李峰等

摘要：目的 觀察補陽還五精簡方對局灶性腦缺血大鼠腦組織APJ蛋白和基因表達的影響，并探討其作用機制。方法 采用大腦中動脈線栓法建立大鼠局灶性腦缺血模型，實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組、補陽還五湯組和補陽還五精簡方組，各給藥組給予相應藥物灌胃。分別于給藥第3、7日Western blot、RT-PCR檢測各組大鼠腦組織APJ蛋白和基因表達。結果 補陽還五精簡方組和補陽還五湯組各時間點APJ蛋白和基因表達均高于模型組和假手術組（P<0.05），補陽還五精簡方組與補陽還五湯組各時間點APJ蛋白表達無明顯差異，但補陽還五精簡方組APJ基因表達高于補陽還五湯組（P<0.05）。結論 補陽還五精簡方可通過促進缺血后腦組織APJ的表達發(fā)揮對大鼠腦組織的神經(jīng)保護和修復作用。

關鍵詞：補陽還五精簡方；局灶性腦缺血；APJ蛋白；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.014

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0048-04

Effects of Simplified Recipe of Buyang Huanwu Decoction on Expression of APJ in Brain of Focal Cerebral Ischemia Rats LI Feng1， WANG Yu-hong2， SHE Yan1， YI Jian3， XIA Xiang-yi1， TAN Hu1， SHAO Le1， CAI Guang-xian3 （1.Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2.Key Lab Breeding Base of Hunan Chinese Traditional Medicine Powder and Innovation Drugs Constructed by Provincial Government， Chansha 410208， China；3.Key Lab of Ministry of Education of Internal Medicine Major Diseases Prevention and Achievements Transformation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract：Objective To observe the effects of simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction on expression of APJ in the brain of local cerebral ischemia rats；To discuss its mechanism of action. Methods Focal cerebral ischemia rat models were established by middle cerebral arterial occlusion. The adult rats were randomly divided into sham-operation group， model group， Buyang Huanwu Decoction group and simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group. Administration groups were given relevant medicine for gavage. The expressions of APJ protein and APJ mRNA at different time points were detected by Western blot and RT-PCR. Results Compared with model group and sham-operation group， the expression of APJ protein and APJ mRNA at different time points in Buyang Huanwu Decoction group and simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group significantly increased （P<0.05）. The expression of APJ protein at different time points showed no difference between simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group and Buyang Huanwu

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃（012CB723503）；湖南省高校創(chuàng)新平臺開發(fā)基金項目（09k056）；湖南省科技廳項目（2013FJ4211）

通訊作者：蔡光先，E-mail：Cwlwj2008@126.com

Decoction group；while the expression of APJ mRNA in simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group was higher than Buyang Huanwu Decoction group （P<0.05）. Conclusion Simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction plays a role in neural protection and restoration by promoting the expression of APJ in the brain of focal cerebral ischemia rats.

Key words：simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction；focal cerebral ischemia；APJ；rats

腦缺血可造成大量腦組織損傷，其所致神經(jīng)功能缺損根本原因是神經(jīng)細胞損傷。腦缺血時會啟動周圍組織的修復和再生反應，誘導神經(jīng)元再生。APJ蛋白是內(nèi)源性神經(jīng)肽Apelin的受體，Apelin/APJ能促進神經(jīng)細胞增殖，可對抗腦缺血后的氧化應激損傷，保護腦組織[1]。補陽還五湯源自《醫(yī)林改錯》，對治療缺血性中風及其后遺癥療效確切，對缺血性腦中風有顯著療效，補陽還五精簡方取補陽還五湯之方義，基于益氣祛瘀生新法精簡方藥而成。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，精簡方有減小腦缺血后腦梗死面積及減輕腦水腫的作用[2]。本實驗采用大腦中動脈線栓法復制大鼠局灶性腦缺血模型，探討補陽還五精簡方對局灶性腦缺血后APJ表達的影響，以期為治療缺血性腦中風臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級健康成年雄性SD大鼠，體質量250～300 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物

補陽還五湯（黃芪120 g，赤芍 4.5 g，川芎3 g，當歸6 g，地龍3 g，紅花 3 g，桃仁3 g）和補陽還五精簡方（黃芪30 g，川芎9 g，地龍6 g），飲片由湖南省中醫(yī)藥研究院提供，符合2010年版《中華人民共和國藥典》相關標準。補陽還五湯按傳統(tǒng)水煎法濃縮干燥后制備成干浸膏。

1.3 主要試劑與儀器

水合氯醛，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20111114；兔抗大鼠APJ多克隆抗體，Abcam公司，批號AB84296；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG， 上海碧云天生物技術有限公司，批號A0208；BCA蛋白定量試劑盒，Thermo公司，批號PICPI23223；PCR試劑盒、反轉錄試劑盒，Thermo公司；PCR引物由上海捷瑞合成；RnaseⅠ，F(xiàn)ermentas公司。Image-Pro Express圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司），電泳儀（BIO-RAD 公司，型號mini protean 3 cell），電轉儀（PS-9，大連競邁科技有限公司），芬蘭雷勃酶標儀（型號MK3）， FN101-2型鼓風干燥箱（長沙儀器儀表廠）。

