郭冬梅，冉佩瑤，王慶紅，許娟娟，傅英姿

(西南大學化學化工學院，重慶400715)

0 引言

手性是自然界和生物體的基本屬性，酶、蛋白質、DNA和受體等生物大分子廣泛存在于生物體中，構成了龐大且復雜的手性系統(tǒng)。手性藥物進入生物體后，會與體內大分子進行嚴格的手性匹配，從而導致手性藥物對映體的生理活性和藥理作用存在顯著差異。大多數(shù)情況下，一種對映異構體具有藥理活性，而另一種卻可能產生副作用，甚至毒性[1-3]。例如，作為多巴胺合成前體的L-多巴常被用于治療帕金森病，但真正具有治療作用的卻是多巴胺，而多巴胺不能跨越腦屏障進入作用部位，因此只能服用多巴，再由體內的脫羧酶將其催化脫羧釋放出多巴胺。然而脫羧酶僅對L-多巴具有脫羧作用，對D-多巴不具有脫羧作用。如果服用多巴消旋體，D-多巴將不能被酶代謝，會在體內聚集，從而對人體造成傷害[4]。因此，發(fā)展簡單、快速、可靠和實用的手性藥物對映體純度分析和含量檢測技術成為醫(yī)藥學和生物學等領域的研究熱點。在眾多的手性識別技術中，手性電化學傳感器因具有操作簡單、靈敏度和選擇性高、成本低等優(yōu)點，受到研究者的廣泛關注[5]。

環(huán)糊精（cyclodextrin,CDs）作為手性分離和分析中重要的手性選擇劑，具有高的分子選擇性和對映選擇性。它是由D-吡喃葡糖糖單元通過α-1,4-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖，具有外親水內疏水結構，其疏水空腔可以通過非共價鍵作用包絡與其腔體形狀、大小適宜的客體分子，形成主-客體包埋復合物，實現(xiàn)對有機分子、無機分子和生物分子等的識別[6-7]。根據D-吡喃葡糖糖單元個數(shù)的不同，環(huán)糊精主要有α-環(huán)糊精(α-CD)，β-環(huán)糊精(β-CD)和 γ-環(huán)糊精(γ-CD)三種類型[8]，其中β-CD在手性識別研究中應用最為廣泛。

石墨烯（graphene）作為一種新型二維碳納米材料，具有大的比表面積、優(yōu)異的導電性能和高的穩(wěn)定性，近年來在電化學傳感器的構建上得到大量應用[9-11]。然而石墨烯難分散、易團聚的特點限制了其應用，因此得到分散性和穩(wěn)定性良好的石墨烯溶液，仍是當今的研究難題之一。最近，Yang等[12]發(fā)現(xiàn)了一種用離子液體還原氧化石墨烯的方法，制得了分散性良好和電子傳遞能力優(yōu)異的石墨烯衍生物。離子液體是一種親水性強、電子傳遞能力好的綠色溶劑。氨基化的吡啶類離子液體具有帶正電的官能團，可以通過氨基的還原作用同氧化石墨烯中的環(huán)氧基偶聯(lián)，在還原氧化石墨烯的同時，引入較強的表面電荷，極大地改善了石墨烯的分散性，并加強其電子傳遞能力。

在此，首先通過氨基化離子液體（IL-NH2）還原氧化石墨烯（GO）制得離子液體修飾的氧化石墨烯復合物（IL-rGO），然后將其滴涂于玻碳電極表面，再電沉積納米金，最后通過金-硫鍵結合巰基-β-環(huán)糊精（β-CD-SH），構建了一種新型的手性電化學傳感器。該傳感器可用于手性分子或手性藥物的識別研究或對映體純度分析。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

L-多巴 (99%)、D-多巴 (99%)和氯金酸（HAuCl4·xH2O,99.9%）均購于阿拉丁試劑公司(中國，上海)，1-氨丙基-3-甲基咪唑氯鹽離子液體（IL-NH2，>98%）購于上海成捷化學有限公司（中國，上海），氧化石墨烯（GO）購于南京先鋒納米材料科技有限公司（中國，南京），巰基-β-環(huán)糊精（β-CD-SH）購于山東濱州智源生物科技有限公司（中國，山東）。其余化學試劑均為分析純，無需進一步純化即可直接使用。所有實驗用水均為二次蒸餾水。

所有電化學測試均在CHI 620D電化學工作站(中國，上海辰華)上進行。標準三電極體系中，以飽和銀/氯化銀電極（Ag/AgCl）為參比電極，鉑絲電極為對電極，玻碳電極為工作電極。

1.2 IL-rGO復合物的制備

IL-rGO復合物的制備參照文獻 [13]：稱取25 mg GO分散于50 mL蒸餾水中，然后依次加入50 mg IL-NH2和50 mg KOH，超聲至分散均勻，再將該混合溶液于80°C攪拌反應24 h。最后將所得的石墨烯復合物用乙醇和水離心洗滌數(shù)次，再分散于50 mL蒸餾水中。

