崔娜娜等

摘要

[目的]以克雷伯氏菌（Klebsiella sp.） PHRC1.001為發(fā)酵對象，優(yōu)化該菌產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基組分，并初步評價了該多糖的乳化性質(zhì)。[方法]以多糖粗產(chǎn)量為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化，并通過發(fā)酵罐培養(yǎng)驗(yàn)證了優(yōu)化培養(yǎng)基下的粗多糖產(chǎn)量。[結(jié)果]Klebsiella sp. PHRC1.001產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)培養(yǎng)基為：蔗糖 40 g/L，CaCl2 0.8 g/L，KNO3 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 9.0 g/L，NaH2PO4 3.5 g/L，起始pH 7.0，在此培養(yǎng)基條件下發(fā)酵罐最高粗糖產(chǎn)量達(dá)到21 g/L，約是初始培養(yǎng)基條件下的2.1倍。此外，以中鏈甘油三酸酯（MCT）為油相（20%），1%胞外多糖為乳化劑制備O/W乳液，通過激光粒度儀、光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡表征乳液的粒徑分布和顆粒形態(tài)，通過加速試驗(yàn)表征乳液儲藏物理穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHRC1.001多糖具有較好的乳化活性，該O/W乳液儲藏物理穩(wěn)定性高。[結(jié)論]Klebsiella sp. PHRC1.001為一株高產(chǎn)胞外多糖菌株，且該多糖具有良好的乳化活性，工業(yè)應(yīng)用前景良好。

關(guān)鍵詞胞外多糖；克雷伯氏菌；培養(yǎng)基優(yōu)化；乳化性質(zhì)

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）21-038-05

基金項(xiàng)目國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31322043）；湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊計劃（T201307）；湖北省教育廳科學(xué)研究計劃項(xiàng)目（Q20141401）。

作者簡介

崔娜娜（1988-），女，安徽蚌埠人，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。*通訊作者，教授，博士，從事親水膠體方面的研究。

收稿日期20150525

微生物胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是一類天然大分子聚合物，由一些真菌、細(xì)菌和酵母代謝產(chǎn)生[1]，可作為增稠劑、乳化劑、保濕劑、結(jié)構(gòu)改良劑和膠凝劑等，在食品、制藥、化妝品等技術(shù)領(lǐng)域廣泛使用[2]。近年來，乳化功能的微生物多糖成為研究熱點(diǎn)，多糖類乳化劑乳化性質(zhì)穩(wěn)定，不易受溫度和pH的影響，可生物降解，同時能被基因工程、生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)進(jìn)行修飾改造，因此具有良好的應(yīng)用前景[3]。

克雷伯氏菌（Kleibsiella sp.）是一種能夠產(chǎn)胞外多糖的革蘭氏陰性桿菌，在自然界中廣泛分布，主要存在于動物和人的呼吸道及腸道中[4]。目前，關(guān)于克雷伯氏菌胞外多糖乳化功能研究較少。Mandal等[5]發(fā)現(xiàn)Klebsiella sp. PB12胞外多糖對甲苯、正十六烷、橄欖油和煤油的乳化能力分別為666%、65%、63.3%、50%。Kim等[6]研究發(fā)現(xiàn)Kleibsiella oxytoca BSF1胞外多糖具有較好的乳化性，在pH 3.5～10.0可有效乳化，能在10 min內(nèi)形成穩(wěn)定的乳液，并在30 ℃、48 h內(nèi)維持體系穩(wěn)定，不發(fā)生乳析。

菲利普斯親水膠體研究中心從活性污泥中篩選分離出一株產(chǎn)新型胞外多糖的菌株Kleibsiella sp. PHRC1.001，多糖產(chǎn)量較高，乳化性好，具有較高的研究價值。筆者主要優(yōu)化了菌株產(chǎn)多糖的培養(yǎng)基組分，并初步評價了該多糖乳化性質(zhì)，大大提高了多糖產(chǎn)量，明確了多糖在乳液制備中的乳化功能，同時為深入研究PHRC1.001多糖的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1原料

1.1.1

菌種。克雷伯氏菌（Kleibsiella sp.）PHRC1.001，由菲利普斯親水膠體研究中心從活性污泥中自主篩選得到，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（中國，武漢），保藏編號為CCTCC NO：M 2014427。

