郝玲玲，謝小波，胡勇，徐圣普

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院 生物醫(yī)學工程研究所，天津 300192)

1 引 言

臨床上，視網膜色素變性(RP)[1]和年齡相關性黃斑變性(AMD)[2]為兩種常見的致盲性眼病。其主要都是由缺失感光細胞導致視網膜退化引起的，主要表現為慢性進行性視野缺失。目前，潛在的治療方法包括：通過基因療法延長感光細胞的壽命[3]，藥物治療[4]，膳食補充[5]，使用抗氧化劑[6]等。一旦感光細胞死亡，這些治療方法都不再可行。其他的試驗方法著眼于替代感覺神經元。這些方法包括感光細胞和造血干細胞移植[7]，細胞修飾，視網膜重塑。盡管在這些領域取得了一些進展，但是沒有有效的治療方法。有研究表明，雖然視網膜外層感官細胞缺失，但內層的細胞仍是完整的，通過這些細胞的電刺激，仍可感知光[8]。這一發(fā)現為研究生物電子眼植入物即視網膜假體提供了動機。全世界進行的幾組臨床試驗中，受試者與植入物可以檢測光和執(zhí)行視覺引導的任務[9]?，F已有患者攜帶商業(yè)化的視覺假體，如The Argus II，據報道這款視覺假體于2013年11月已被美國食品和藥物管理局(FDA)批準臨床使用。這也足以說明對視網膜變性疾病可以通過人工視覺假體對視網膜或者視神經進行電刺激的方式使失明或瀕于失明的患者重新獲得部分有用視力。植入物假體代替退化或者消失的視網膜細胞接收外界光信息后，轉換成生物電信號，刺激并激活視網膜神經細胞，然后經視神經將電信號傳至大腦視覺中樞，從而形成完整的視覺通路[10-12]。在視覺假體的研究上，如何提高其分辨率仍然是研究者們面臨的一大挑戰(zhàn)。

視覺通路(visual pathway)的構成包括視網膜、視神經和視皮層，視網膜是光敏感區(qū)，包含光敏單元視桿細胞和視錐細胞。視神經將光刺激到視桿細胞和視錐細胞產生的電信號傳導到大腦進行視覺處理。針對視網膜病變中患者外層光感受器受損，視錐細胞和視桿細胞發(fā)生不同程度的退化，造成的視力減退或失明，將視覺假體關鍵部件-視網膜微電極陣列(retinal microelectrode array)植入視網膜，刺激尚存的視桿細胞和視錐細胞，通過患者微受損的神經元，仍然可以將視網膜的電信號傳輸給大腦，形成視覺圖像[13-14]。視網膜微電極，作為視網膜假體的關鍵組成部分之一，其研究對提高視覺假體的分辨率有著重要作用。視網膜微電極，作為植入電極，其柔韌性及物理參數、電化學特性等在眼內環(huán)境下的表現均有可能影響視覺假體的分辨率。常用視網膜微電極直徑多取于50～500 μm[15-18]。本研究采用直徑為200 μm的Parylene-C作為電極襯底，金(Au)作為電極材料，通過電化學阻抗譜，分析計算出電極的電化學阻抗值、相位角區(qū)間[15]，初步判定是否適合做刺激微電極植入提供參考依據。

2 實驗

2.1 視網膜微電極材料及結構

本實驗采用視網膜微電極以聚對二甲苯(Parylene-C)為柔性襯底，金作為刺激電極表面材料。視網膜微電極設計參數參照了視錐細胞的參數，使得電極刺激能夠引起的刺激能夠引起視錐細胞的反應，最終產生的視皮層映像可達到一定的分辨率，刺激電極直徑設計為200 μm。本研究采用包含四個電極點的陣列，電極直徑相同。電極引線線寬為40 μm，電極間間距為200 μm，引線間最小間距為60 μm。電極中心位于同一條直線上。同時，考慮到能夠使電刺激可以產生均勻的電場分布，電極采用圓盤型設計[11]。

圖1 視網膜微電極陣列

2.2 視網膜微電極制造工藝

基于parylene-C的視網膜微電極與以polyimide-based為襯底的視網膜微電極的制作工藝大致相同[16]。本文的視網膜微電極的制作工藝見圖2。在硅晶片上蒸發(fā)300 nm厚鋁(Al)作為犧牲層釋放微電極，見圖2(a)。硅烷化后在襯底上沉積12～14 μm厚的 parylene-C作為底層絕緣層，見圖2(b)，硅烷化后濺射Cr/Au/Cr(70/200/70nm)并光刻形成電極點,導線與連接端口。Cr層用于增加金涂層和絕緣聚對二甲苯層的附著力。硅烷化后沉積12～14 μm厚的parylene-C作為微電機的上層絕緣層，見圖2(d)。蒸發(fā)500 nm 的Al，光刻后形成Parylene-C的掩膜層，見圖2(e)。氧氣等離子體干刻parylene-C層(圖2f)后，去除Al掩膜層，并腐蝕掉電極點和連接端口上層的Cr層(圖2g)，最后電解Al釋放微電極(圖2h)。

