劉里,成飛翔
(曲靖師范學院化學化工學院,云南 曲靖 655011)
血清白蛋白是一類重要的運輸性蛋白,在生物體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)中含量非常豐富,幾乎占血清蛋白的60%[1].近年來采用光譜研究藥物與血清白蛋白的相互作用已成為生命科學、化學、藥學和臨床醫(yī)學領域的研究熱點,這對于了解生命過程、藥物作用機制及藥物分子設計等都具有重要作用[1-3].因結構上和人血清白蛋白(簡稱HSA)的相似性,牛血清白蛋白(簡稱BSA)被廣泛地運用于與藥物結合作用的研究[1].鹽酸川芎嗪(ligustrazine hydrochloride,簡稱LH),是傳統(tǒng)的活血化淤中藥里的代表藥材川芎中的主要活性成分,是治療用于缺血性腦血管疾病(如腦供血不足、腦血栓形成、腦栓塞)的常用藥[4-6].馬貴斌等[5]和張愛平等[6]研究了LH與HSA的相互作用,但主要集中在在兩個溫度下猝滅機理的判斷和熱力學研究上.而本文在優(yōu)化的條件下,從更多的方面系統(tǒng)地研究了3個不同溫度時LH與BSA的結合反應,除了作用機理的研究,還詳細地探討了兩者的結合位點、結合部位、相互作用力類型、藥物之間的協(xié)同性、對蛋白質(zhì)構象的影響以及金屬離子對LH與BSA結合反應的影響.這些研究對于闡明LH在機體內(nèi)的傳輸、代謝過程及藥理作用具有參考意義.
1.1 儀器與試劑熒光光譜儀:F-4600,日本日立公司,狹縫寬度10.0 nm,光電倍增管負電壓為400 V;紫外-可見光譜儀:Cary 50型,美國瓦里安技術中國有限公司;精密酸度計:pHS-3C,上海虹益儀器儀表有限公司.牛血清白蛋白:上??瑯由锛夹g有限公司,配制1.0×10-5mol/L的溶液;鹽酸川芎嗪:98%,阿拉丁?上海晶純生化科技股份有限公司,配制1.916 7×10-3mol·L-1的溶液;其他試劑都為分析純,實驗用水為超純水.
1.2 實驗方法依次加入2.0mL,pH=7.4,0.01mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液,1.5mL牛血清白蛋白標準溶液(1.0×10-5mol·L-1),2.0mLNaCl溶液(0.5mol·L-1)和不同體積的1.9167× 10-3mol·L-1的LH溶液于10 mL比色管中,稀釋到刻度,混合均勻,在熒光儀上以最大激發(fā)波長λex=280 nm光激發(fā)得到熒光發(fā)射光譜,最大發(fā)射波長λem在340 nm處.LH-BSA體系中加入0.5mL1.0×10-3mol·L-1金屬離子溶液,其他條件同上,測量熒光光譜.掃描同步熒光光譜(Δλ=15 nm和60 nm)記錄LH不存在時體系的熒光強度F0和與LH存在時體系的熒光強度F.測定物質(zhì)的摩爾濃度比為1∶1的BSA與LH溶液的紫外吸收光譜.
2.1 反應條件的優(yōu)化分別考察緩沖溶液種類、pH值、緩沖溶液的用量、BSA的濃度以及試劑加入順序?qū)w系的熒光強度的影響,結果表明,實驗選用pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液2.0mL調(diào)節(jié)酸度,1.5×10-6mol/LBSA作為反應濃度,LH→BSA→NaCl→Tris-HCl的加入順序時最佳,因此實驗按照優(yōu)化出來的結果進行實驗測量.
2.2 猝滅光譜BSA分子中的色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基能夠吸收270~300 nm的紫外光而發(fā)出熒光[4].圖1是固定BSA濃度,增加LH量的猝滅光譜圖.圖1中BSA峰形無明顯變化,強度卻明顯降低,λem略向藍移,說明LH對BSA的熒光有猝滅作用.
圖1 LH對BSA的猝滅光譜
圖2 3個不同溫度下的S-V圖
2.3 猝滅方式的研究
2.3.1 溫度對猝滅的影響 為了確認LH對BSA的猝滅機理,實驗用S-V公式[5-6]:F0/F=1+KSV[C]=1+Kqτ0[C]對不同溫度下熒光實驗數(shù)據(jù)進行了分析.式中KSV為猝滅常數(shù);Kq為表觀速率常數(shù),τ0為熒光體平均壽命,一般為10-8s數(shù)量級[5-6],[C]為LH的濃度.按照實驗方法在297 K,312 K和327 K時以F0/F對[C]作圖(如圖2所示),并根據(jù)公式算出3個溫度下的KSV和Kq列于表1.表中所有溫度下的Kq值比動態(tài)猝滅最大速率常數(shù)大兩個數(shù)量級,說明LH對BSA的猝滅不屬于動態(tài)猝滅.由圖2可知,3個溫度下的S-V曲線均呈良好的線性關系,且隨著溫度的升高,直線斜率即Ksv減小,正好與靜態(tài)猝滅機理相吻合.與文獻[5-6]報道的LH與HSA猝滅機理一樣,文獻中Ksv值也是104數(shù)量級.
