賀強　季瀏

摘 要：觀察4周游泳訓練對db/db小鼠內臟脂肪組織巨噬細胞介導的慢性炎癥的影響，探討運動抗炎的作用機制。將db/db小鼠和同窩野生小鼠各16只隨機分為相應的對照組（WC、DC）和運動組（WE，DE）。小鼠進行4周每天1 h、每周5 d的游泳運動。各組小鼠取附睪脂肪分離附睪脂肪組織基質血管部分細胞（SVCs），流式細胞術檢測SVCs F4/80+CD11b+CD11c+和F4/80+CD11b+ CD11c-巨噬細胞；RT-PCR檢測炎癥相關基因表達。結果顯示db/db小鼠體質量、附睪脂肪含量、空腹血糖（FBG）、SVCs數(shù)量、SVCs中 F4/80+CD11b+巨噬細胞數(shù)量及其百分數(shù)、F4/80+CD11b+CD11c+巨噬細胞數(shù)量及其百分數(shù)均顯著升高（P﹤0.05）；附睪脂肪TNF-α、IL-6、iNOS、F4/80、CD11c mRNA表達顯著升高（P﹤0.05）；IL-10、CD206、Arg1 mRNA表達顯著下降（P﹤0.05）。4周游泳訓練顯著提高db/db 小鼠體質量（P﹤0.05）；附睪脂肪含量無顯著差異；FBG、SVCs數(shù)量，SVCs中F4/80+CD11b+巨噬細胞數(shù)量及其百分數(shù)，F(xiàn)4/80+CD11b+巨噬細胞中CD11c+巨噬細胞數(shù)量及其百分數(shù)顯著下降（P﹤0.05）。附睪脂肪TNF-α、IL-6、iNOS、F4/80、CD11c mRNA表達顯著下降（P﹤0.05）；IL-10、CD206、Arg1 mRNA表達顯著升高（P﹤0.05）。4周游泳訓練對野生型小鼠各項參數(shù)變化無顯著差異。結果說明：1） db/db小鼠附睪脂肪M1型促炎性巨噬細胞增加，炎癥因子基因表達提高；2）4周游泳訓練有效降低db/db小鼠附睪脂肪巨噬細胞浸潤，降低M1型巨噬細胞，提高M2型巨噬細胞表型，降低脂肪組織炎癥水平。

關 鍵 詞：運動生物化學；2型糖尿??；巨噬細胞；慢性炎癥；游泳訓練；小鼠

中圖分類號：G804.7 文獻標志碼：A 文章編號：1006-7116（2015）05-0133-06

Abstract： The authors observed the effects of 4-week swimming training on visceral fat tissue chronic inflammation mediated by macrophages in db/db mice， and probed into the working mechanism of exercise-induced anti-inflammation. The authors randomly divided 16 db/db mice and 16 wild littermate mice into corresponding control groups （WC and DC） and exercise groups （WE and DE）， let the mice swim 1 hour a day， 5 days a week， for 4 weeks， took epididymis fat pads out of the mice in various groups， separated stromal vascular fraction cells （SVCs） of epididymis fat tissues， analyzed SVCs F4/80+CD11b+CD11c+ and F4/80+CD11b+CD11c- macrophages by means of flow cytometry， determined inflammation related gene expressions by means of RT-PCR， and revealed the following findings： db/db mices body mass， epididymis fat content， fasting blood glucose （FBG）， SVCs number， F4/80+CD11b+ macrophage number and its percentage in SVCs， F4/80+CD11b+ CD11c+ macrophages number and its percentage increased significantly （P<0.05）， their epididymis fat TNF-α， IL-6， iNOS， F4/80 and CD11c mRNA expression increased significantly （P<0.05）， their epididymis fat IL-10， CD206 and Arg1 mRNA expression decreased significantly （P<0.05）； the 4-week swimming training significantly increased db/db mices body mass （P<0.05）， did not significantly change their epididymis fat content， significantly decreased their FBG， SVCs number， F4/80+CD11b+ macrophage number and its percentage in SVCs， CD11c+ macrophage number and its percentage in F4/80+CD11b+ macrophages （P<0.05）， significantly decreased their epididymis fat TNF-α， IL-6， iNOS， F4/80， CD11c mRNA expression （P<0.05）， and significantly increased their IL-10， CD206 and ARG1mRNA expression （P<0.05）； the 4-week swimming training did not significantly change various indexes of wild mice. The said findings indicate the followings： 1） as type M1 pro-inflammatory macrophages in epididymis fat of db/db mice increases， inflammatory cytokines gene expression increases； 2） the 4-week swimming training effectively reduced the infiltration of macrophages in epididymis fat of db/db mice， reduced type M1 macrophages， promoted type M2 anti-inflammatory macrophage phenotype， thus lowered fat tissue inflammation level.

