鐘堅海，張艷燕，陳金鳳,*，張曉龍，楊黃浩，尹曉斐

（1.龍巖出入境檢驗檢疫局，福建龍巖364000）

（2.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建福州350108）

（3.國家海洋局第一海洋研究所，山東青島266061）

0 引言

分子印跡聚合物作為一種新型、高效的分子識別材料，除了具有優(yōu)越的特異識別性和高效的選擇性，還具有制備簡單、成本低廉、功能預(yù)構(gòu)、堅固耐用等特點，尤其適用于復(fù)雜體系中目標(biāo)化合物的選擇性分離與分析[1-5]。磁性分離是通過磁場的作用將磁性組分與非磁性組分進(jìn)行分離的一種技術(shù)。近年來，將分子印跡與磁性分離技術(shù)相結(jié)合日益成為研究熱點，通過制備磁性分子印跡聚合物，從而得到兼具磁性快速分離和分子識別特性的材料，目前該技術(shù)已應(yīng)用于雌激素、除草劑、甲硝唑、雙酚A等物質(zhì)的分離富集[6-12]。

拉曼光譜是一種非接觸性、非破壞性、樣品量少且不受分析物物理形態(tài)影響的分析方法，能夠方便確定離子和分子的種類，但其存在檢測靈敏度低的缺點。近年來，研究發(fā)現(xiàn)以金屬納米粒子為活性基底，目標(biāo)分子附著到金屬納米結(jié)構(gòu)上可得到強(qiáng)烈的拉曼信號增強(qiáng)現(xiàn)象，稱為表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)。通過表面增強(qiáng)拉曼散射作用，可以使檢測靈敏度提升4至10個數(shù)量級，是目前分析化學(xué)研究前沿的熱點領(lǐng)域[13-16]。

孔雀石綠(MG)作為一種工業(yè)染料，易通過工業(yè)廢水的排放直接或間接的污染養(yǎng)殖區(qū)域，并在水產(chǎn)品中聚集。研究發(fā)現(xiàn)MG及其代謝產(chǎn)物均具有高殘留及高毒性，易產(chǎn)生致癌、致畸及致突變等作用[17]。因此，研究開發(fā)養(yǎng)殖水及水產(chǎn)品中MG的富集檢測新技術(shù)具有非常重要的意義[18-21]。

該文將分子印跡與磁性分離技術(shù)相結(jié)合，制備獲得兼具富集與分離的磁性分子印跡聚合物，并結(jié)合納米銀膠體的表面拉曼增強(qiáng)作用，建立了便攜式拉曼光譜儀對孔雀石綠的現(xiàn)場快速檢測方法，為水體和水產(chǎn)品中MG的快速靈敏檢測提供了新方法，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

便攜式拉曼光譜儀 （美國DeltaNu公司），紅外光譜儀（美國Thermo公司），X-射線衍射儀（日本Rigaku公司），透射電子顯微鏡 （美國FEI公司），ZHWY-103D恒溫培養(yǎng)振蕩器 （上海智城分析儀器制造有限公司），溫控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），真空干燥箱（上海精密實驗設(shè)備有限公司），超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

聚乙二醇 (PEG)、四乙氧基硅烷 (TEOS)、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)、甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基雙丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)及其他試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；孔雀石綠(MG)、結(jié)晶紫 (CV)和隱性孔雀石綠 (LMG)購于上海晶純生化科技股份有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 磁性納米粒子的合成及表面修飾

采用水熱法合成 Fe3O4納米粒子(Fe3O4NPs)[22]。具體方法如下：稱取 1.35 g FeCl3·6H2O，加入40 mL乙二醇，攪拌溶解得到黃色透明溶液。往該溶液中加入3.60 g醋酸鈉和0.10 g PEG，攪拌30 min，將溶液移至50 mL帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜內(nèi)，200℃加熱反應(yīng)10 h。冷卻至室溫，磁鐵分離，黑色顆粒依次用超純水和無水乙醇各洗滌6遍，60℃條件下真空干燥至恒重，即得到Fe3O4NPs。

稱取0.7 g Fe3O4NPs依次加入150 mL乙醇和7.5 mL濃氨水，室溫下超聲分散1 h，得到分散溶液。將2.5 mL TEOS和2.5 mL MPS加至10 mL乙醇中混勻作為預(yù)混合液，將預(yù)混合液滴加至Fe3O4NPs分散溶液，機(jī)械攪拌下反應(yīng)24 h，無水乙醇洗滌6遍，60℃真空干燥至恒重，即得乙烯基修飾的Fe3O4NPs。