1.3 傳感界面的制備

裸玻碳電極(GCE，Φ=4mm)分別用 1.0、0.3 和0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨拋光，依次在乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗，自然晾干。隨后，在玻碳電極表面滴涂8 μL IL-rGO分散液，自然晾干。然后將電極置于1%HAuCl4中恒電位 （電位為-0.2 V）沉積180 s，取出并用蒸餾水清洗干凈。最后將電極置于2.0 mg/mL β-CD-SH溶液中于4℃下浸泡過夜。測試時，用蒸餾水沖洗掉電極表面物理吸附的β-CD-SH，晾干后置于用0.25 mol/L硫酸溶液配制的D-多巴或L-多巴中進行DPV掃描測試。電極構建示意圖如圖1A所示。

2 結果與討論

2.1 不同修飾電極的電化學特性

圖1 （A）傳感界面構建過程圖，（B）傳感界面和多巴對映體作用示意圖,(C)多巴的氧化還原機理Fig.1 (A)Fabrication of the sensing platform,(B)Schematic illustration of the interaction between the sensing interface and DOPA enantiomers,(C)The oxidation-reduction reaction of DOPA

循環(huán)伏安技術（CV）是研究電極表面特性的常用方法，實驗中采用其研究了電極修飾過程中電極表面電化學特性的變化。電化學測試在5.0×10-3mol/L[Fe(CN)6]4-/3-溶液中進行，掃速為0.1 V/s。如圖2所示，裸GCE呈現(xiàn)一對可逆的氧化還原峰（曲線a）。滴涂IL-rGO后，峰電流響應明顯增大，且氧化還原峰不再對稱，還原峰電流明顯高于氧化峰電流，這可能是IL-rGO帶正電所致（曲線b）。電沉積納米金后，氧化還原峰電流均明顯增加，且氧化還原峰可逆對稱（曲線c），可能是電沉積的納米金帶負電荷，中和了石墨烯表面的正電荷，從而導致氧化還原峰對稱可逆。自組裝β-CD-SH后，氧化還原峰電流顯著減小（曲線d），這是由于β-CD阻礙電子的傳遞。

圖2 電極修飾過程的CV響應：（a）裸GCE,（b）IL-rGO/GCE,（c）dpAu/IL-rGO/GCE,（d）β-CD-SH/dpAu/IL-rGO/GCEFig.2 CVs for different electrodes:(a)bare GCE,(b)IL-rGO/GCE,(c)dpAu/IL-rGO/GCE,(d)β-CD-SH/dpAu/IL-rGO/GCE

2.2 多巴對映異構體在不同修飾電極上的DPV響應

采用DPV技術研究了5.0×10-3mol/L多巴溶液（0.25 mol/L H2SO4溶液配制）在不同修飾電極表面的電化學行為。如圖3所示，兩種構型的多巴對映體在裸 GCE（圖A）和IL-rGO/GCE（圖B）上的DPV響應曲線幾乎重合，說明這兩種電極對多巴對映異構體無識別作用；但是多巴對映異構體在IL-rGO/GCE上的電流響應顯著增強，說明IL-rGO能夠促進多巴對映體在電極上的電子轉移。在dpAu/IL-rGO/GCE上（圖C），電流響應進一步增強，并出現(xiàn)了微小的電流信號差異，由此說明電沉積納米金可進一步促進多巴的電子轉移，且對兩種構型的電子轉移促進作用有微小的差別，更利于D-多巴的電子轉移，從而使得D-多巴的電流響應信號更大。在dpAu/IL-rGO/GCE上自組裝 β-CD-SH后，D-多巴 （曲線b）和L-多巴（曲線a）的電流響應均減小，說明環(huán)糊精的組裝阻礙了多巴在電極上的電子轉移，且對兩者的電子阻礙作用不同，表現(xiàn)為更利于D-多巴在電極上的電子轉移，因此D-多巴的電流響應信號明顯大于L-多巴。實驗結果表明：β-CD-SH可以有效識別多巴對映異構體。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 電沉積納米金時間

圖3 L-多巴(a)和D-多巴(b)在不同電極表面的DPV響應:(A)裸GCE,(B)IL-rGO/GCE,(C)dpAu/IL-rGO/GCE,(D)β-CD-SH/dpAu/IL-rGO/GCEFig.3 DPVs for redox reactions of L-DOPA(a)and D-DOPA(b)on different electrodes:(A)bare GCE,(B)IL-rGO/GCE,(C)dpAu/IL-rGO/GCE,(D)β-CD-SH/dpAu/IL-rGO/GCE