Key words： sports biochemistry；type 2 diabetes；macrophage；chronic inflammation；swimming training；mouse

靜態(tài)生活方式、不良飲食結構提高了2型糖尿病的發(fā)病風險，全球范圍內2型糖尿病人群持續(xù)升高，成為醫(yī)療衛(wèi)生面臨的重大課題。Hotamisligil[1-2]1993年發(fā)現(xiàn)肥胖、糖尿病動物脂肪組織中促炎癥因子TNF-α基因、蛋白表達均成倍增加，1994年發(fā)現(xiàn)TNF-α通過抑制胰島素受體的酪氨酸酶活性直接干擾胰島素信號通路，揭示了慢性炎癥為胰島素抵抗的病理機制之一，同樣為2型糖尿病常見的病理特征。Weisberg[3]2003年通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)肥胖動物脂肪組織中F4/80+染色陽性巨噬細胞數(shù)量顯著增加，為促炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β等的主要來源，極大地提高了對脂肪組織免疫細胞和代謝疾病之間的認識。羅格列酮為糖尿病治療藥物，可有效降低肥胖動物脂肪組織中巨噬細胞炎癥，提示糖尿病的治療與脂肪組織巨噬細胞炎癥有關[4]。

2006年美國運動醫(yī)學會（ACSM）提出“運動是良藥”的健康理念，運動被列為疾病防控的常規(guī)治療手段，運動、營養(yǎng)、藥物作為治療2型糖尿?。═2DM）的三駕馬車，運動的經(jīng)濟性、廣泛的健康效應更備受青睞，運動的抗炎效應實為防治T2DM的關鍵途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)，運動對肥胖動物模型慢性炎癥的改善與降低脂肪組織巨噬細胞浸潤、促炎表型有關[5]。運動對 2型糖尿病小鼠（db/db）脂肪組織巨噬細胞介導的慢性炎癥的影響和機制尚不清楚，以往運動對脂肪組織炎癥的研究多通過檢測炎癥因子基因表達的方法推測巨噬細胞數(shù)量變化、炎癥狀態(tài)，顯然不如流式細胞術準確。本研究通過流式細胞術檢測純合瘦素受體自發(fā)突變（lepr-/-）的2型糖尿病小鼠（db/db）模型附睪脂肪組織巨噬細胞浸潤、表型分析，該小鼠表現(xiàn)為多食、多飲、多尿，3～4周產(chǎn)生肥胖表型，10～14 d胰島素和血糖開始升高，非常適合用于代謝類疾病研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

本實驗選用16只4周齡C57BLKS背景雄性瘦素受體自發(fā)突變純合子db/db小鼠（BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/JNju）作為2型糖尿病研究模型，同窩生野生小鼠16只，購自南京大學模式動物中心（SCXK（蘇）2010-0001）。適應飼養(yǎng)1周后隨機分為野生安靜對照組（WC）、db/db安靜對照組（DC）、野生運動組（WE）和db/db游泳運動組（DE） ，每組8只。動物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為室溫（23±1）℃，相對濕度控制在50%～60%，喂食國家標準嚙齒類動物飼料，自由攝食飲水，12 h/12 h光照。

1.2 運動方案

對照組小鼠不施加任何運動干預，于籠中靜養(yǎng)；游泳運動組小鼠采用游泳運動：運動組小鼠在深為90 cm，直徑為60 cm的塑料水桶內進行游泳，水溫控制在（31±1）℃，水深控制在（60～65）cm。運動組小鼠適應性運動1周：第1、2天適應性游泳15 min，第3天30 min，第4、5天45 min，降低小鼠對水的應激反應，休息2 d執(zhí)行正式運動方案：每天游泳60 min，每周5 d，共4周。