1.1.2

培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母膏5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，KCl 5 g/L，蛋白胨7 g/L，pH 7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40 g/L，CaCl2 0.5 g/L，酵母膏2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，KH2PO4·7H2O 5 g/L，pH 7.0。

1.1.3

主要試劑。中鏈甘油三酸酯（MCT）為食品級，購于馬來西亞KLK OLEO公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器設(shè)備

PTMR 2100高速剪切乳化機(jī)，瑞士Kinematica公司；M110L高壓納米均質(zhì)機(jī)，美國Microfluidics公司；Mastersizer 2000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；TU1990型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；TGL20M臺式高速冷凍離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；EL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZF型真空干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1

培養(yǎng)方法。種子培養(yǎng)：取菌株菌種2環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、220 r/min的條件下培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：以0.5%（V/V）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、220 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h。

1.3.2

單因素試驗(yàn)。采用單因素試驗(yàn)方法，以氮源、碳源、磷酸鹽緩沖體系、無機(jī)鹽作為發(fā)酵培養(yǎng)基的影響因素，每一步試驗(yàn)都建立在前一步的基礎(chǔ)上，考察各因素對微生物胞外多糖粗產(chǎn)量的影響。

1.3.3

發(fā)酵罐試驗(yàn)。采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，在7 L發(fā)酵罐內(nèi)，裝液量4 L，攪拌速度300 r/min，通氣量4×10-3m3/min，溫度30 ℃，按2.5%（V/V）接種量接種后，間隔適當(dāng)時間取樣，測定pH、微生物細(xì)胞干重（Dry cell weight，DCW）、微生物多糖粗產(chǎn)量和溶解氧氣量，觀察發(fā)酵情況。

1.3.4

微生物胞外多糖粗產(chǎn)量的測定。取40 ml發(fā)酵液，80 ℃水浴30 min滅活菌體，10 000 r/min離心20 min除去菌體；上清液加入3倍體積的乙醇，沉淀析出胞外多糖，40 ℃真空干燥至恒重，稱重。

1.3.5

微生物細(xì)胞干重的測定。取適量的發(fā)酵液，經(jīng)10 000 r/min下離心20 min后，用蒸餾水洗滌沉淀并離心，重復(fù)3次后，所得細(xì)胞復(fù)溶于蒸餾水中配成不同濃度菌懸液，在600 nm、0.5 cm光程下測定菌懸液OD值（控制OD值在0.2～08），同時對應(yīng)取50 ml菌懸液于鋁盒中，在105 ℃下恒溫存放過夜后恒重稱重，得到細(xì)胞干重（dry cell weight，DCW，g/L）。以菌懸液OD值和細(xì)胞干重作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

取適量發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，以離心后的發(fā)酵上清液作空白參照，重復(fù)上述方法測定稀釋后發(fā)酵液的OD值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到細(xì)胞干重。

1.3.6

乳液的制備。固定乳液中各組分：油相MCT 20%（W/W）；防腐劑NaN3 0.002%（W/W）；微生物胞外多糖1.0%（W/W）。配制1%微生物多糖溶液，充分混勻后，加入MCT，在26 000 r/min下用高速剪切乳化機(jī)冰浴預(yù)乳化3 min，再用高壓納米均質(zhì)機(jī)于75 MPa下均質(zhì)3個循環(huán)。

1.3.7

乳液粒徑分布的測定。將乳液輕輕振蕩混勻，取適量加入水中分散，用Mastersizer 2000型激光粒度儀測定乳液顆粒的大小及分布，每個樣品重復(fù)測量3次。

1.3.8

乳液微觀結(jié)構(gòu)的觀察。熒光顯微鏡觀察：將40 μl 0.01%（W/V）尼羅紅染液加入到5 ml新鮮乳液中，避光輕輕混勻，取適量滴于載玻片上，激發(fā)波長為488 nm，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。光學(xué)顯微鏡觀察：將乳液輕輕振蕩混勻，取適量滴于載玻片上，在顯微鏡下觀察，用丹東百特型顆粒成像系統(tǒng)拍照。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1