若LH對BSA為靜態(tài)猝滅,應符合L-B方程[7-9]:(F0-F)-1=F0-1+(KLBF0[C])-1式中KLB為靜態(tài)猝滅結合常數(shù).(F0-F)-1-[C]-1作不同溫度下的L-B曲線,結果見表2.從表2可以看出,3個溫度下的相關系數(shù)都達到0.99以上,線性關系良好,其KLB值都在103數(shù)量級,表明LH與BSA由于發(fā)生靜態(tài)猝滅而結合力較強.以往文獻中討論較少.
表1 不同溫度下LH-BSA的S-V方程及相關系數(shù)
表2 L-B線性回歸方程的相關參數(shù)
2.3.2 紫外吸收光譜 另一判斷猝滅機理的方法是對比藥品加入前后熒光體吸收光譜的變化,動態(tài)猝滅僅僅影響熒光體的激發(fā)態(tài)而不影響熒光體的吸收光譜,而靜態(tài)猝滅時基態(tài)配合物的形成會引起熒光體吸收光譜的變化[5-9].圖2中BSA在210 nm附近有一個強吸收(曲線b),LH在此期間內(nèi)幾乎無吸收(曲線a).曲線c和曲線d幾乎重合(見圖3),表明LH并沒有改變BSA的紫外吸收光譜,與前面LH對BSA的猝滅是靜態(tài)猝滅過程的判斷相一致.
圖2 LH、BSA的紫外吸收光譜a、b分別為LH、BSA的吸收曲線
圖3 LH-BSA混合液的紫外吸收光譜c:LH-BSA混合液的吸收曲線,d:LH吸收曲線與BSA吸收曲線的疊加
2.4 結合常數(shù)Kb和結合位點數(shù)n如藥物小分子與生物大分子存在n個等同且獨立的結合位點,它們之間相互作用關系符合Langmuir公式:lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[C][7-9].由lg[(F0-F)/F]對lg[C]作圖,由直線截距可得結合常數(shù)Kb,斜率可求n,計算結果見表3.
由表3可看出:297 K,n≈1,表明LH與BSA可形成1個結合位點;312 K、327 K是n≈2,可形成2個結合位點,總體趨勢來看Kb也隨溫度升高而增加.從n和Kb的變化來看,溫度的變化對結合影響較大;n和Kb值都較大,溫度的提升有利于血清白蛋白攜帶著LH在體內(nèi)進行運轉(zhuǎn)、貯存和分配.與文獻[5]中報道的298K和308 K時n分別為1.06和1.05值相近.
表3 LH-BSA的K b和n
2.5 熱力學參數(shù)及作用力類型當溫度相差不大時,可以把焓變看成一個常數(shù),由不同溫度下的Kb,可根據(jù)熱力學方程[7-9]算出反應焓變ΔH、自由能ΔG和熵變ΔS,計算結果見表4.由表4可知,LH與BSA的熱力學參數(shù)ΔG<0,ΔH>0,ΔS>0表明LH與BSA為自發(fā)的,吸熱反應.根據(jù)Ross等[10]總結出的規(guī)律推測,LH與BSA主要以疏水作用力相結合,與文獻[5]中報道的LH與HSA結合力類型相符.
表4 LH對BSA作用在不同溫度下的熱力學參數(shù)值
2.6 結合位置的確定大多數(shù)藥物在BSA上結合部位為亞螺旋域ⅡA(含有酪氨酸和色氨酸)和亞螺旋域ⅢA(含有酪氨酸).為確定LH與BSA結合的具體位置采用對比λex=280 nm和λex=295 nm時的熒光光譜的方法[11-14].由圖4可知,兩種激發(fā)波長下,LH與BSA的猝滅曲線是獨立的,而且猝滅程度是λem=280 nm時比λem=295 nm時的大,這一現(xiàn)象說明在LH與BSA的猝滅反應中,色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中.進而可以確定,LH與BSA的結合位置主要位于亞螺旋域ⅡA.以往文獻中少見討論LH與HSA結合位置.