1.3 組織取材和指標測試

1）附睪脂肪組織SVCs分離和流式分析。

末次訓練結束禁食12 h，血糖儀（日本京都1640血糖儀）檢測小鼠空腹血糖，斷頸處死小鼠，取雙側附睪脂肪，分離脂肪組織SVCs：50 mg附睪脂肪組織，預冷1×PBS 緩沖液清洗2～3次，去掉血跡和毛發(fā)，F(xiàn)ACS buffer （1×PBS緩沖液+2%BSA）中剪碎，500 g 4 ℃離心5 min，加入2 mg/mL 2型膠原酶消化液（FACS buffer稀釋），37 ℃搖床恒溫水浴消化45 min，100 ?m孔徑細胞篩網(wǎng)（美國BD）過濾細胞懸液，過濾掉細胞團塊和無法消化的結締組織，1 000 g離心5 min，棄上層脂肪細胞，收集底層SVCs細胞團，F(xiàn)ACS buffer重懸細胞[6]。附睪脂肪SVCs的流式細胞儀分析20 ?g/mL FC-Block抗體4℃孵育附睪脂肪SVCs細胞20 min，小鼠F4/80 Percp-cy5.5、CD11b Pacific blue、CD11c APC-cy7熒光標記流式抗體和IgG抗體暗室孵育細胞20 min。美國BD FACS CantoII型流式細胞儀分離SVCs中F4/80+ CD11b+和F4/80+CD11b+ CD11c+巨噬細胞。

2）Real-time PCR法測定附睪脂肪組織基因表達。

Trizol法提取小鼠附睪脂肪總RNA：200 mg附睪脂肪于2 mL研磨管（含磁珠），加入1.5 mL Trizol試劑（Invitrogen），剪碎組織，勻漿（美國OMNI Bead Ruptor24） 2～3次，每次30 s，間隔15 s，12 000 g 4 ℃離心10 min，吸棄上層300 ?L油脂避免污染RNA，收集上清，加入200 μL氯仿，室溫靜置5 min，12 000 g 4 ℃離心15 min，收集上層水相400 μL，加入400 μL異丙醇，室溫靜置10 min。12 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清，加入1 mL 體積分數(shù)為75%乙醇，7 500 g 4 ℃離心5 min，吸棄上清，空氣干燥5～10 min，加入40 μL DEPC水（碧云天），55～60 ℃水浴助溶，超微量分光光度計（美國NanoVue Puls）測定RNA D（λ）值和D（260）/D（280），計算RNA濃度后于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)錅y。cDNA合成試劑盒（TOYOBO FSQ-101）進行逆轉錄反應（BIO-RAD PCR儀）：反應條件為37 ℃ 15 min→98 ℃ 5 min→4 ℃，采用SYBR Green摻入法，利用TOYOBO SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201）試劑盒在ABI熒光實時定量PCR儀進行PCR反應，反應條件為95 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s共45個循環(huán)，目標基因引物見表1。

1.4 統(tǒng)計學分析

通過Graph Pad 5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差形式表示，組間采用雙因素方差分析，以P<0.05為顯著性差異。

2 結果及分析

2.1 四周游泳訓練對db/db小鼠生理和代謝的影響

如表2所示，與WC組比較，DC組小鼠體質量、附睪脂肪質量、附睪脂肪質量與體質量百分比、空腹血糖濃度顯著增加（P<0.05）；與WC組比較，WE組小鼠各種參數(shù)普遍表現(xiàn)出下降趨勢，但并無顯著性差異；與DC組比較，DE組小鼠體質量顯著升高（P<0.05），附睪脂肪質量及其與體質量百分比均無顯著性差異，空腹血糖濃度顯著下降（P<0.05）。