碳源對Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖產(chǎn)量的影響。

分別以乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉為碳源，測定Klebsiella sp.PHRC1.001的胞外多糖產(chǎn)量，結(jié)果見圖2。以蔗糖為碳源時，胞外多糖粗產(chǎn)量最高，乳糖次之，葡萄糖最低。綜合經(jīng)濟(jì)因素，選擇蔗糖為最佳碳源，產(chǎn)量為10.02 g/L。Li等[7]優(yōu)化Klebsiella sp.H207產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基組分時也發(fā)現(xiàn)蔗糖是最佳碳源。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

2.1.2

蔗糖濃度對Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖產(chǎn)量的影響。由圖3可知，在蔗糖濃度較低時，菌體代謝產(chǎn)糖活動較緩慢，隨著蔗糖濃度的增大，產(chǎn)糖量增加，但在40 g/L時達(dá)到最大，而隨著蔗糖濃度的繼續(xù)增大，可能會抑制菌體生長和多糖積累，故確定蔗糖濃度為40 g/L。

2.1.3

氮源對Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖產(chǎn)量的影響。由圖4可知，菌體對無機(jī)氮源的利用優(yōu)于有機(jī)氮源，在無機(jī)氮源中，以KNO3為氮源時多糖產(chǎn)量最高，故確定KNO3為最佳氮源。Morin[8]指出鉀離子可加速糖酵解過程，從而促進(jìn)多糖的合成代謝。

2.1.4

硝酸鉀濃度對Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖產(chǎn)量的影響。從圖5可以看出，隨著KNO3濃度增大，胞外多糖粗產(chǎn)量呈先增大后減小的趨勢?？赡艿脑蚴?，KNO3作為一種生理堿性鹽，可中和發(fā)酵過程產(chǎn)生的酸，維持體系pH處于合理范圍，利于菌體生長和產(chǎn)糖[9]。隨著KNO3濃度增大到2 g/L時，產(chǎn)量達(dá)到最大為13.6 g/L，在更高KNO3濃度下體系pH過高而抑制菌體生長，因此選取KNO3濃度為2 g/L。

2.1.5

磷酸鹽對Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖產(chǎn)量的影響。在微生物發(fā)酵過程中磷酸鹽通常發(fā)揮pH調(diào)節(jié)作用，而磷元素也對能量、核酸、糖類、脂類的代謝有重要影響。由圖6可知，較低濃度下，3種磷酸鹽濃度升高對產(chǎn)糖均有促進(jìn)作用，而Na2HPO4和NaH2PO4Na2HPO4對產(chǎn)糖的促進(jìn)作用不及NaH2PO4，同時過高磷含量可能會抑制代謝系統(tǒng)中某些酶的活性和合成，最終抑制多糖積累。故選取NaH2PO4作為磷酸鹽，最優(yōu)濃度為3.5 g/L。

2.1.6

無機(jī)鹽對Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖產(chǎn)量的影響。

從圖7可以看出，鈣離子的存在對產(chǎn)糖沒有顯著影響，CaCl2 0.8 g/L時多糖產(chǎn)量相對較高。從圖8可以看出，鎂離子對產(chǎn)糖具有明顯的促進(jìn)作用，這是由于鎂離子是微生物代謝過程中很多重要酶的激活劑，能夠促進(jìn)核酸合成和糖代謝。由此，確定CaCl2和MgSO4·7H2O的適宜濃度分別為0.8 g/L和7 g/L。

2.2 正交試驗(yàn)

采用L18（35）正交表對蔗糖、KNO3、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4·7H2O濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1。由表1可知，5個因素對多糖粗產(chǎn)量的影響程度不同，依次是MgSO4·7H2O、CaCl2、蔗糖、KNO3、NaH2PO4，方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MgSO4·7H2O的影響顯著，最佳組合是40 g/L蔗糖、2.5 g/L KNO3、3.5 g/L NaH2PO4、0.8 g/L CaCl2、9.0 g/L MgSO4·7H2O。

利用此組合，經(jīng)Klebsiella sp.PHRC1.001發(fā)酵72 h進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖粗產(chǎn)量達(dá)到20.54 g/L，說明正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果較好。

2.3Klebsiella sp.PHRC1.001發(fā)酵曲線

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，監(jiān)測發(fā)酵過程中pH、細(xì)胞干重、多糖產(chǎn)量和氧氣溶解量的變化情況，結(jié)果見圖9。由

