劉春葉， 張雪嬌， 苗延青, 趙靈芝， 趙 敏

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,陜西西安 710021)

牛血清白蛋白(BSA)是血漿中含量最為豐富的載體蛋白，可與許多內(nèi)源性和外源性化合物結(jié)合而形成血漿功能，從而發(fā)揮藥物的藥理作用。鹽酸異丙腎上腺素(Hydrochloric Acid Isoproterenol，HAI)是腎上腺素類受體激動(dòng)藥，屬于經(jīng)典的β1、β2受體激動(dòng)劑，臨床主要用于房室傳導(dǎo)阻滯、心臟驟停和感染性休克、支氣管哮喘等心血管疾病的治療。由于只有游離的藥物才能到達(dá)靶器官而發(fā)揮藥效及藥理活性，因此藥物與血漿蛋白相互作用的動(dòng)力學(xué)過程在藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)中都起著重要的作用，對(duì)結(jié)合過程進(jìn)行定量研究對(duì)于藥代動(dòng)力學(xué)研究十分必要[1 - 3]。近年來，毛細(xì)管電泳法由于其高效、快速、樣品用量少等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物分子與生物分子，及生物分子與藥物之間相互作用的研究[4，5]。其中，生物分子與藥物相互作用的研究主要集中在酶、多肽等物質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)與藥物之間相互作用的研究較少[6 - 9]。

1 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的理論基礎(chǔ)[10，11]

藥物與蛋白的定量結(jié)合參數(shù)Kb由結(jié)合速率常數(shù)kon和離解速率常數(shù)koff的比值決定。設(shè)A物質(zhì)為HAI，B物質(zhì)為BSA，C物質(zhì)為HAI與BSA相互作用后的結(jié)合物。HAI與BSA的動(dòng)力學(xué)參數(shù)koff、kon和Kb可通過以下的方程來計(jì)算：

(1)

(2)

(3)

本研究中，a、b和c分別為 HAI、BSA 及其結(jié)合物的濃度，ha0對(duì)應(yīng)于HAI濃度為a0時(shí)的峰高，ha2，ha3，hb0，hb2和hb3代表的含義以此類推。t2和t3分別為不同運(yùn)行電壓下 HAI或 BSA 的出峰時(shí)間，可在保證 A 與 B 結(jié)合過程一致的前提下通過改變電壓獲得。

其中，a0、b0,、lin、t1、c2、c3的計(jì)算公式如下：

(4)

(5)

公式(4)和(5)中，lA，lB分別為HAI、BSA兩種物質(zhì)進(jìn)樣區(qū)段的長度(cm)，可通過公式(6)求出。

(6)

公式(6)中，P為進(jìn)樣壓力(Pa)、r為毛細(xì)管柱半徑(cm)、tin為進(jìn)樣時(shí)間(s)、ltotal為毛細(xì)管總長度(cm)。

(7)

公式(7)中，vA和vB分別為A和B兩種物質(zhì)的電泳遷移速度，由毛細(xì)管有效長度除以遷移時(shí)間獲得。

根據(jù)koff的定義，其計(jì)算公式為：

應(yīng)用實(shí)驗(yàn)方法對(duì)PVC材質(zhì)的桌布、文具袋、服裝袋、化妝品袋、餐具袋8個(gè)批次的樣品中6種重金屬元素含量進(jìn)行檢測，結(jié)果見表4。

(8)

公式(8)中，c2、c3的計(jì)算公式分別為：

(9)

(10)

改變分離電壓，獲得不同離解時(shí)間下HAI或BSA的出峰時(shí)間和峰高，按照公式(1)求得koff；利用koff和公式(8)求得c1；將c1和t1代入公式(2)求得kon。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

P/ACE MDQ高效毛細(xì)管電泳儀(美國，Beckman-Coulter公司)，配有二極管陣列檢測器(DAD)及32Karat色譜工作站；未涂層石英毛細(xì)管(65 cm×75 μm，有效長度60 cm，河北永年光導(dǎo)纖維廠)；UV-2012PSC紫外-可見分光光度計(jì)(上海優(yōu)尼科儀器有限公司);Sartorius電子分析天平(德國，Sartorius公司)；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(美國，Metter Toledo公司)。

牛血清白蛋白(BSA，中國藥品生物制品檢定所)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(分析純，天津大學(xué)科威公司)；Na2HPO4、NaH2PO4及NaOH均為分析純。哇哈哈純凈水(杭州娃哈哈白立食品有限公司)。供試品溶液及緩沖溶液使用前均用0.45 μm濾膜過濾。

鹽酸異丙腎上腺素注射劑(上海豐禾制藥有限公司)。

2.2 溶液的配制

精密稱取Na2HPO41.7901 g，NaH2PO40.7802 g，分別加水溶解并定容于250 mL容量瓶中，調(diào)節(jié)pH值，配成濃度為20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)。牛血清白蛋白(BSA)溶液：精密稱取0.1700 g BSA，加PBS溶解，定容于25 mL的容量瓶中，配成濃度為0.1 mmol/L的儲(chǔ)備液。鹽酸異丙腎上腺素(HAI)溶液：精密移取2 478 μL鹽酸異丙腎上腺素(0.5 mg/mL，即2.018 mmol/L)，用PBS定容于10 mL容量瓶中，得0.5 mmol/L的HAI樣品溶液。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

毛細(xì)管在使用前經(jīng)1 mol/L NaOH溶液、水、1 mol/L HCl、水各沖洗20、5、20、5 min。每兩次運(yùn)行之間，依次用0.10 mol/L NaOH溶液、水、緩沖溶液各沖洗毛細(xì)管3 min以消除由蛋白質(zhì)吸附造成的影響，最后用緩沖溶液平衡3 min。

