石浩　徐亞歐　梅寒　王海　劉紅麗　左斌　聶曉慶　胡衛(wèi)民

摘要：為了檢測(cè)米易雞ADSL基因第2、第9外顯子的單核苷酸多態(tài)性并分析該多態(tài)性與胸肌肌苷酸含量的關(guān)聯(lián)性，以四川省優(yōu)質(zhì)地方雞種米易雞為研究對(duì)象，采用高效液相色譜測(cè)定米易雞胸肌肌肉肌苷酸的含量，并運(yùn)用測(cè)序技術(shù)測(cè)定了ADSL基因第2、第9外顯子的單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果表明：ADSL基因在外顯子2（A3713G、C3797T），外顯子9（C10191T）處出現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)，變異引起相應(yīng)的氨基酸均為同義變異，第2外顯子A3713G位點(diǎn)的基因型為AA、GG、AG型；C3797T位點(diǎn)的基因型為CC、CT、TT型；第9外顯子的C10191T位點(diǎn)的基因型為CC、CT型。經(jīng)獨(dú)立性檢驗(yàn)，ADSL基因A3713G、C10191T位點(diǎn)變異處于Hardy—Weinberg平衡狀態(tài)；應(yīng)用最小二乘法對(duì)基因型與肌苷酸含量進(jìn)行分析，說(shuō)明ADSL第9外顯子C10191T SNP位點(diǎn)與IMP含量存在顯著相關(guān)性（P<0.05），CT型個(gè)體的胸肌肌苷酸含量高于cc型個(gè)體，初步推測(cè)米易雞中ADSL基因第9外顯子C10151T SNP位點(diǎn)CT型為優(yōu)勢(shì)基因型。

關(guān)鍵詞：米易雞；肉質(zhì)風(fēng)味；育種改育；肌苷酸（IMP）；ADSL基因；SNP；外顯子2；外顯子9；多態(tài)性；相關(guān)性

中圖分類號(hào)：S831.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）05-0029-03

目前國(guó)內(nèi)外的大量研究表明，雞肉內(nèi)的肌苷酸含量在很大程度上影響其肉質(zhì)風(fēng)味及性狀，但是肌苷酸含量又受多種因素的影響，常規(guī)選育進(jìn)展較慢，因此利用與肌苷酸含量相關(guān)的候選基因，應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇加快遺傳研究進(jìn)展是當(dāng)前較為有效的手段，可以在分子水平對(duì)肉雞的肉質(zhì)風(fēng)味進(jìn)行育種改良。肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）是衡量肌肉肉質(zhì)風(fēng)味性狀的重要指標(biāo)之一，在體內(nèi)肌苷酸從頭合成過(guò)程涉及10種關(guān)鍵酶，這10種關(guān)鍵酶由5個(gè)基因編碼，即（；PAT基因、AIRC基因、ADSL基因、GARS-AIRS-ART基因、PURH基因。其中ADSL基因是嘌呤核苷酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，催化2個(gè)重要反應(yīng)：（1）由氨基咪唑琥珀基氨甲酰核苷酸（sACIAR）生成氨基咪唑氨甲酰核苷酸（AICAR）的反應(yīng)；（2）由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸單磷酸的反應(yīng)，這2個(gè)反應(yīng)對(duì)于最終的肌肉肌苷酸含量具有重要的影響。Aimi等克隆了雞ADSL基因的cDNA全長(zhǎng)序列并將其定位于1號(hào)染色體上，長(zhǎng)15 593 bp，包含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)1520bp的mRNA（NM-205529.1），翻譯成含有459個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列（NP-990860.1）。季從亮以ADSL基因作為IMP含量的候選基因，對(duì)5'側(cè)翼序列、所有外顯子和部分內(nèi)含子單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到5個(gè)SNP位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)部分突變位點(diǎn)與胸肌肌苷酸含量相關(guān)。

“米易雞”是四川省的優(yōu)良地方雞種之一，其體型較大，具有早期生長(zhǎng)速度快、肉用性能較好、性情溫順、便于飼養(yǎng)管理、肉質(zhì)風(fēng)味佳等優(yōu)點(diǎn)。為研究米易雞肉質(zhì)風(fēng)味好的特點(diǎn)，本研究擬采用測(cè)序技術(shù)檢測(cè)米易雞ADSL基因外顯子9的單核苷酸多態(tài)性，并與米易雞肌苷酸含量問(wèn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，以探討在米易雞內(nèi)ADSL基因第2、第9外顯子的多態(tài)性與肌苷酸含量問(wèn)的關(guān)系，為米易雞的優(yōu)良肉質(zhì)風(fēng)味選育提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

