李 勇 王莉華

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 鄭州 450007

50%的神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）發(fā)生在2 歲以內(nèi)的嬰幼兒。NB預(yù)后差別很大，有廣泛的腫瘤異質(zhì)性［1］。低危組NB患者（嬰幼兒）臨床觀察或手術(shù)可以取得良好療效；高危組NB患者即使綜合治療預(yù)后仍不佳。NB 屬于神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤，超過(guò)50%的神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人發(fā)生轉(zhuǎn)移，尤其骨轉(zhuǎn)移嚴(yán)重威脅兒童的健康［2］。盡管有許多因素與NB發(fā)病機(jī)制相關(guān)［3］，但對(duì)關(guān)鍵分子機(jī)制和NB終末期決定因素尚未清楚。因此，識(shí)別新介質(zhì)對(duì)NB 發(fā)病機(jī)制非常重要。本課題擬對(duì)mir－181c在NB中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討。

1 實(shí)驗(yàn)步驟

1.1 組織樣本和細(xì)胞系 12個(gè)NB組織從鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)外科獲得。經(jīng)組織病理學(xué)檢查確認(rèn)，并存儲(chǔ)在－80液態(tài)氮。人類(lèi)NB細(xì)胞系SK－N－SH 和SH－SY5Y 培養(yǎng)在（Eagle＇s Minimum Essential Medium EMEM Gibco），用10%胎牛血清緩沖，補(bǔ)充100 U／mL 青霉素／鏈霉素（PEST）。所有細(xì)胞都保存在5%CO237 ℃濕潤(rùn)孵化器。

1.2 寡核苷酸合成和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 MiR－181c模塊，miR－181c反義寡核苷酸（AOS），模塊（mimics－ctrl），ASO 控件（ASOctrl），購(gòu)買(mǎi)于上?；蛑圃旃?。使用Lipofectamine TM 2 000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（英杰公司）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 RNA 的提取和實(shí)時(shí)定量PCR 根據(jù)制造商的說(shuō)明方案，使用Trizol提取總的RNA。使用NanDrop ND－1000分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定RNA 的濃度和質(zhì)量。然后使用1μg 的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。對(duì)于miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用特定的miR－181cRT 引物，然后用于總RNA 的逆轉(zhuǎn)錄，Oligo（dT）作為一個(gè)通用的引物，使用SYBR GreenPCR 混合物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。條件如下：95℃5min，隨后40個(gè)循環(huán)的95℃30s，57 ℃30s，72 ℃30s。RNU6B（U6 小 核 乙 非 編 碼RNA）作為miR－181c正常表達(dá)的所有使用的引物如下：miR－181c RT primer：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCACCG 3’；U6 RT primer：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AAAATATGGAAC3’；miR－181cforward primer：5’ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACCTG 3’；U6 forward primer：5’ACACTCCAGCTGGGGTGCTCGCTTCGGCAGCACA 3’；Reverse primer：5’TGGTGTCGTGGAGTCG 3’。

1.4 腫瘤細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)（MTT） 鋪96孔板，4 000個(gè)／每孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h 后，用MTT 培養(yǎng)4h。加入DMSO 100μL，解除MTT 并將細(xì)胞放置搖晃10min。用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值A(chǔ)（波長(zhǎng)570nm）。細(xì)胞增殖率（%）＝ATest／AControl×100%。

1.5 集落形成試驗(yàn)（克隆實(shí)驗(yàn)） 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種到12孔板中，密度為200個(gè)細(xì)胞／孔。將培養(yǎng)液每3d更換1次，孵育10～14d。當(dāng)大多數(shù)克隆含超過(guò)50個(gè)細(xì)胞時(shí)，終止孵育。用1×PBS洗脫克隆，冷甲醇固定克隆細(xì)胞，結(jié)晶紫染色約5min。將克隆進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。集落形成率＝克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 Transwell小室遷移試驗(yàn)和侵襲試驗(yàn) 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，消化細(xì)胞并離心收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度2.5×104）250μL加入Transwell上室，腔室底部則加入750 μL的含10%～20%血清的培養(yǎng)液。20h后取出Transwell小室，使用棉簽輕輕擦拭小室上層細(xì)胞，使用4%多聚甲醛固定Transwell小室。取出固定好的小室，使用自來(lái)水沖洗小室，結(jié)晶紫染色15 min沖洗。將染好色的小室經(jīng)梯度酒精脫水，風(fēng)干后取下膜層，用中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下計(jì)數(shù)即可。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，2組間比較采用雙樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mir－181c抑制NB組織轉(zhuǎn)移 如圖1示，mir－181c的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移NB組織中表達(dá)降低，與原發(fā)NB組織中表達(dá)水平形成顯明對(duì)比，表明mir－181c與腫瘤生成有關(guān)。

圖1 定量RT－PCR分析Mir－181c表達(dá)率，＊P＜0.05

圖2 mir－181c抑制SK－N－SH 細(xì)胞

2.2 mir－181c抑制SK－N－SH 細(xì)胞擴(kuò)散 經(jīng)RT－PCR 驗(yàn)證了2個(gè)細(xì)胞系，mir－181c模塊或mir－181cASO 轉(zhuǎn)染的SK－NSH 細(xì)胞。MTT 分析 顯 示，mir－181c可 降 低SK－N－SH 細(xì) 胞的活力約20%，而抑制了mir－181c細(xì)胞生存能力提高約25%。mir－181c對(duì)SH－SY5Y 細(xì)胞也有相似的作用。從克隆形成實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)mir－181c的超表達(dá)減少SK－N－SH 克隆細(xì)胞約50%，而抑制mir－181c表達(dá)可導(dǎo)致相反的影響。表明mir－181c可能在腫瘤的生長(zhǎng)起重要作用。見(jiàn)圖2。