圖9可知，在0～6 h內(nèi)，氧氣溶解量驟減，pH變化不大，生物量緩慢增加，菌體進(jìn)行自身的生長，多糖積累未開始，從6 h開始，糖的合成開始活躍，在約48 h處，多糖積累達(dá)到最大，從

60 h開始，多糖積累開始下降。發(fā)酵過程中粗多糖產(chǎn)量最高達(dá)21 g/L左右。

2.4PHRC1.001胞外多糖的乳化性質(zhì)

2.4.1

PHRC1.001胞外多糖的乳化活性。用PHRC1.001多糖為乳化劑，MCT為油相，制備出新鮮乳液。由圖10A可知，新鮮乳液的顆粒粒徑主要集中在7 μm左右，少部分在1.5 μm左右，平均粒徑為（4.99±0.01）μm，結(jié)合圖10B尼羅紅特異性染色乳液油相在熒光顯微鏡下的顆粒圖像，發(fā)現(xiàn)顆粒大小均一，說明1%多糖對MCT具有較好的乳化活性。Yao等[10]分別以傳統(tǒng)阿拉伯膠（GA）和2種改性阿拉伯膠（EM2，EM10）為乳化劑，多糖濃度1%時，3種新鮮乳液粒徑主要集中在10 μm左右，且分布不均一[11]。因而，在1%濃度下，PHRC1.001多糖乳化活性高于GA、EM2、EM10。

2.4.2

PHRC1.001胞外多糖的乳液物理穩(wěn)定性。乳液物理穩(wěn)定性是評價乳化劑乳化功能的重要指標(biāo)。將制備好的乳液放置在高溫（60 ℃）下分別貯存3 d（相當(dāng)于常溫放置半年），5和7 d（相當(dāng)于常溫放置一年），乳液顆粒尺寸分布的變化見圖11。由圖11A可以看出，乳液顆粒平均粒徑變化不大。由圖11B可以看出，乳液顆粒在貯存3 d后并沒有明顯變化，到7 d才開始出現(xiàn)輕微的聚集傾向，由此說明此乳液具有較好的長期物理穩(wěn)定性。Kim等[6]報道的Kleibsiella oxytoca BSF1胞外多糖也具有較好的乳化穩(wěn)定性，能在10 min內(nèi)形成穩(wěn)定的乳液，并在30 ℃、48 h內(nèi)維持體系穩(wěn)定而不發(fā)生乳析現(xiàn)象。

3結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了Klebsiella sp.PHRC1.001的產(chǎn)糖培養(yǎng)基組成，在此培養(yǎng)基基礎(chǔ)上產(chǎn)糖量達(dá)到20.54 g/L，約是初始培養(yǎng)基產(chǎn)糖量的2倍。通過發(fā)酵罐試驗(yàn)初步監(jiān)測了該菌產(chǎn)糖過程中pH、細(xì)胞干重、多糖產(chǎn)量和氧氣溶解量的變化，最優(yōu)培養(yǎng)基糖產(chǎn)量為21 g/L。乳化試驗(yàn)表明，PHRC1.001胞外多糖具有較好的乳化活性，其乳液長期物理穩(wěn)定性良好。因而，Klebsiella sp.PHRC1.001為一株高產(chǎn)胞外多糖菌株，且該多糖具有良好的乳化活性，工業(yè)應(yīng)用前景良好。

4討論

產(chǎn)量是工業(yè)發(fā)酵過程的重要指標(biāo)，很多學(xué)者對Klebsiella sp.胞外多糖產(chǎn)量進(jìn)行了報道，其中，Li等[7]發(fā)現(xiàn)具有絮凝和吸附重金屬功能的Klebsiella sp.H207胞外多糖最高產(chǎn)量為15.05 g/L，Nie等[11]發(fā)現(xiàn)具有絮凝功能的Klebsiella pneumoniae NY1胞外多糖產(chǎn)量最高達(dá)14.9 g/L，此外，具有乳化活性的Klebsiella sp.PB12胞外多糖產(chǎn)量僅為2 g/L[8]。因此，該

圖11高溫加速試驗(yàn)中不同儲藏時間下PHRC1.001多糖O/W乳液平均粒徑D4，3（A）及光學(xué)顯微鏡形態(tài)（B）

研究發(fā)現(xiàn)的Klebsiella sp.PHRC1.001具有較高的胞外多糖合成能力，工業(yè)化前景良好。

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