于四川省攀枝花市米易雞專業(yè)養(yǎng)殖戶購(gòu)入脫溫雞苗64羽（公母各半），全階段由專人管理，單籠飼養(yǎng)，管理和營(yíng)養(yǎng)水平一致，自由飲食。分別在81、119、153、210d進(jìn)行屠宰性能測(cè)定，真空采血管（EDTA·K2抗凝，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)）翅下靜脈采血，每羽采血約2mL，置于-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。屠宰時(shí)同時(shí)采集胸肌和腿肌，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1血液中DNA提取和檢測(cè)

用AXYGEN血液基因組（Axygen公司生產(chǎn)）DNA提取試劑盒提取血樣中的基因組DNA，經(jīng)PCR儀（型號(hào)：AG22331 Hamburg，德國(guó)Eppendoff公司生產(chǎn)）擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳（電泳儀型號(hào)：DYCP-31DN型，北京六一儀器廠生產(chǎn)）和紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)：Cary 50，美國(guó)Varian公司生產(chǎn)）檢測(cè)純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)ADSL基因的研究結(jié)果及ADSL基因信息（GenBank登錄號(hào)：AY665559），用Primer5.0設(shè)計(jì)特異性引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增該基因含有SNP位點(diǎn)的第2、第9外顯子特異性序列，引物序列及產(chǎn)物片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

PCR擴(kuò)增體系（25uL）為：9.5uL超純水（超純水系統(tǒng)型號(hào)：艾柯AKHL—III一24，成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠生產(chǎn)）、各1μL上下游引物（10μL，濃度10umol/L，上海英駿生物技術(shù)有限公司合成）、1uL DNA模板（100ug/uL）、12.5uLMaster Mix[天根生化科技（北京）有限公司]。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃/57℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的亮度和純度。根據(jù)瓊脂糖凝皎電泳檢測(cè)結(jié)果，將所有PCR產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向序列測(cè)定。

1.2.3肌苷酸含量的測(cè)定參照陳國(guó)宏等的高效液相色譜法”叫測(cè)定肌肉肌苷酸含量。

2.結(jié)果與分析

2.1雞基因組DNA抽提結(jié)果

從試驗(yàn)雞群血液中提取基因組DNA，使用1.5%瓊脂糖凝皎電泳檢測(cè)，與相同上樣量的DL2000 marker[天根生化科技（北京）有限公司]比較。圖1結(jié)果顯示，條帶清晰明亮，大約40kb]，且無(wú)掃尾現(xiàn)象，濃度較均勻，表明所提取DNA質(zhì)量較好，含雜質(zhì)較少，完全符合PCR試驗(yàn)要求。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)ADSL基因第2、第9外顯子擴(kuò)增片段進(jìn)行檢測(cè)，由圖2、圖3可見(jiàn)，在279、255 bp處分別呈現(xiàn)出1條特異性的條帶，表明引物特異性較好。

2.3測(cè)序結(jié)果

將PCR擴(kuò)增的特異片段進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)測(cè)序反應(yīng)檢測(cè)到米易雞ADSL基因第2外顯子存在A3713G、C3797T變異，第9外顯子存在C10191T變異，但都未引起相應(yīng)氨基酸的變異。由圖4、圖5、圖6的測(cè)序結(jié)果可知，米易雞ADSL基因第2外顯子A3713G位點(diǎn)的基因型為AA、GG、AG型；C3797T位點(diǎn)的基因型為CC、CT、TT型；第9外顯子的C10191T位點(diǎn)的基因型為CC、CT型。

2.4 ADSL基因第2、第9外顯子突變位點(diǎn)的基因和基因型頻率分析

統(tǒng)計(jì)ADSL基因第2、第9外顯子的變異在米易雞中的基因頻率、基因型頻率及檢驗(yàn)分析結(jié)果。由表2結(jié)果可見(jiàn)：米易雞中ADSL基因第2外顯子A3713G、第9外顯子C10191T的SNP位點(diǎn)在試驗(yàn)群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)2.5 ADSL基因第2、第9外顯子的SNP位點(diǎn)的基因型與胸肌IMP含量的相關(guān)性分析

對(duì)ADSL基因第2外顯子A3713G、C3797T和第9外顯子C10191T SNP位點(diǎn)的基因型和IMP含量進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。表3結(jié)果表明：ADSL基因第2外顯子中的各基因型與胸肌IMP含量差異都不顯著；ADSL基因外顯子9（C10191T）中CT雜合子個(gè)體胸肌的IMP含量最高，顯著高于cc型個(gè)體胸肌的IMP含量（P

