李峰等

摘要：目的 觀察補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織APJ蛋白和基因表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 采用大腦中動(dòng)脈線栓法建立大鼠局灶性腦缺血模型，實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃。分別于給藥第3、7日Western blot、RT-PCR檢測(cè)各組大鼠腦組織APJ蛋白和基因表達(dá)。結(jié)果 補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組各時(shí)間點(diǎn)APJ蛋白和基因表達(dá)均高于模型組和假手術(shù)組（P<0.05），補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方組與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組各時(shí)間點(diǎn)APJ蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，但補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方組APJ基因表達(dá)高于補(bǔ)陽(yáng)還五湯組（P<0.05）。結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方可通過(guò)促進(jìn)缺血后腦組織APJ的表達(dá)發(fā)揮對(duì)大鼠腦組織的神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方；局灶性腦缺血；APJ蛋白；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）09-0048-04

Effects of Simplified Recipe of Buyang Huanwu Decoction on Expression of APJ in Brain of Focal Cerebral Ischemia Rats LI Feng1， WANG Yu-hong2， SHE Yan1， YI Jian3， XIA Xiang-yi1， TAN Hu1， SHAO Le1， CAI Guang-xian3 （1.Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2.Key Lab Breeding Base of Hunan Chinese Traditional Medicine Powder and Innovation Drugs Constructed by Provincial Government， Chansha 410208， China；3.Key Lab of Ministry of Education of Internal Medicine Major Diseases Prevention and Achievements Transformation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract：Objective To observe the effects of simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction on expression of APJ in the brain of local cerebral ischemia rats；To discuss its mechanism of action. Methods Focal cerebral ischemia rat models were established by middle cerebral arterial occlusion. The adult rats were randomly divided into sham-operation group， model group， Buyang Huanwu Decoction group and simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group. Administration groups were given relevant medicine for gavage. The expressions of APJ protein and APJ mRNA at different time points were detected by Western blot and RT-PCR. Results Compared with model group and sham-operation group， the expression of APJ protein and APJ mRNA at different time points in Buyang Huanwu Decoction group and simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group significantly increased （P<0.05）. The expression of APJ protein at different time points showed no difference between simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group and Buyang Huanwu

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（012CB723503）；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開發(fā)基金項(xiàng)目（09k056）；湖南省科技廳項(xiàng)目（2013FJ4211）

通訊作者：蔡光先，E-mail：Cwlwj2008@126.com

Decoction group；while the expression of APJ mRNA in simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group was higher than Buyang Huanwu Decoction group （P<0.05）. Conclusion Simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction plays a role in neural protection and restoration by promoting the expression of APJ in the brain of focal cerebral ischemia rats.

Key words：simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction；focal cerebral ischemia；APJ；rats

腦缺血可造成大量腦組織損傷，其所致神經(jīng)功能缺損根本原因是神經(jīng)細(xì)胞損傷。腦缺血時(shí)會(huì)啟動(dòng)周圍組織的修復(fù)和再生反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元再生。APJ蛋白是內(nèi)源性神經(jīng)肽Apelin的受體，Apelin/APJ能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖，可對(duì)抗腦缺血后的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)腦組織[1]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯源自《醫(yī)林改錯(cuò)》，對(duì)治療缺血性中風(fēng)及其后遺癥療效確切，對(duì)缺血性腦中風(fēng)有顯著療效，補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方取補(bǔ)陽(yáng)還五湯之方義，基于益氣祛瘀生新法精簡(jiǎn)方藥而成。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，精簡(jiǎn)方有減小腦缺血后腦梗死面積及減輕腦水腫的作用[2]。本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血模型，探討補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方對(duì)局灶性腦缺血后APJ表達(dá)的影響，以期為治療缺血性腦中風(fēng)臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物

補(bǔ)陽(yáng)還五湯（黃芪120 g，赤芍 4.5 g，川芎3 g，當(dāng)歸6 g，地龍3 g，紅花 3 g，桃仁3 g）和補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方（黃芪30 g，川芎9 g，地龍6 g），飲片由湖南省中醫(yī)藥研究院提供，符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯按傳統(tǒng)水煎法濃縮干燥后制備成干浸膏。

1.3 主要試劑與儀器

水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20111114；兔抗大鼠APJ多克隆抗體，Abcam公司，批號(hào)AB84296；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG， 上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)A0208；BCA蛋白定量試劑盒，Thermo公司，批號(hào)PICPI23223；PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo公司；PCR引物由上海捷瑞合成；RnaseⅠ，F(xiàn)ermentas公司。Image-Pro Express圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司），電泳儀（BIO-RAD 公司，型號(hào)mini protean 3 cell），電轉(zhuǎn)儀（PS-9，大連競(jìng)邁科技有限公司），芬蘭雷勃酶標(biāo)儀（型號(hào)MK3）， FN101-2型鼓風(fēng)干燥箱（長(zhǎng)沙儀器儀表廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

采用大腦中動(dòng)脈線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血模型[3]。假手術(shù)組分離左側(cè)頸總動(dòng)脈后不做切口即縫合。大鼠清醒2 h后參照Bederson[4]的5分制法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，分值1～3 分者入組。分值越高，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。剔除標(biāo)準(zhǔn)：分值<1分；蛛網(wǎng)膜下腔出血；HE染色無(wú)腦缺血病理改變；未到時(shí)間點(diǎn)死亡。因大鼠死亡等致樣本量不足時(shí)隨機(jī)替補(bǔ)。

