劉　亮，丁麗娜，陳東林，馮　華，周英信

（1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州，遵義 563002； 2.遵義市藥品檢驗(yàn)所，貴州，遵義　563000）

天冬總皂苷的超聲提取工藝優(yōu)化

*劉亮1，丁麗娜1，陳東林1，馮華2，周英信1

（1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州，遵義 563002； 2.遵義市藥品檢驗(yàn)所，貴州，遵義563000）

目的探討天冬總皂苷含量的測(cè)定方法，優(yōu)化超聲提取工藝。方法以菝葜皂苷元為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測(cè)定總皂苷的含量，用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲提取工藝。結(jié)果菝葜皂苷元質(zhì)量濃度在5.2～52 μg/mL之間線性關(guān)系良好（r = 0.9994），總皂苷平均回收率達(dá)到98.83%（RSD = 1.88%）。最佳超聲提取工藝為乙醇濃度50%、料液比1:20（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間20 min。結(jié)論總皂苷含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、易行、準(zhǔn)確，超聲提取工藝高效、快捷，易于推廣。

天冬；總皂苷；超聲提取

天冬為百合科植物天門(mén)冬［Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.］的塊根，是一種臨床常用中藥，具有養(yǎng)陰清熱，潤(rùn)肺滋腎的功效，臨床上多用于治陰虛發(fā)熱、咳嗽吐血、肺癰、咽喉腫痛、消渴、便秘等病癥。通過(guò)文獻(xiàn)查閱，筆者發(fā)現(xiàn)天冬中含有多種甾體皂苷類、糖類、氨基酸類、還含有甾醇類、強(qiáng)心苷類及豐富的維生素等成分［1-2］，其中甾體皂苷是天冬中所含有的一類重要活性成分，該類成分的藥理學(xué)研究目前主要有抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗血小板凝聚等方面［3-4］。目前對(duì)其多糖、氨基酸提取工藝方面研究較少［5-6］，對(duì)皂苷提取工藝研究更少［7］，難以進(jìn)行深入開(kāi)發(fā)。本實(shí)驗(yàn)以總皂苷含量為指標(biāo)，對(duì)天冬超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為制定天冬藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

天冬藥材采集于貴州遵義，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校張學(xué)愈副教授鑒定為百合科植物天門(mén)冬［Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.］的塊根；菝葜皂苷元對(duì)照品購(gòu)于上海圻明生物科技有限公司（批號(hào)：126-19-2）；所用水為高純水，其它試劑均為分析純。

JBT/C-YCL400T/3P（D） 型超聲波藥品處理機(jī)（濟(jì)寧金百特工程機(jī)械有限公司）；Aquelix 5型實(shí)驗(yàn)室高純水系統(tǒng)（重慶市金富科技發(fā)展有限公司）；UV2501紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；Senco R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；FY130型藥物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA2004B型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1天冬總皂苷的含量測(cè)定

1.2.1.1供試品溶液的制備

稱取天冬藥材粗粉5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，超聲提?。?8 kHz，150 W），過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取10 mL于分液漏斗中，用水飽合正丁醇分3次萃取，每次15 mL，正丁醇萃取液再用正丁醇飽和的水20 mL萃取后，減壓回收正丁醇至干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ萦?5 mL容量瓶中，作為供試品溶液。

1.2.1.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取菝葜皂苷元對(duì)照品7.8 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

1.2.1.3測(cè)定波長(zhǎng)的確定

分別精密吸取對(duì)照品溶液0.3 mL、供試品溶液1.2 mL置于15 mL具塞試管中，揮干甲醇，再分別加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，密塞，60 ℃水浴顯色15 min，取出后立即用冰水冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置10 min，在400～800 nm進(jìn)行掃描，選擇最大吸收波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)［8］。

1.2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密移取菝葜皂苷元對(duì)照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于15 mL具塞試管內(nèi)，揮干甲醇，按1.2.1.3項(xiàng)下的操作方法顯色，于455 nm處測(cè)定其吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 超聲提取單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響天冬皂苷超聲提取的因素很多，如提取功率、提取溫度、提取時(shí)間、溶劑濃度、溶劑倍量等。在查閱文獻(xiàn)［9-14］的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以乙醇作為提取溶劑，選取乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%） 、料液比（ 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL） 、提取溫度（ 30、40、50、60、70、80℃）和提取時(shí)間（ 10、20、30、40、50、60 min） 4因素6水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察不同因素對(duì)天冬皂苷提取含量的影響，并篩選各因素的3個(gè)最佳水平。

1.2.3超聲提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稱取天冬藥材粗粉，按L9（34）正交因素水平表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（表1），以優(yōu)化天冬皂苷的提取條件。應(yīng)用最佳的超聲提取工藝測(cè)定天冬中的皂苷，重復(fù)3次，以驗(yàn)證本工藝的準(zhǔn)確性。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　The factors and levels for the orthogonal design

2　結(jié)果

2.1 總皂苷含量測(cè)定

2.1.1測(cè)定波長(zhǎng)

