濾，裝在潔凈的大試劑瓶中，然后超聲波脫氣15 30min，備用。將甲醇用超聲波脫氣15 30min，備用。

1.2.2 標準溶液的配制

稱取50.0mg 維生素C 樣品，用純水溶解，轉入容量瓶內(nèi)，定容至500mL，配制成0.1mg·mL-1的維生素C 標準溶液，再配成濃度分別為0.02mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.06mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.10mg·mL-1的維生素C 標準溶液。

1.2.3 樣品溶液的配制

稱取一定量的臍橙果肉于研缽中，研磨充分，加適量0.1%的磷酸溶液，超聲波提取0.5h 后，過濾，將濾液高速離心5 10min，取上清液，再用純水稀釋定容至250mL，搖勻，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜真空抽濾，脫氣，待用[4-5]。

1.2.4 分析方法

配制好流動相、標準溶液和樣品溶液，采用標準曲線法確定最佳分析條件，再定量分析[6]。

2 結果與討論

2.1 測定波長的選擇

將維生素C 用紫外光譜儀在波長200 400nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)在267nm時色譜圖的峰面積最大，波形最好，吸收最高。結合文獻資料，本實驗選擇267nm和254nm為維生素C的HPLC分析檢測波長。

2.2 流動相及流速的選擇

考慮到維生素C 在酸性環(huán)境中相對比較穩(wěn)定，起初選擇pH 值為酸性的流動相，采用甲醇以及0.1%的磷酸以不同的比例混合作為流動相進行實驗，結果出現(xiàn)的峰雜亂，峰形不好，保留時間相對較長。然后改用純水作為流動相進行實驗，出峰很好，并采用現(xiàn)配現(xiàn)測的方式來避免維生素C 的不穩(wěn)定性。

A.檢測波長：267nm；流動相：甲醇；流動相流速：0.6mL·min-1；檢測溫度：25℃；進樣：10μL。實驗測定結果顯示，維生素C 的出峰不理想，有較多雜峰。

圖1 A 測定條件下維生素C 的標準溶液濃度和峰面積標準曲線

B.檢測波長：267nm；流動相：純水；流動相流速：0.6mL·min-1；檢測溫度：25℃；進樣：10μL。

C.檢測波長：267nm；流動相：純水；流動相流速：1.0mL·min-1；檢測溫度：25℃；進樣：10μL。

圖2 C 測定條件下維生素C 的標準溶液濃度和峰面積標準曲線

D.檢測波長：254nm；流動相：純水；流動相流速：0.8mL·min-1；檢測溫度：25℃；進樣：10μL。

圖3 D 測定條件下維生素C 的標準溶液濃度和峰面積標準曲線

E.檢測波長：267nm；流動相：純水；流動相流速：0.8mL·min-1；檢測溫度：25℃；進樣：15μL。

F.檢測波長：267nm；流動相：純水；流動相流速：0.8mL· min-1；檢測溫度：25℃；進樣：10μL。

圖4 E 測定條件下維生素C 的標準溶液濃度和峰面積標準曲線

表1 在F 測定條件下不同濃度的維生素C 標準溶液的峰面積以及保留時間

圖5 F 測定條件下維生素C 的標準溶液濃度和峰面積標準曲線

由實驗過程可知，用甲醇作流動相時液相色譜峰峰形雜亂，純水作流動相時，峰形相對來說都較好。由圖1 到圖5 對比得出以下結論：維生素C 標準溶液濃度和峰面積標準曲線的線性方程線性關系好，R2值比較接近且均在0.98 以上，保留時間波動不大。當檢測波長為267nm，流動相為純水，流動相流速0.8mL·min-1，檢測溫度25℃，進樣量為10μL時，HPLC 分析實驗結果最好，峰形好，線性相關性最好。所以，臍橙果肉中維生素C 的HPLC 分析檢測條件為：以純水作流動相，檢測波長為267nm，流動相速度為0.8mL·min-1，檢測溫度為25℃，進樣量10μL。

2.3 維生素C 標準溶液色譜圖

以純水作流動相，檢測溫度為25℃，進樣量10μL，檢測波長為267nm，流動相速度為0.8mL·min-1，維生素C 標準樣品溶液色譜圖見圖6。

圖6 維生素C 標準溶液色譜圖

2.4 待測樣品重復性的測定

樣品的重復性實驗結果見表2。表2 結果表明，重復性的精密度相對較高，相對標準偏差為0.70%。重復性的精密度越高，偏差越小，說明該實驗中的隨機誤差小。

表2 樣品重復性實驗結果

3 結論

本文對臍橙果肉中維生素C 的HPLC 分析方法進行了研究，經(jīng)過一系列的實驗條件探索，得出最佳實驗條件為：以純水為流動相，檢測波長為267nm，流動相流速為0.8mL·min-1；檢測溫度25℃。在此條件下得出的液相色譜峰峰形好，峰面積大，標準溶液濃度與峰面積具有良好的線性關系，其相關系數(shù)R2＝0.9993，臍橙果肉待測樣品重復性實驗相對標準偏差為0.70%，表明重復性的精密度高，實驗中的隨機誤差小。該實驗方法簡單、高效、準確度高，適用于臍橙果肉中維生素C 含量的測定。

[1] 王鏡巖.生物化學(上冊)[M].北京：高等教育出版社，2007：461-463.

[2] 吳梧桐.生物化學[M].北京：高等教育出版社，2007：54-55.

[3] 朱志偉.壞血病的克星-維生素C[J].大學化學，2010(25)：66-68.

[4] 于世林.高效液相色譜方法及應用[M].北京：化學工業(yè)出版社，2000：30-34.

[5] 何優(yōu)選，梁奇峰.高效液相色譜法測定梅縣沙田柚果肉中維生素C 的含量[J].光譜實驗 室，2010，27(4)：1290-1293.

[6] 汪正范.色譜定量與定性分析[M].北京：化學工業(yè)出版社，2000：60-63.