1.3 Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)和Fe3O4@SiO2-NIPs的制備

稱取 100 mg乙烯基修飾的Fe3O4NPs超聲分散于30 mL乙腈中，加入0.5 mL EGDMA，超聲混勻。另取91.2 mg MG和66 μL MAA混合于30 mL乙腈中，于冰箱冷藏 12 h，得到復(fù)合模板單體溶液。將上述制備的兩種溶液混合后，加入20 mg AIBN，超聲5 min，通氮除氧10 min。密封后，50℃300 r/min預(yù)聚合反應(yīng)6 h，然后在60℃條件下聚合24 h，最后在85℃下進(jìn)一步老化6 h。制得的Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)用乙腈洗滌至上清液透明，再用甲醇-乙酸溶液(9∶1,V/V)索氏提取72 h。最后，產(chǎn)物用甲醇洗滌數(shù)次至中性，60℃下真空干燥。Fe3O4@SiO2-NIPs為未加模板分子的磁性分子印跡聚合物，制備方法除不加模板分子外，其他過程與Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)相同。合成原理如圖1所示。

圖1 Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)合成原理圖Fig.1 Schematic illustration for the preparation ofFe3O4@SiO2-MIPs(MG)

1.4 納米銀溶膠的合成

參照文獻(xiàn)[23]采用檸檬酸鈉還原硝酸銀溶液制備納米銀溶膠，具體方法如下：稱取36 mg硝酸銀溶解于200 mL水中，加熱至沸騰，劇烈攪拌下，加入4 mL 1%檸檬酸鈉水溶液，反應(yīng)60 min后，攪拌下冷卻至室溫。4℃冰箱避光保存。

1.5 實際樣品檢測

稱取 10 mg Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)于 5 mL離心管中，依次加2 mL甲醇和水振蕩各1 min，磁性分離，即完成活化，待用。

1.5.1 養(yǎng)殖水中孔雀石綠的分離富集

取10 mL經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾的待測水，加入 Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)振蕩 10 min，磁分離，棄清液；加入2 mL超純水淋洗，磁分離，棄清液；再用200 μL甲醇-乙酸混合溶液(9∶1,V/V)洗脫5 min，收集洗脫液待測。

1.5.2 水產(chǎn)品中孔雀石綠的分離富集

稱取5 g蝦肉勻漿于50 mL離心管，兩次加入15 mL乙腈，超聲振蕩6 min，6000 r/min離心5 min，收集合并提取液。將提取液分次加至活化后的3 g中性氧化鋁柱，收集濾液，并加入 2 mL乙腈淋洗收集。重復(fù)上述步驟將收集液再次過柱凈化，收集濾液。把濾液移至100 mL梨形瓶，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL，加入3 mL超純水超聲振蕩提取，收集溶液，再加入2 mL超純水超聲提取并收集溶液。溶液經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾后，加入Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)振蕩 5 min，磁分離，棄清液，再用1 mL超純水淋洗，最后用200 μL甲醇-乙酸混合溶液(9:1,V/V)洗脫，收集洗脫液待測。

1.5.3 SERS檢測實際樣品中的孔雀石綠

取 40 μL 納米銀溶膠， 加入 10 μL 0.2 mol/L KBr溶液，再加入 30 μL待測液，混勻。 取 30 μL置于承載凹槽內(nèi)，激光聚集，拉曼光譜檢測（激發(fā)波長：785 nm，激光功率：60 mW，積分時間：10 s）。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

圖2A表明實驗合成的Fe3O4是高度球形的核-殼粒子，粒徑約200～300 nm。當(dāng)修飾上SiO2和MPS后，在磁珠表面有一層薄殼層（圖2B）。由圖2C可以明顯看到一層20～30 nm的聚合物殼層，證明分子印跡殼層成功包裹在Fe3O4@SiO2表面。此外，沒有觀察到純聚合物顆粒和裸露的Fe3O4顆粒，說明印跡聚合反應(yīng)是在每個Fe3O4納米顆粒表面進(jìn)行的。

圖2 透射電鏡圖：(A)Fe3O4，(B)Fe3O4@SiO2，(C)Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)Fig.2 The TEM images of Fe3O4(A),Fe3O4@SiO2(B)and Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)(C)

圖3 FT-IR 譜圖：(A)Fe3O4，(B)Fe3O4@SiO2，(C)Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)Fig.3 FT-IR spectra of Fe3O4(A),Fe3O4@SiO2(B)and Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)(C)