2.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組（補(bǔ)陽(yáng)組）和補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方組（精簡(jiǎn)組），各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只。補(bǔ)陽(yáng)組術(shù)后第1日起予補(bǔ)陽(yáng)還五湯（相當(dāng)于干浸膏3.15 g/kg），每日1次；精簡(jiǎn)組術(shù)后第1日起予補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方（相當(dāng)于干浸膏2.41 g/kg）；假手術(shù)組和模型組予等量無(wú)菌蒸餾水。各組灌胃體積均為0.05 mL/kg。各組大鼠分別于給藥后第3、7日脫頸處死。

2.3 Western blot檢測(cè)腦組織APJ蛋白表達(dá)

大鼠水合氯醛麻醉后冰上斷頭取左側(cè)海馬、頂葉皮質(zhì)放于液氮灌中備用。操作步驟：提取組織蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱。制備PAGE膠后上樣，每孔上樣25 μg蛋白進(jìn)行電泳，半干式轉(zhuǎn)膜，檢測(cè)膜上蛋白，膜封閉劑抗體孵育后顯色，分析圖像，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.4 RT-PCR檢測(cè)腦組織APJ基因表達(dá)

取材同“2.3”項(xiàng)。引物序列見(jiàn)表1。采用兩步法RT-PCR擴(kuò)增相應(yīng)片段。反轉(zhuǎn)錄合成：42 ℃、1 h， 70 ℃、5 min。PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s，35個(gè)循環(huán)；于72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物于已加入溴乙錠2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用凝膠成像系統(tǒng)攝像分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方對(duì)大鼠腦組織APJ蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，假手術(shù)組有低水平APJ蛋白表達(dá)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠缺血側(cè)海馬組織提取的蛋白均與兔抗大鼠APJ特異性結(jié)合，出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，大鼠腦缺血后第3日模型組APJ蛋白表達(dá)最高，第3、7日精簡(jiǎn)組和補(bǔ)陽(yáng)組較同時(shí)點(diǎn)模型組APJ蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。精簡(jiǎn)組和補(bǔ)陽(yáng)組間比較無(wú)明顯差異。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

4.2 補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方對(duì)大鼠腦組織APJ基因表達(dá)的影響

假手術(shù)組APJ基因表達(dá)水平較低，腦缺血刺激后模型組第3、7日表達(dá)升高（P<0.05），補(bǔ)陽(yáng)組表達(dá)高于模型組（P<0.05），精簡(jiǎn)組APJ基因表達(dá)高于補(bǔ)陽(yáng)組（P<0.05）。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，目的基因與內(nèi)參基因溶解曲線集中，只有特異性單峰，表明沒(méi)有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線為S型，平行性較好，基線平且無(wú)明顯上揚(yáng)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

5 討論

APJ為血管緊張素Ⅱ1型受體相關(guān)蛋白，是有絲分裂原和內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)肽Apelin的受體[5]。Apelin/ APJ廣泛分布于全身組織，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有豐富的表達(dá)，在大腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元、下丘腦、腦室周圍結(jié)構(gòu)的器官血管終板等處均有分布[6-7]，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要生理作用，可使缺血后腦組織中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)增高[8]，并能對(duì)抗腦缺血后引起的氧化應(yīng)激損傷，使神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害，對(duì)海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。Apelin/APJ能促進(jìn)多種細(xì)胞增殖、分化，也可促進(jìn)腦缺血后的血管生成和神經(jīng)細(xì)胞增殖[9]。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯為益氣活血代表方劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能明顯提高神經(jīng)細(xì)胞的增殖數(shù)量，增加神經(jīng)細(xì)胞遷出數(shù)和遷移距離，有效促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)再生，保護(hù)神經(jīng)功能[10-11]。另有研究顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能促進(jìn)缺血性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化[12-13]。補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方基于益氣祛瘀生新法，秉承“瘀血不去，新血不生”的理念，重用原方中君藥黃芪，黃芪不僅大補(bǔ)元?dú)?，且能行氣，利營(yíng)衛(wèi)之氣，通營(yíng)衛(wèi)之阻滯以活血；川芎行氣活血，氣行則血行，血行則瘀去脈通也，使氣血和順，“血行風(fēng)自滅”；加地龍通經(jīng)活絡(luò)。諸藥合用，使氣足以推動(dòng)血行，瘀去絡(luò)通。在抗腦缺血損傷方面功效顯著，能明顯改善大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠的神經(jīng)功能缺失癥狀，減輕腦水腫，減小梗死面積，有效抗氧化[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western blot和RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)大鼠局灶性腦缺血后腦組織中APJ蛋白和基因表達(dá)均上調(diào)，在缺血3 d即達(dá)高峰，7 d時(shí)仍有高表達(dá)。使用補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方和補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后APJ蛋白和基因表達(dá)明顯升高，均高于模型組（P<0.05），精簡(jiǎn)組APJ基因表達(dá)高于補(bǔ)陽(yáng)組。這表明補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方對(duì)腦缺血模型大鼠腦組織的APJ有上調(diào)和促進(jìn)作用，補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方可通過(guò)激活A(yù)PJ受體實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用，其效果類似甚至優(yōu)于原方。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方激活腦組織中內(nèi)源性APJ的表達(dá)是其發(fā)揮對(duì)腦缺血損傷保護(hù)作用的一個(gè)重要機(jī)制，而其下游的信號(hào)通路有待繼續(xù)探討和研究。

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（收稿日期：2015-01-26；編輯：華強(qiáng)）