2 實驗方法

2.1 造模

采用大腦中動脈線栓法復制大鼠局灶性腦缺血模型[3]。假手術組分離左側頸總動脈后不做切口即縫合。大鼠清醒2 h后參照Bederson[4]的5分制法進行神經(jīng)功能評分，分值1～3 分者入組。分值越高，神經(jīng)功能缺損越嚴重。剔除標準：分值<1分；蛛網(wǎng)膜下腔出血；HE染色無腦缺血病理改變；未到時間點死亡。因大鼠死亡等致樣本量不足時隨機替補。

2.2 分組及給藥

實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組、補陽還五湯組（補陽組）和補陽還五精簡方組（精簡組），各組每個時間點10只。補陽組術后第1日起予補陽還五湯（相當于干浸膏3.15 g/kg），每日1次；精簡組術后第1日起予補陽還五精簡方（相當于干浸膏2.41 g/kg）；假手術組和模型組予等量無菌蒸餾水。各組灌胃體積均為0.05 mL/kg。各組大鼠分別于給藥后第3、7日脫頸處死。

2.3 Western blot檢測腦組織APJ蛋白表達

大鼠水合氯醛麻醉后冰上斷頭取左側海馬、頂葉皮質放于液氮灌中備用。操作步驟：提取組織蛋白進行蛋白質定量后貯存于-80 ℃冰箱。制備PAGE膠后上樣，每孔上樣25 μg蛋白進行電泳，半干式轉膜，檢測膜上蛋白，膜封閉劑抗體孵育后顯色，分析圖像，進行數(shù)據(jù)處理。

2.4 RT-PCR檢測腦組織APJ基因表達

取材同“2.3”項。引物序列見表1。采用兩步法RT-PCR擴增相應片段。反轉錄合成：42 ℃、1 h， 70 ℃、5 min。PCR反應：94 ℃預變性3 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s，35個循環(huán)；于72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物于已加入溴乙錠2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)攝像分析。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 補陽還五精簡方對大鼠腦組織APJ蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，假手術組有低水平APJ蛋白表達，各實驗組大鼠缺血側海馬組織提取的蛋白均與兔抗大鼠APJ特異性結合，出現(xiàn)陽性條帶，大鼠腦缺血后第3日模型組APJ蛋白表達最高，第3、7日精簡組和補陽組較同時點模型組APJ蛋白表達升高（P<0.05）。精簡組和補陽組間比較無明顯差異。結果見圖1、圖2。

4.2 補陽還五精簡方對大鼠腦組織APJ基因表達的影響

假手術組APJ基因表達水平較低，腦缺血刺激后模型組第3、7日表達升高（P<0.05），補陽組表達高于模型組（P<0.05），精簡組APJ基因表達高于補陽組（P<0.05）。RT-PCR檢測結果顯示，目的基因與內(nèi)參基因溶解曲線集中，只有特異性單峰，表明沒有引物二聚體和非特異性擴增，擴增曲線為S型，平行性較好，基線平且無明顯上揚。結果見表2、圖3。

5 討論

APJ為血管緊張素Ⅱ1型受體相關蛋白，是有絲分裂原和內(nèi)源性神經(jīng)保護肽Apelin的受體[5]。Apelin/ APJ廣泛分布于全身組織，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有豐富的表達，在大腦皮質、海馬神經(jīng)元、下丘腦、腦室周圍結構的器官血管終板等處均有分布[6-7]，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要生理作用，可使缺血后腦組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達增高[8]，并能對抗腦缺血后引起的氧化應激損傷，使神經(jīng)細胞免受氧化應激損害，對海馬和大腦皮質神經(jīng)元具有保護作用。Apelin/APJ能促進多種細胞增殖、分化，也可促進腦缺血后的血管生成和神經(jīng)細胞增殖[9]。

補陽還五湯為益氣活血代表方劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯能明顯提高神經(jīng)細胞的增殖數(shù)量，增加神經(jīng)細胞遷出數(shù)和遷移距離，有效促進腦缺血后的神經(jīng)再生，保護神經(jīng)功能[10-11]。另有研究顯示，補陽還五湯能促進缺血性神經(jīng)干細胞的增殖和分化[12-13]。補陽還五精簡方基于益氣祛瘀生新法，秉承“瘀血不去，新血不生”的理念，重用原方中君藥黃芪，黃芪不僅大補元氣，且能行氣，利營衛(wèi)之氣，通營衛(wèi)之阻滯以活血；川芎行氣活血，氣行則血行，血行則瘀去脈通也，使氣血和順，“血行風自滅”；加地龍通經(jīng)活絡。諸藥合用，使氣足以推動血行，瘀去絡通。在抗腦缺血損傷方面功效顯著，能明顯改善大腦中動脈閉塞模型大鼠的神經(jīng)功能缺失癥狀，減輕腦水腫，減小梗死面積，有效抗氧化[14-15]。

本實驗應用Western blot和RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)大鼠局灶性腦缺血后腦組織中APJ蛋白和基因表達均上調(diào)，在缺血3 d即達高峰，7 d時仍有高表達。使用補陽還五精簡方和補陽還五湯干預后APJ蛋白和基因表達明顯升高，均高于模型組（P<0.05），精簡組APJ基因表達高于補陽組。這表明補陽還五精簡方對腦缺血模型大鼠腦組織的APJ有上調(diào)和促進作用，補陽還五精簡方可通過激活APJ受體實現(xiàn)腦保護作用，其效果類似甚至優(yōu)于原方。本實驗結果提示，補陽還五精簡方激活腦組織中內(nèi)源性APJ的表達是其發(fā)揮對腦缺血損傷保護作用的一個重要機制，而其下游的信號通路有待繼續(xù)探討和研究。

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（收稿日期：2015-01-26；編輯：華強）