納米金層的厚度會對電子的轉移產生影響，而電沉積時間是影響納米金層厚度的重要因素。因此，探討了電沉積時間對鐵氰化鉀電子轉移的影響。如圖4A所示，隨著電沉積時間的增加，鐵氰化鉀的峰電流不斷增大，180 s時，達到最大，說明電沉積納米金量達到飽和。超過180 s后，隨著時間的增加，峰電流反而下降，可能是由于納米金層太厚，反而阻礙電子的轉移。因此，選用180 s作為最佳沉積時間。

2.3.2 pH的影響

圖4 實驗條件優(yōu)化:(A)電沉積納米金時間,(B)pH的影響Fig.4 Optimization of experiment condition:(A)electrodeposition time of nanoAu,(B)effect of pH

由示意圖1C可知，多巴的氧化還原反應有質子的參與，pH值會影響其氧化還原過程。當pH大于7.0時，多巴發(fā)生的是化學氧化反應而不是電化學氧化反應[14]。因此，采用DPV研究了在酸性條件下pH值對多巴對映體氧化反應的影響。 如圖 4B 所示，在 pH 為 0.30～5.0 范圍內，隨著pH值的增加，峰電勢負移，而峰電流降低。由此說明，質子的參與在多巴的氧化還原過程中起到了至關重要的作用。實驗選用0.60作為識別多巴對映體的最佳pH。

2.4 線性

圖5 峰電流與多巴對映體的響應關系：（a）L-多巴,（b）D-多巴Fig.5 Dependence of the peak current on the concentration of(a)L-DOPA and(b)D-DOPA in 0.25 mol/L H2SO4

在最佳實驗條件下，用修飾電極檢測不同濃度下L-多巴和D-多巴的電流響應。如圖5所示，在 1.0×10-5mol/L 至 5.0×10-3mol/L 濃度范圍內，L-多巴(曲線a)和D-多巴(曲線b)的峰電流信號與其濃度呈線性關系，線性方程分別為Ip=0.0083+30.75cL-DOPA(r2=0.9966)和 Ip=0.0110+47.01cD-DOPA(r2=0.9960)，且檢出限分別為 3.3×10-6mol/L 和 2.1×10-6mol/L(S/N=3)。 同時，在該濃度范圍內，D-多巴的電流響應始終大于L-多巴，由此說明該傳感器可以用于多巴對映異構體手性識別。

2.5 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

為了測試該傳感器的重現(xiàn)性，采用差分脈沖伏安法測試五對修飾電極對多巴對映體的識別差異，結果發(fā)現(xiàn)，五對電極的峰電流差接近（RSD=3.9%），說明該傳感器具有較好的重現(xiàn)性。該傳感器的穩(wěn)定性采用循環(huán)伏安法進行測定，在多巴溶液中循環(huán)掃描50圈后，峰電流下降了4.9%。傳感器的長期穩(wěn)定性也進行了測定，當修飾電極不使用時，在4℃冰箱里儲存，放置一周和兩周，峰電流強度分別下降到初始電流的96.7%（RSD=4.5%）和 89.6%（RSD=5.1%），說明該傳感器具有一定的穩(wěn)定性。

2.6 不同電化學方法對比

將已有識別多巴對映體的電化學方法作對比，實驗結果見表1。結果表明該電化學傳感器不但能用于多巴對映體的手性識別，且能對多巴對映體進行定量檢測，并具有較高的手性選擇性、較寬的線性范圍和較低的檢出限。

2.7 傳感器的實際應用

將該傳感器用于檢測多巴消旋體溶液中D-多巴的含量(D-DOPA%)。保持多巴總濃度為2.0×10-3mol/L 和 5.0×10-3mol/L，D-多巴的含量從0到100%變化。如圖6所示，峰電流響應與D-多巴的含量呈線性增加，說明該傳感器可用于多巴消旋體純度的檢測。

3 結論

實驗利用氨基化離子液體修飾的氧化石墨烯、納米金和巰基-β-環(huán)糊精構建具有手性選擇性的傳感界面，并采用差分脈沖伏安法研究了該傳感界面對多巴對映異構體的手性識別作用。實驗結果表明：構建的手性傳感界面更利于D-多巴的電子傳遞，從而電流響應信號更強，由此說明巰基化β-環(huán)糊精與D-多巴的作用強于L-多巴。這為研究β-環(huán)糊精與其它手性分子和手性藥物的識別作用提供了潛在應用價值，具有理論和實際研究意義。

表1 識別多巴對映體的電化學方法對比Tab.1 Comparison of major electrochemical methods for recognition of DOPA enantiomers

圖6 傳感器用于不同濃度多巴消旋體純度的檢測：（a）5.0×10-3mol/L,（b）2.0×10-3mol/LFig.6 Peak current response of enantiomeric composition D-DOPA and L-DOPA at different concentrations:(a)5.0 mmol/L,(b)2.0 mmol/L

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