2.2 四周游泳訓練對db/db小鼠脂肪組織巨噬細胞浸潤和表型的影響

圖1為各組小鼠附睪脂肪組織SVCs的流式細胞術分析模式圖，P1門為SVCs，P2門為F4/80+CD11b+巨噬細胞，P3門為F4/80+CD11b+ CD11c+巨噬細胞。表3 表明，與WC 組比較，DC組小鼠附睪脂肪SVCs數(shù)量顯著增加（P<0.05），SVCs中F4/80+CD11b+ 巨噬細胞數(shù)量、百分數(shù)顯著增加（P<0.05），F(xiàn)4/80+CD11b+ 巨噬細胞中CD11c+ 巨噬細胞數(shù)量、百分數(shù)顯著增加（P<0.05）；與WC組比較，WE組小鼠附睪脂肪SVCs數(shù)量、SVCs中F4/80+CD11b+巨噬細胞數(shù)量、百分數(shù)和F4/80+CD11b+ 巨噬細胞中CD11c+ 巨噬細胞數(shù)量、百分數(shù)無顯著差異。與DC組比較，DE組小鼠附睪脂肪SVCs數(shù)量顯著下降（P<0.05），SVCs中F4/80+CD11b+巨噬細胞數(shù)量和百分數(shù)顯著下降（P<0.05），F(xiàn)4/80+CD11b+巨噬細胞中CD11c+ 巨噬細胞數(shù)量和百分數(shù)顯著下降（P<0.05）。

2.3 四周游泳訓練對db/db小鼠脂肪巨噬細胞標志物基因表達的影響

表4表明，與WC組比較，DC組小鼠附睪脂肪F4/80、CD11c mRNA表達顯著升高（P<0.05），CD206、Arg1mRNA表達顯著下降（P<0.05）；與WC組比較，WE組小鼠各參數(shù)無顯著差異；與DC組比較，DE組小鼠F4/80、CD11c mRNA表達顯著下降（P<0.05），CD206和ARG1mRNA表達顯著升高。

2.4 四周游泳訓練對db/db小鼠脂肪炎癥基因表達的影響

表5表明，與WC組比較，DC 組小鼠附睪脂肪TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表達顯著升高（P<0.05），IL-10 mRNA顯著下降（P<0.05）；與WC組比較，WE組小鼠各項參數(shù)無顯著差異。與DC組比較，DE組小鼠TNF-α、IL-6、iNOS、mRNA表達顯著下降（P<0.05），IL-10 mRNA表達顯著升高（P<0.05）。

3 討論

3.1 四周游泳訓練對脂肪組織巨噬細胞數(shù)量和表型的影響

脂肪組織基質血管部分（stromal vascular fraction，SVF）富含間充質干細胞、前體脂肪細胞、內皮細胞和巨噬細胞、嗜酸性粒細胞等多種免疫細胞[7]。SVCs數(shù)量與脂肪組織的肥胖程度相關，隨高脂膳食干預時間延長小鼠附睪脂肪含量增加的同時SVCs數(shù)量進行性增加[8]。本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠附睪脂肪中SVCs數(shù)量明顯增加。運動對脂肪組織SVCs數(shù)量的影響尚不清楚，也無類似研究先例，4周游泳訓練對野生小鼠附睪脂肪SVCs數(shù)量的影響并不顯著，不過4周游泳訓練顯著降低db/db小鼠附睪脂肪SVCs數(shù)量。Nishimura[9]探索ob/ob小鼠附睪脂肪SVCs中免疫細胞的組成，發(fā)現(xiàn)F4/80+CD11b+巨噬細胞數(shù)量最多，約為30%。脂肪組織中巨噬細胞數(shù)量隨肥胖程度進行性增加，巨噬細胞數(shù)量、炎癥狀態(tài)與胰島素抵抗高度相關[10]。肥胖動物內臟脂肪組織中巨噬細胞數(shù)量遠遠高于皮下脂肪組織，因此內臟脂肪組織對慢性炎癥、胰島素抵抗的作用更為突出，所以脂肪組織慢性炎癥研究通常選擇附睪脂肪[11]。