圖4 λex為280 nm和295 nm時LH-BSA的熒光光譜
2.7 藥物協(xié)同作用BSA具有多重結合部位,藥物與BSA結合時,BSA各結合部位之間存在相互影響作用,這種相互影響作用稱為藥物的協(xié)同作用[11-14],可用Hill方程[11-14]進行分析:lgD/(1-D)=lgK+nHlg[C],式中,D為結合飽和分數(shù),K為結合常數(shù),nH為Hill系數(shù).在熒光實驗中:D/(1-D)=B/(Bm-B),其中,B=(F0-F)/F0;1/Bm是1/B對1/[C]作圖的截距.CS-BSA的nH值的計算結果見表5.表5表明,藥物協(xié)同性對溫度變化不是很敏感,3個溫度下的nH都略小于1,說明LH與BSA結合過程中,LH分子之間呈現(xiàn)出弱的負協(xié)同作用,即前一個藥物分子結合到BSA位點上后,阻礙了后一個藥物分子與BSA的結合.以往文獻中少見討論LH與HSA藥物協(xié)同作用.
表5 3個溫度下體系的Hill系數(shù)n H(λ=280 nm)
2.8 LH對BSA構象的影響B(tài)SA的構象變化通常用同步熒光光譜來分析,根據(jù)λem的變化來確定[8-10]其熒光猝滅主要由何種氨基酸殘基起主導作用,而且氨基酸殘基的λem移動方向與其所處的疏水性也密切相關[8-10].酪氨酸殘基的特征熒光由Δλ=15 nm時測得的同步熒光光譜顯示;色氨酸殘基的特征熒光由Δλ=60 nm測得的同步熒光光譜顯示[8-10].在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm條件下,測定LH加入BSA之后的同步熒光光譜(見圖5).由圖可知,兩種氨基酸殘基的熒光強度都隨LH的不斷加入而逐漸降低,λem明顯向紫移,說明LH的加入改變了BSA的構象,使其色氨酸和酪氨酸殘基的疏水結構變小,導致肽鏈的伸展程度減弱,使得BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性減弱,疏水性增強[8-10].并且酪氨酸移動得更明顯,猝滅程度也更大說明LH與BSA的結合位點更加接近于酪氨酸殘基.LH也改變了HSA的構象[5],但具體結合位點更靠近哪個殘基未予討論.
2.9 金屬離子的影響人體內(nèi)存在著的金屬離子會參與生命過程,這些金屬元素不僅與蛋白質(zhì)有較強的結合力,而且與藥物也有一定的作用,金屬元素的存在會直接影響到藥物與蛋白質(zhì)的結合已有報道[14-15].本文中考察Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+對LH-BSA體系Kb和n的影響,結果見表6.從表6中可明顯看出,金屬離子不同,Kb′和n也不同,其原因可能是金屬元素本身的原子結構不同導致與BSA的結合力和結合位點的差異.除了Mg2+以外,其他4種離子加入后,Kb和n都增加了,即金屬離子對藥物與蛋白質(zhì)的作用產(chǎn)生了促進作用,其中Cu2+對結合體系的影響最大.原因可能是LH與BSA結合時,金屬離子是通過橋聯(lián)作用或形成“離子架橋”[14-15]方式參與其中的,即金屬離子先與LH結合,然后再與BSA結合,這種結合促進了LH與BSA的結合能力.Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+的加入會使LH與BSA的結合作用增大,有利于延長藥物的釋放時間,延長了藥效時間.Mg2+的加入與其他4種離子所產(chǎn)生的效果相反,減小了原本的Kb和n值,說明Mg2+對LH與BSA結合產(chǎn)生了競爭作用,可能是Mg2+與BSA先結合,占據(jù)了BSA的結合位點,從而抑制了BSA與藥物的結合作用,說明Mg2+對LH與BSA結合產(chǎn)生了競爭作用,抑制了BSA與藥物的結合作用,縮短了LH在血液中的停留時間.LH與HSA在Mg2+存在時Kb也減小,Zn2+和Cu2+存在時Kb也增大,與本研究結果一致.
圖5 LH與BSA的同步熒光光譜圖
表6 不同金屬離子的影響
用光譜法推斷出LH對BSA熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅,兩者靠疏水作用力相結合;通過計算求得了Kb和n值的大小,表明LH可以被BSA運輸;兩者結合位置位于BSA的亞螺旋域ⅡA中;在LH與BSA結合過程中,藥物分子之間有弱的負協(xié)同性;LH的存在誘導BSA的構象發(fā)生了一定程度的變化,結合位點更加接近于酪氨酸殘基;詳細研究了Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+對LH與BSA相互作用的影響.
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