掃描圖譜顯示對(duì)照品在455 nm處有較大吸收峰（圖1），而樣品在455 nm處有最大吸收峰（圖2），故選擇455 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1　對(duì)照品溶液吸收曲線Fig.1　Absorption curve of standard solution

圖2　供試品溶液吸收曲線Fig.2　Absorption curve of test solution

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）計(jì)算出回歸曲線方程為A = 0.01169C+0.03056，r = 0.9994。表明對(duì)照品菝葜皂苷元質(zhì)量濃度在5.2～52 μg/mL與吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖3　菝葜皂苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve of sarsasapogenin

2.1.3總皂苷含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.1.3.1精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照液0.8 mL，共6份，按1.2.1.3項(xiàng)下的操作方法顯色，于455 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為0.50%，表明方法的精密度良好。

2.1.3.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液0.3 mL、供試品溶液0.6 mL，按1.2.1.3項(xiàng)下的操作方法顯色，于455 nm處分別在0、10、20、30、60、90、120 min測(cè)定吸光度，結(jié)果表明對(duì)照液及供試液顯色后在120 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD分別為1.02%，1.42%。

2.1.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批樣品5 g，共6份，按1.2.1.1及1.2.1.3項(xiàng)下的操作方法顯色，于455 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為0.90 %，RSD為0.73 %，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.3.4加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取已知含量的樣品溶液0.6 mL于具塞試管中，共6份，分別加入對(duì)照品溶液0.3 mL，按1.2.1.3項(xiàng)下的操作方法顯色，于455 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果總皂苷平均回收率為98.83%，RSD為1.88%。

2.2超聲提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1乙醇濃度的影響

由圖4可知（提取溫度60℃、時(shí)間30 min、料液比1:20），乙醇濃度在40%～90% 范圍內(nèi)，天冬皂苷的提取量隨乙醇濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。根據(jù)相似相容原理，隨著乙醇濃度的增加，當(dāng)其極性越接近于天冬皂苷的極性時(shí)，有利于提取，當(dāng)乙醇濃度增加到50 % 時(shí)，皂苷提取量即達(dá)到最高。其中以40%～60% 的乙醇溶液提取的皂苷含量相對(duì)較高，因此選擇乙醇濃度40 %、50 %、60 %作為正交實(shí)驗(yàn)的3水平。

2.2.2料液比的影響

圖4　乙醇濃度對(duì)總皂苷含量的影響Fig.4　Effect of ethanol concentration on the extraction of total saponins

由圖5可知（提取溫度60 ℃、時(shí)間30 min、乙醇濃度50 %），當(dāng)料液比為1:15（g/mL）以上后總皂苷提取量基本無(wú)變化，說(shuō)明提取已達(dá)到平衡狀態(tài)。從提取率和成本等方面考慮，乙醇的用量不宜過(guò)大，因此選取料液比為1:10、1:15、1:20（g/mL）作為正交實(shí)驗(yàn)的3水平。

圖5　料液比對(duì)總皂苷含量的影響Fig.5　Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction of total saponins

2.2.3 提取溫度的影響

由圖6可知（提取時(shí)間30 min、料液比1:15、乙醇濃度50%），提取溫度在30～50 ℃范圍內(nèi)，皂苷提取量隨溫度的升高而明顯增加；在50～80 ℃范圍內(nèi)，皂苷提取量逐漸下降，說(shuō)明溫度過(guò)低或過(guò)高均不利用皂苷的提取。因此選擇40 ℃、50 ℃、60 ℃作為正交實(shí)驗(yàn)的3水平。

圖6　提取溫度對(duì)總皂苷含量的影響Fig.6　Effect of temperature on extraction content of total saponins

2.2.4 提取時(shí)間的影響

由圖7可知（提取溫度50 ℃、料液比1:15、乙醇濃度50%），在15～20 min范圍內(nèi)，皂苷提取量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)20 min之后，提取含量極緩慢下降，說(shuō)明提取已達(dá)到平衡狀態(tài)。因此選擇10、20、30 min作為正交實(shí)驗(yàn)的3水平。

圖7　提取時(shí)間對(duì)總皂苷含量的影響Fig.7　Effect of time on extraction content of total saponins

2.3 超聲提取正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以基本確定天冬皂苷超聲提取時(shí)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度的合理范圍，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以確定其超聲提取的最佳工藝。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2和表3。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of reciprocal orthogonal test

表3　方差分析Table 3　Variance analyses

由表2 、表3 可見(jiàn)，乙醇濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有顯著性影響（P ＜ 0.05），影響因素主次順序?yàn)镈 ＞B ＞ C ＞ A，最優(yōu)工藝為A3B2C3D2，即超聲提取的最佳工藝為乙醇濃度50%、料液比1:20（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間20 min。按照正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，天冬總皂苷含量平均值為0.94 %，RSD 為0.52 %。

3　討論

皂苷分子結(jié)構(gòu)中無(wú)共軛雙鍵，在紫外可見(jiàn)光區(qū)無(wú)特征性吸收峰，可以利用顯色反應(yīng)后在可見(jiàn)光范圍產(chǎn)生特征性吸收峰。根據(jù)前期文獻(xiàn)的研究，結(jié)合紫外法的顯色特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)以菝葜皂苷元為對(duì)照品，采用香草醛-高氯酸法顯色，對(duì)天冬中總皂苷的含量測(cè)定進(jìn)行了方法學(xué)考察，顯色過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間。