巨噬細胞根據(jù)炎癥特性分為經(jīng)典激活（M1）和替代性激活（M2），F(xiàn)4/80、CD11b為巨噬細胞常見的分子標志物，M2型巨噬細胞分泌抗炎因子IL-10，豐富表達精氨酸酶（Arginase1），可與iNOS競爭性催化底物L-精氨酸，抑制NO產(chǎn)生，經(jīng)典標志物為CD206、CD163等；M1型巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6等一系列促炎癥因子，iNOS表達增加催化底物L-精氨酸，產(chǎn)生NO，經(jīng)典標志物為CD11c[11]。通過F4/80、CD11b、CD11c熒光標記抗體分離db/db小鼠附睪脂肪組織SVCs中F4/80+CD11b+ CD11c+ （M1）和F4/80+CD11b+ CD11c- （M2）巨噬細胞，研究分析4周游泳訓練對db/db小鼠附睪脂肪巨噬細胞的影響，結果發(fā)現(xiàn)db/db小鼠附睪脂肪SVCs中F4/80+CD11b+巨噬細胞數(shù)量和百分數(shù)增加，F(xiàn)4/80+CD11b+巨噬細胞中CD11c+/M1型巨噬細胞及其比例遠遠高于野生小鼠，提示促炎癥的巨噬細胞數(shù)量顯著增加，結果同營養(yǎng)性肥胖小鼠附睪脂肪巨噬細胞變化相似。Nguyen[6]發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠附睪脂肪組織F4/80+巨噬細胞百分數(shù)（55.5±2.3）%顯著高于野生對照組（35.1±1.1）%，C57BL/6小鼠附睪脂SVCs中F4/80+、F4/80+CD11b+ CD11c+巨噬細胞數(shù)量隨肥胖程度進行性增加。4周游泳訓練顯著降低db/db小鼠附睪脂肪SVCs中F4/80+CD11b+巨噬細胞的數(shù)量及其百分數(shù)和F4/80+CD11b+ CD11c+ 細胞及其百分數(shù)，對野生小鼠相同指標影響則不明顯，因此可以推斷4周游泳訓練降低db/db小鼠附睪脂肪組織SVCs數(shù)量部分與F4/80+CD11b+巨噬細胞數(shù)量減少有關。很明顯50 mg附睪脂肪無法分離出明顯的F4/80+CD11b+CD11c-細胞群，無法直觀地判定F4/80+CD11b+CD11c-細胞亞群的變化趨勢。

3.2 四周游泳運動對脂肪組織巨噬細胞炎癥標志物基因表達的影響

db/db小鼠附睪脂肪F4/80、CD11c mRNA表達顯著高于同窩野生小鼠，進一步表明db/db小鼠附睪脂肪中巨噬細胞，尤其M1型巨噬細胞數(shù)量的增加。TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表達的顯著升高表明脂肪組織炎癥水平的升高，同時CD206、IL-10和Arg1基因表達的顯著下降提示M2型巨噬細胞數(shù)量下降，抗炎功能下降或受到抑制。前期研究表明db/db小鼠附睪脂肪F4/80+染色陽性細胞數(shù)目增加，F(xiàn)4/80、CD68、TNF-α、IL-6、CD11c、MCP-1mRNA等表達顯著提高[12-13]，這些研究結果同ob/ob、小鼠營養(yǎng)性肥胖小鼠脂肪組織巨噬細胞炎癥特征基本一致[14]。有氧運動對改善2型糖尿病患者胰島素抵抗、降低外周血中炎癥標志物有良好的效果[15]，動物實驗也發(fā)現(xiàn)2周中等強度運動可降低db/db小鼠外周血中炎癥蛋白[16]，然而運動對db/db小鼠脂肪炎癥基因表達的影響沒見報道。本研究發(fā)現(xiàn)4周游泳訓練顯著降低db/db小鼠附睪脂肪F4/80、CD11c、TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表達，提高了IL-10、Arg1、CD206 mRNA表達，這一發(fā)現(xiàn)同運動對肥胖小鼠附睪脂肪炎癥的改善效果相似，Kawanishi[5]發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)性肥胖小鼠附睪脂肪F4/80、CD11c、TNF-α mRNA表達顯著升高，CD163 mRNA表達顯著下降，16周耐力跑臺運動顯著降低F4/80、CD11c mRNA表達，提高CD163mRNA表達，降低脂肪組織炎癥。Bradely[17]發(fā)現(xiàn)6周自主跑輪運動顯著降低高脂膳食小鼠TNF-α、MCP-1等促炎因子mRNA表達。Vieira[18]發(fā)現(xiàn)12周65%～70%VO2max跑臺運動降低脂肪組織F4/80、TNF-α表達，同時降低機體炎癥水平，改善胰島素抵抗。

db/db小鼠附睪脂肪M1型（F4/80+CD11b+CD11c+） 巨噬細胞增多，炎癥因子基因表達水平明顯高于野生小鼠；4周游泳訓練有效降低附睪脂肪F4/80+CD11b+巨噬細胞浸潤，尤其降低M1型巨噬細胞數(shù)量，提高M2型巨噬細胞表型，降低db/db小鼠附睪脂肪炎癥水平。

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