圖2基于Parylene的微電極陣列制造工藝流程圖

Fig2Fabricationprocessflowforparylene-basedmicroelectrodearray

2.3 體外測試-視網膜微電極電特性測試

視網膜微電極的體外測試通過電學性能檢測進行初步評價。電化學檢測由微電極在電解質溶液中進行氧化還原反應來進行測試。本研究電化學阻抗譜(EIS)的測試采用三電極的電化學檢測系統(tǒng)[13]。如圖3所示，三電極系統(tǒng)，除被測電極(工作電極)外，通常包含一個鉑電極作對電極，一個Ag/AgCl電極做參考電極。實驗中將兩兩相距1 cm的三個電極同時置于pH為7.4的磷酸緩沖液(PBS)中，以模仿生物體眼內體液環(huán)境。所有的實驗數據均與室溫條件下采集。本測試采用50 mV的交流電壓。實驗數據采集采用美國Gamry公司的Reference 600電化學工作站。

圖3三電極測試系統(tǒng)

Fig3Sketchofathree-electrodeelectrochemicalsystem

2.4 體內測試-微電極植入柔韌性檢測

實驗采用260 g的健康的成年大鼠。實驗程序嚴格按照視覺與眼科研究協(xié)會的政策指導進行。采用濃度10%的水合氯醛麻醉后，固定于鋪有37℃恒溫墊大的鼠立體定位儀上。為減小手術創(chuàng)面，模擬臨床試驗電極植入，在不摘除大鼠玻璃體的情況下，手術刀避開眼部血管，切寬約1.5 mm左右的虹膜切口，用鑷子控制電極方向，從切口植入微電極陣列。手術植入的全部程序都在顯微鏡下進行。

3 結果與討論

本研究的視網膜微電極采用Parylene-C作為電極襯底，考慮其在介電常數、介電損耗、吸水性，以及抗拉強度和楊氏模量等性能，以及很好的生物相容性。植入視網膜表層時，控制其植入方向，可使微電極陣列能夠與視網膜很好地接觸，達到更有效的刺激。本研究選用金作為刺激電極材料，并采用Cr層增強電極點和襯底材料的結合力，除了考慮其優(yōu)良的導電性和抗腐蝕能力,相比較于鉑金、氧化銥電極，降低制作工藝難度的同時，有效的削減了成本。電極尖端和引線相接位置均為弧形設計，避免直角應力斷裂及植入時對生物組織的傷害。

研究表明，增加電極刺激位點的面積，能有效降低電化學阻抗，提高電荷的注入能力[15]。影響阻抗的兩個重要因素為微電極大小及表面粗糙度。LI Xiaoqian[16]曾報道大小為200 μm × 400 μm的TiN、Pt和IrOx電極的電化學特性，這三種電極圖層下層均以金涂層，文中提到金電極為做涂層時頻率為1 KHz時，阻抗為107 kΩ。本實驗采用的直徑為200 μm的金電極測試結果為在頻率為1 KHz時的阻抗為37.94 kΩ，在電極面積更小的情況下，阻抗更低。Petrossians A等人[17]通過在鉑金電極上層濺射氧化銥涂層，改變表面形貌，增加電極表面粗糙度，提高電極點的有效面積，降低了電極阻抗，提高電荷注入能力。實驗所用氧化銥涂層電極對成本和制作工藝的要求較高。如圖4所示，本研究設計制作的基于Parylene-C的微電極，以金為電極表面涂層，涂層表面粗糙度高，在降低成本和制作工藝的要求的同時，也實現了增加電極點的有效面積，有理由相信這是減小阻抗的重要因素。見圖5。電極電化學阻抗隨頻率的升高而明顯下降，呈明顯高通特性。且曲線的光滑度也說明電極表面結構良好，電化學性能穩(wěn)定。

圖4 電極表面形貌SEM掃描照片

圖5微電極阻抗和相位隨頻率變化曲線

Fig5Frequency-impedancespectrumandfrequency-phasespectrumofmicroelectrode

圖6為電極植入大鼠眼睛內部的顯微鏡照片，可以觀察到基于Parylene-C的視網膜金電極陣列中的4個微電極點。微電極陣列植入后沿視網膜自然彎曲，貼合在視網膜上，具有很好的柔韌性，適于做植入電極。

圖6電極植入大鼠眼睛內部位置(A，B，C，D為植入電極點)

Fig6Placementoftheelectrodearrayafterimplanted(A，B，CandDareimplantedelectrodes)

4 結語

本研究設計并評估的基于Parylene-C的視網膜金微電極，在降低了制作難度和材料成本的基礎上，電極的襯底材料采用parylene，面材料具有柔韌性，植入后與視網膜接觸良好，同時這種材料對于加工要求相對較低，金電極作為刺激電極，成本也較低。電學特性滿足視網膜電極的植入要求，可用于視網膜刺激微電極。尤其在我們對影響視覺假體分辨率諸多因素不斷探索的階段，在符合刺激條件的情況下，采用我們提出的金電極可以避免造成不必要的浪費。隨著電極加工工藝的不斷發(fā)展，相信較為成熟或更加新穎的加工方式的出現，與植入手術技術的不斷提高，視網膜植入微電極對材料的要求會相對降低，這對視網膜微電極為更多患者服務打下了堅實的基礎。