電泳條件：運(yùn)行緩沖溶液20 mmol/L PBS(pH=7.4)；毛細(xì)管溫度：25 ℃；運(yùn)行電壓：測定ha2和t2時(shí)，電壓保持為20 kV；測定ha3和t3時(shí)，為保持結(jié)合過程的一致，先施加20 kV的電壓0.5 min，后調(diào)整電壓為15 kV；為了消除電壓的變化對(duì)峰高的影響，在實(shí)驗(yàn)中使用體積比為0.005%的DMF溶液(用緩沖液配制)作為參比；進(jìn)樣：壓力進(jìn)樣0.5 psi×10 s。進(jìn)樣次序?yàn)椋?.005% DMF→BSA→鹽酸異丙腎上腺素(測定ha0時(shí)，BSA區(qū)段被緩沖`液區(qū)段所代替)；檢測波長：214 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 ppKCE法

3.1.1內(nèi)標(biāo)的選擇和濃度的確定實(shí)驗(yàn)對(duì)丙酮和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行考察，丙酮在波長214 nm處的吸收很小，所以選擇DMF作為內(nèi)標(biāo)物。分別考察了0.5 mmol/L HAI與0.01%、0.005%、0.0025%DMF混合物的電泳情況。由于0.005%DMF與HAI峰高相近，故確定DMF濃度為0.005%。

3.1.2動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定將0.5 mmol/L HAI溶液與 0.1 mmol/L的 BSA溶液，按照2.3節(jié)條件進(jìn)行區(qū)段-區(qū)段毛細(xì)管電泳測定，采用兩者電泳峰與DMF的相對(duì)峰高進(jìn)行計(jì)算，每個(gè)數(shù)據(jù)平行測定3次，求平均值。圖1為HAI與 BSA 相互作用的電泳譜圖。20 kV時(shí)以DMF-PBS-HAI為樣品，由hHAI/hDMF可獲得參數(shù)ha0；20 kV時(shí)以DMF-BSA-HAI為樣品，由hHAI/hDMF可獲得參數(shù)ha2；15 kV時(shí)以DMF-BSA-HAI為樣品，由hHAI/hDMF可獲得參數(shù)ha3；由公式(6)可得la=1.04 cm，lb=1.04 cm。將上述各參數(shù)代入公式(1)和(2)可求算出koff和kon，見表1和表2。由公式(3)求出HAI與BSA的結(jié)合常數(shù)Kb為4.67×103L·mol-1。

圖1 鹽酸異丙腎上腺素與BSA相互作用的電泳譜圖

表1 區(qū)段-區(qū)段毛細(xì)管電泳中動(dòng)力學(xué)參數(shù)koff 的測定(n=3)

表2 區(qū)段-區(qū)段毛細(xì)管電泳中動(dòng)力學(xué)參數(shù)kon的測定(n=3)

Note：tHAIandtBSAin Table 2 are the migration times of HAI and BSA under 20 kV,respectively.

圖2 不同HAI藥物濃度下的BSA及DMF電泳譜圖

3.2 藥物為添加劑的ACE法測結(jié)合常數(shù)

對(duì)0.5 mg·mL-1的BSA樣品(含1%DMF)進(jìn)行電泳分離，電泳條件見2.3節(jié)。連續(xù)運(yùn)行6次，DMF的岀峰時(shí)間分別是：5.490、5.677、5.609、5.628、5.572、5.580 min。出峰時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.12%，符合毛細(xì)管電泳RSD<10%的要求，證明該系統(tǒng)可用。對(duì)0.5 mg·mL-1的BSA樣品(含1%DMF)，在藥物濃度分別為50、100、200、400、500 μmol·L-1的緩沖液中進(jìn)行分離，記錄BSA與DMF的出峰時(shí)間如表3所示，圖2為電泳譜圖。

M=μnet/μeo=(μeo+μ)/μeo=teo/tP+1

(11)

方程(11)中，μeo是電滲淌度，μnet表示溶液的凈淌度，μ為蛋白淌度，teo和tp分別是中性內(nèi)標(biāo)和蛋白的出峰時(shí)間。

在此基礎(chǔ)上得到轉(zhuǎn)化的Scatchard方程：

1/△M=[1/(Ka·△Mmax)]·(1/[D])+1/△Mmax

(12)

其中，△M=M[L]-M[L]=0，△Mmax=MPL-M[L]=0

依據(jù)以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理如表3。以△M對(duì)1/[D]作圖，得線性回歸方程為：Y=-3.853X-23.20，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9989，依據(jù)公式求出結(jié)合常數(shù)Kb為6.02×103L·mol-1。

表3 藥物為添加劑的ACE結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理過程

4 結(jié)論

采用ppKCE和ACE兩種毛細(xì)管電泳法對(duì)HAI與BSA的結(jié)合作用進(jìn)行研究，兩種方法測定結(jié)合常數(shù)較好吻合。ACE法以藥物為添加劑，會(huì)對(duì)電滲流(EOF)產(chǎn)生影響從而影響樣品遷移時(shí)間，但采用淌度比(M)可克服這一缺點(diǎn)，該方法準(zhǔn)確性好，但需要配制系列藥物濃度的緩沖液，操作繁瑣；ppKCE法與ACE法相比，操作更簡便，只需改變進(jìn)樣順序即能同時(shí)對(duì)參數(shù)kon和koff進(jìn)行測定，對(duì)生物過程的動(dòng)力學(xué)描述、靶向藥物藥代動(dòng)力學(xué)的測定等提供依據(jù)，但該方法以假設(shè)兩種物質(zhì)相互作用的結(jié)合比為1∶1為前提。