3.討論與結(jié)論

3.1 ADSL基因的多態(tài)位點(diǎn)

季從亮掃描了ADSL基因含5'側(cè)翼序列在內(nèi)的所有的13個(gè)外顯子以及部分內(nèi)含子序列，并進(jìn)行了SNP位點(diǎn)檢測(cè)，結(jié)果共檢測(cè)出5個(gè)SNP位點(diǎn)，其中2個(gè)位于外顯子區(qū)域，3個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)域，結(jié)果僅有外顯子9處存在C9839A突變?yōu)榉峭x突變，導(dǎo)致了甘氨酰胺核苷酸合成酶氨基酸序列的第173處發(fā)生氨基酸的變異：脯氨酸（Pro）變異為蘇氨酸（Thr）。張學(xué)余等對(duì)隱性白羽雞、絲羽烏骨雞、蕭山雞、白耳雞、藏雞ADSL基因的外顯子9的研究發(fā)現(xiàn)了相同突變位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)可引起氨基酸變異。而本研究通過(guò)對(duì)米易雞的ADSL基因外顯子9的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在C10191T處發(fā)生突變，翻譯氨基酸序列后比對(duì)發(fā)現(xiàn)第286處的亮氨酸（Leu）發(fā)生變異，表明該突變?yōu)橥x突變。龔琳琳對(duì)皋雞、安卡雞、文昌雞、隱性白羽肉雞4個(gè)群體的ADSL基因外顯子9的檢測(cè)中也得到了同樣的結(jié)果。

束婧婷等發(fā)現(xiàn)，在ADSL基因外顯子2的A3713G、C3484T處發(fā)生了突變，但2個(gè)突變位點(diǎn)都沒(méi)有引起相應(yīng)的氨基酸發(fā)生改變。本研究也是在外顯子2的A3713G、C3797T處檢測(cè)到突變位點(diǎn)，分別翻譯甘氨酰胺核苷酸合成酶氨基酸序列后比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在第59處的亮氨酸（Leu）和第87處的絲氨酸（ser）都未發(fā)生變化，表明2種突變都是同義突變，都沒(méi)有引起相應(yīng)的氨基酸變異。

3.2ADSL基因第2、第9外顯子SNP位點(diǎn)的基因型和胸肌IMP含量的相關(guān)性

張學(xué)余等在ADSL基因外顯子9的C9839A處發(fā)現(xiàn)突變，通過(guò)對(duì)5個(gè)雞種該突變位點(diǎn)的基因型與肌苷酸含量的相關(guān)性分析表明：在5個(gè)雞群體中的基因型分布差異顯著，除了蕭山雞與絲羽烏骨雞之間基因型分布差異不顯著之外，其余各雞種兩兩之間均存在顯著或極顯著的基因型分布差異（P<0.05或P<0.01），初步推測(cè)該位點(diǎn)的基因型頻率分布與品種有關(guān)，但進(jìn)一步方差分析并沒(méi)有顯示出該位點(diǎn)的多態(tài)性與胸肌的IMP含量之間存在關(guān)聯(lián)。束靖婷等通過(guò)對(duì)ADSL外顯子2的C3484T突變位點(diǎn)與肌苷酸含量的相關(guān)性分析，表明ADSL基因中TT型個(gè)體胸肌IMP含量較cc型高出O.880mg/g，達(dá)到極顯著水平（P<0.01），TT型個(gè)體IMP含量較CT型高出0.758mg/g，達(dá)到顯著水平（P<..05），CT型個(gè)體IMP含量稍高于CC型，但二者之間差異不顯著。

而本研究對(duì)米易雞ADSL基因第2、第9外顯子SNP位點(diǎn)研究結(jié)果表明，雖然3個(gè)突變位點(diǎn)都沒(méi)有引起相應(yīng)的氨基酸變異，但其中外顯子9的C10191T突變位點(diǎn)中的CT雜合子個(gè)體胸肌的IMP含量最高且都高于其他基因型個(gè)體胸肌的IMP含量，達(dá)到顯著水平（P<0.05），說(shuō)明該位點(diǎn)的變異對(duì)胸肌的IMP含量變化有較顯著的影響。米易雞中ADSL基因第9外顯子C/T（C10191T）sNP位點(diǎn)CT型為優(yōu)勢(shì)基因型，雖然未檢測(cè)到TT型，但是可以推測(cè)TT型是C基因突變?yōu)門的結(jié)果。

由此可見(jiàn)，ADSL基因外顯子9處的基因突變對(duì)胸肌IMP含量的影響在不同的雞種之間的表現(xiàn)不完全一致。雞ADSL基因不同外顯子的不同變異，在不同雞種中的變異不盡相同，且與雞胸肌IMP含量之間的調(diào)控模式關(guān)系也還不清楚；因此，今后有必要選擇具有代表性的雞種，大大增加測(cè)定樣本，對(duì)ADSL基因的全部變異位點(diǎn)進(jìn)行掃描，方可弄清ADSL基因?qū)﹄u胸肌IMP含量之間的調(diào)控模式。