超聲提取方法的原理是利用超聲波的機(jī)械作用、空化作用等達(dá)到植物細(xì)胞的破碎，加速有效成分的溶出、擴(kuò)散，具有省時(shí)、節(jié)能、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。從理論上考慮，提取時(shí)間越長(zhǎng)、溫度越高，總皂苷得率應(yīng)越高，但單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果不支持該觀點(diǎn)，可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高、超聲強(qiáng)化作用增加了雜質(zhì)的溶出，從而導(dǎo)致總皂苷溶解量減少?？傇碥盏募兓壤闷湓诤〈贾腥芙舛容^大的性質(zhì)進(jìn)行萃取，進(jìn)而用水萃取除去水溶性的雜質(zhì)，可以得到純化的總皂苷。由于皂苷具有很強(qiáng)的發(fā)泡性，故在濃縮過(guò)程中應(yīng)時(shí)刻注意，避免濃縮液沖出，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選天冬超聲提取工藝，單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)皂苷提取效果的影響，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇4因素3水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明只有乙醇濃度對(duì)總皂苷的含量有顯著性影響，影響因素主次順序?yàn)镈 ＞ B ＞ C ＞ A，最佳工藝為A3B2C3D2，即超聲提取的最佳工藝為乙醇濃度50%、料液比1:20（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間20 min。實(shí)驗(yàn)之初對(duì)天冬總皂苷回流提取法進(jìn)行了研究，回流提取工藝為提取時(shí)間1.5 h、乙醇倍數(shù)8倍、乙醇濃度70%、提取次數(shù)3次，含量可達(dá)到1.12%，略高于超聲法，但超聲法提取快速高效的優(yōu)勢(shì)是回流法無(wú)法比擬的。依照超聲法最佳提取工藝做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，天冬總皂苷提取含量平均值0.94 %（已對(duì)此數(shù)據(jù)進(jìn)行核實(shí)，確為天冬總皂苷的含量，與參考文獻(xiàn)7比較要低些，但顯色方法及測(cè)量波長(zhǎng)不一樣，所以總皂苷的含量就不一樣），RSD為0.52 %。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)，優(yōu)化后的工藝路線穩(wěn)定可行，操作簡(jiǎn)便，節(jié)省時(shí)間和溶劑，可為天冬的生產(chǎn)應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)和參考。

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ULTRASONIC EXTRACTION OPTIMIZATION OF TOTAL SAPONINS FROM ASPARAGUS COCHINCHINENSIS （LOUR.） MERR.

*LIU Liang1， DING Li-na1， CHEN Dong-lin1， FENG Hua2， ZHOU Ying-xin1

（1.Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi， Guizhou 563002， China；2.Zunyi Institute for Drug Control， Zunyi， Guizhou 563000， China）

Objective: To develop a method for determining the content of total saponins in Asparagus cochinchinensis and optimize its ultrasonic extraction process.Methods: Sarsasapogenin as the control sample，the content of total saponins was determined by ultraviolet spectrophotometry.Optimization of the ultrasonic extraction process of total saponins was performed using single factor and orthogonal array design methods.Results: The calibration curve of the sarsasapogenin was linear （r = 0.9994） in the range of 5.2～52 μg/mL with average spike recovery of 98.83% （RSD = 1.88%）.The optimum ultrasonic extraction conditions were found to be: ethanol concentration of 50%， solid-to-liquid ratio of 1:20， extraction temperature of 60℃， ultrasonic extraction duration of 20 minutes.Conclusion: The developed method for total saponins determination is simple， feasible and accurate.The optimized extraction process is efficient and quick， and easy to popularize.

Asparagus cochinchinensis； total saponins； ultrasonic extraction

R284.2

ADOI:10.3969/j.issn.1674-8085.2015.02.020

1674-8085（2015）02-0081-06

2015-01-09；修改日期：2015-03-01

遵義市科技局、遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校聯(lián)合科技計(jì)劃項(xiàng)目（遵市科合社字【2013】24號(hào)）；遵義市匯川區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目。作者簡(jiǎn)介：*劉亮（1981-），男，重慶萬(wàn)州人，副教授，主要從事中藥、民族藥化學(xué)成分及質(zhì)量研究（E-mail:jikman1@163.com）；

丁麗娜（1981-），女，貴州遵義人，講師，主要從事天然藥物化學(xué)成分及質(zhì)量研究（E-mail:lifewaterdln0681@qq.com）；

陳東林（1961-），女，貴州遵義人，教授，主要從事蔬菜化肥、農(nóng)藥含量（E-mail:1064618089@qq.com）；

馮華（1978-），男，貴州遵義人，主管藥師，主要從事新藥研究及藥品檢驗(yàn)（E-mail:fenghua781014@yahoo.com.cn）；

周英信（1962-），男，貴州遵義人，教授，主要從事脾胃病證治研究（E-mail:E-mail:1487476788@qq.com）.