2.3 mir－181c抑制SK－N－SH 和SH－SY5Y 細(xì)胞的遷移和入侵 為確定mir－181c是否與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，我們采用Transwell檢測(cè)了mir－181c影響細(xì)胞遷移和入侵作用。發(fā)現(xiàn)mir－181c超表達(dá)減少了遷移和入侵SK－N－SH 細(xì)胞數(shù)量分別為約40%和50%，而抑制mir－181c起相反效果。圖3 顯示mir－181c超表達(dá)減少了遷移和入侵SH－SY5Y 細(xì)胞的數(shù)量。表明mir－181c參與了NB的遷移。

圖3 mir－181c抑 制SK－N－SH 和SH－SY5Y 細(xì) 胞 的 遷移和入侵

3 討論

研究表明miRNA 參與多種生物過(guò)程，包括細(xì)胞的分化、增殖和凋亡［4－5］。超過(guò)50%的miRNA 擁有與癌基因相結(jié)合的脆裂點(diǎn)［6］，到目前為止發(fā)現(xiàn)60%的蛋白編碼基因受miRNA 的調(diào)控［7－8］。研 究 表 明，miRNA 扮 演2 個(gè) 角 色（致 癌 基因／抑癌基因），如mir－490－3p作為一個(gè)致癌因子促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和入侵，而且還會(huì)靶向作用于ERGIC3導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌的上皮間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）［9］。mir－125b抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移特征通過(guò)靶向下調(diào)致癌基因ETS1完成［10］。

許多關(guān)于miRNA 對(duì)NB 組織下調(diào)機(jī)制的研究報(bào)道，但關(guān) 于miRNA 對(duì)NB 組 織 上 調(diào) 機(jī) 制 研 究 仍 很 少［11－12］。mir－335通 過(guò)調(diào)節(jié)TGF－β信 號(hào) 通 路 抑 制NB 細(xì) 胞 入 侵［13］，mir－9通過(guò)靶向作用于MMP－14抑制NB 細(xì)胞的入侵和遷移［14］。mir－15a通過(guò)mir－15a／RECK／MMP－9 軸 促 進(jìn)NB 細(xì) 胞 的 遷移和生長(zhǎng)［15］。研究人員在miRNA 對(duì)NB 組織的分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)及免疫機(jī)制有抑制作用［7］。

NB是兒童常見(jiàn)的實(shí)質(zhì)性惡性腫瘤，可表現(xiàn)為預(yù)后多樣性，NB病因尚不清楚。研究人員進(jìn)行了堿基配對(duì)改變和重排后與NB有關(guān)聯(lián)基因中發(fā)現(xiàn)了癌癥特異性基因突變，其中ARID1A 和ARID1B基因突變與患兒病死率有關(guān)，而且還發(fā)現(xiàn)N－myc基因的擴(kuò)增突變?cè)贜B 中常見(jiàn)，呈雙向擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)此擴(kuò)增方式與腫瘤的擴(kuò)散相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，一些蛋白酶與NB發(fā)病有關(guān)，在腫瘤生物進(jìn)程中起重要作用。在鼠體內(nèi)模型中檢測(cè)54個(gè)與NB有關(guān)的miRNA，發(fā)現(xiàn)35個(gè)上調(diào)，下調(diào)19個(gè)，部分miRNA 在原發(fā)NB 和轉(zhuǎn)移NB 中的表達(dá)有明顯差異，說(shuō)明這些表達(dá)有差異的基因在NB轉(zhuǎn)移中起重要的作用，還發(fā)現(xiàn)NB中基質(zhì)金屬蛋白酶14（MMP－14）與腫瘤病理特性及預(yù)后生存率密切相關(guān)。

MiR－181家族里6個(gè)基因，這些miRNAs均由3個(gè)獨(dú)立的染色體編碼，并產(chǎn)生4個(gè)成熟的miRNA。研究表明，miR－181s在肝細(xì)胞肝癌中超表達(dá)并參與細(xì)胞分化［16］。在肝細(xì)胞肝癌中，TGF－β（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β）可通過(guò)抑制TIMP3 上調(diào)miR－181b，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和入侵［17］。Mir－181c通過(guò)下調(diào)BMPR2 而與室中隔缺損有關(guān)［18］。胃癌中高表達(dá)mir－181c與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，表明mir－181c可能是致癌基因［19］。Fanconi貧血中mir－181c具有促進(jìn)TNF－α克隆潛能作用［20］，表明miR－181家族在包括癌癥的很多疾病的發(fā)生中起促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)用mir－181c－mmics和AOS－mir－181c轉(zhuǎn)染NB 細(xì)胞，MTT 分析顯示mir－181c降低細(xì)胞活力約20%，colony實(shí)驗(yàn)示減少NB細(xì)胞克隆約50%，2組間抑制細(xì)胞生長(zhǎng)率有明顯差異，說(shuō)明mir－181c對(duì)NB細(xì)胞有抑制作用（圖2）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mir－181c在NB細(xì)胞中的新型調(diào)控機(jī)制，證明mir－181c可能在NB發(fā)病機(jī)制中起重要作用。相比之下，本研究組織標(biāo)本中RT－PCR 結(jié)果顯示，mir－181c在轉(zhuǎn)移NB組織中的表達(dá)率明顯低于原發(fā)NB組織，初步肯定mir－181c與NB轉(zhuǎn)移有關(guān)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染mir－181c－mmic可抑制NB細(xì)胞的遷移和侵襲分別約40%和50%（圖3），確定本實(shí)驗(yàn)中mir－181c是抑癌基因。

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