由FT-IR光譜（圖3）可知，三種磁性納米顆粒在574 cm-1處均有一強(qiáng)吸收峰，此峰歸因于Fe-O鍵的拉伸，這表明在化學(xué)修飾和聚合物涂層后Fe3O4的組成沒有發(fā)生改變；在1254 cm-1處的C-O組峰、1731 cm-1的C=O組峰和2986 cm-1的甲基C-H組峰，表明在磁性顆粒Fe3O4表面已經(jīng)成功修飾上甲基丙烯酸層。同時，F(xiàn)e-O拉伸強(qiáng)度逐漸降低(Fe-O:574 cm-1)，這是由于Fe3O4表面存在聚合物殼。

圖4 X-射線衍射圖：(A)Fe3O4，(B)Fe3O4@SiO2，(C)Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)Fig.4 XRD patterns of Fe3O4(A),Fe3O4@SiO2(B)and Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)(C)

圖4為三種磁性納米顆粒的X-射線衍射圖。在10～80°的2θ范圍，觀察到三個樣品的Fe3O4有 6 個特征峰 (2θ =30.38°,35.58°,43.14°,53.48°,57.08°和 62.66°)， 峰位置在相應(yīng)的 2θ 值分別被索引為 (2,2,0)，(3,1,1)，(4,0,0)，(4,2,2),(5,1,1)和(4,4,0)，這與JCPDS國際衍射數(shù)據(jù)文件中心(JCPDS Card:19-629)的磁鐵礦數(shù)據(jù)庫非常匹配，表明存在合成的高結(jié)晶性材料顆粒的特定衍射峰。

2.2 吸附性能

2.2.1 吸附動力學(xué)

圖5顯示，F(xiàn)e3O4@SiO2-MIPs(MG)對MG的吸附量在30 min內(nèi)迅速增加，60 min后基本達(dá)到平衡，表明Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)具有良好的傳質(zhì)速度。

圖5 Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)的吸附動力學(xué)曲線Fig.5 The adsorption kinetics of Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)for 1 μg/mL of MG

2.2.2 飽和吸附容量

從圖6可以觀察到，F(xiàn)e3O4@SiO2-MIPs(MG)對MG的吸附量隨著MG初始濃度的增加而增大，較之于Fe3O4@SiO2-NIPs具有更高的吸附量。

圖6 Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)和Fe3O4@SiO2-NIPs對孔雀石綠的吸附等溫曲線Fig.6 The static adsorption curves of Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)and Fe3O4@SiO2-NIPs to MG

2.2.3 選擇性實驗

選取與MG具有相似分子結(jié)構(gòu)的CV和LMG進(jìn)行選擇性實驗。結(jié)果如圖7所示，CV、LMG在MIPs上的吸附量明顯低于MG，這意味著模板分子比其類似物分子具有更高的親和力。

圖7 MG、LMG和CV在兩種聚合物上的吸附量比較Fig.7 The selective recognition property of each compoundwith Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)and Fe3O4@SiO2-NIPs

2.3 實際樣品中孔雀石綠的富集與檢測

分別對養(yǎng)殖水和蝦肉進(jìn)行加標(biāo)，結(jié)果表明，未經(jīng)Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)富集的樣品均無法檢測到MG的特征峰（如圖8A和圖9A所示）。經(jīng)Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)富集后，均能夠明顯觀測到MG的幾個特征拉曼峰 （如圖8B和圖9B所示）。養(yǎng)殖水和蝦肉中MG的檢測限分別達(dá)到0.5 ng/mL和 6 ng/g。

圖8 養(yǎng)殖水加標(biāo)0.5 ng/mL MG富集前(A)及富集后(B)的SERS譜圖Fig.8 The SERS spectra of 0.5 ng/mL MG in aquaculture water before(A)and after(B)enrichment

圖9 蝦肉提取液加標(biāo)6 ng/g MG富集前(A)及富集后(B)的SERS譜圖Fig.10 The SERS spectra of 6 ng/g MG in shrimp extraction before(A)and after(B)enrichment

3 結(jié)論

該文結(jié)合分子印跡和磁性納米技術(shù)制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性分子印跡聚合物Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)，一系列結(jié)構(gòu)表征和吸附性能實驗，表明所制備的磁性分子印跡聚合物對MG具有優(yōu)異的分子識別能力和良好的選擇性吸附性能。比較Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)對養(yǎng)殖水和蝦肉樣品中MG富集前后的SERS響應(yīng)情況，結(jié)果表明Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)具有卓越的富集能力，實現(xiàn)養(yǎng)殖水和蝦肉中MG的高效富集，所建立的快速檢測方法具有廣闊的應(yīng)用推廣前景。

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