曹艷平, 辛成龍, 季 萍

(山東大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院，山東省疾病預(yù)防控制中心,山東濟(jì)南 250014)

氯霉素是一種廣譜抗生素，由于其價格低廉且效果顯著，因此在畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面有一定應(yīng)用。但氯霉素存在嚴(yán)重的毒副作用，容易引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥、新生兒灰色綜合癥等疾病，目前世界許多國家都禁止在食用動物飼養(yǎng)和治療中使用氯霉素，其獸藥殘留最大限量(MRL)為“不得檢出”，歐盟委員會決議(2003/181/EC)規(guī)定氯霉素的最低要求執(zhí)行限量為0.3 μg/kg，其陽性結(jié)果必須經(jīng)過質(zhì)譜確證。常用的質(zhì)譜法有氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)[1 - 3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)[3 - 8]。

本文建立了同位素稀釋氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定蝦仁中氯霉素，方法采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，有效排除了復(fù)雜本底對檢測結(jié)果的干擾，極大地提高了檢測靈敏度。加入同位素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校準(zhǔn)和消除由于操作條件的波動而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，采用反吹技術(shù)，無需凈化，提高了分析結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。當(dāng)稱樣量為5 g時，方法檢出限(S/N≥3)為0.1 μg/kg ，可滿足對氯霉素限量值的嚴(yán)格要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A/7000B氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Agilent公司)；460/H超聲波清洗器(德國,Elma)；HR2860攪拌機(荷蘭，Philips)；N-EVAP112氮吹儀(美國,Organmation Associates公司)。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(含量98.5%)、氘代氯霉素(D5-CAP,100 ng/μL丙酮溶液)，均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取6.3400 mg氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容于25 mL，得250 μg/mL儲備液,貯存于冰箱，臨用時用甲醇逐級稀釋成0.25 μg/mL使用液。氘代氯霉素溶液：用甲醇稀釋成1.0 μg/mL使用液。丙酮、乙酸乙酯、乙睛均為色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司；正庚烷、甲醇為色譜純級，Merck公司；N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1)，Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器分析條件

色譜條件：HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent公司)；在進(jìn)入質(zhì)譜端口前，使用微板流路控制裝置由超低死體積(Ultimate Union)吹掃連接一根未涂漬固定液的毛細(xì)管柱(1.5 m×0.18 mm)，其末端通入質(zhì)譜檢測器；載氣：高純氦氣，流量1 mL/min；柱溫：100 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至270 ℃，保持8 min ；反吹1.5 min ；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源(EI)溫度：250 ℃，電子轟擊能量：70 eV,傳輸線溫度：280 ℃，溶劑延遲時間：8 min。氯霉素分析參數(shù)如下：兩個選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)通道：m/z225→208、m/z225→178，碰撞能量分別為5、10 eV；D5-氯霉素的SRM通道：m/z230→213、m/z230→183，碰撞能量分別為5、15 eV。

1.3 樣品處理方法

稱取粉碎后的樣品5 g(精確到0.01 g),加內(nèi)標(biāo)氘代氯霉素使用溶液50 μL，以乙酸乙酯20.0 mL超聲提取20 min，過濾，取10.0 mL濾液，60 ℃水浴氮氣吹干，加0.5 mL甲醇、4 mL 1 mol/L NaCl溶液，超聲1 min,以2 mL正己烷進(jìn)行脫脂二次，用3 mL、2 mL乙酸乙酯提取水相，合并提取液，氮氣吹干，待衍生。加入100 μL衍生劑 BSTFA+TMCS(99+1)，渦旋混合1 min，在70 ℃烘箱中加熱30 min，氮氣吹干，加入100 μL正庚烷，渦旋混合1 min，轉(zhuǎn)移至帶有100 μL玻璃插管的樣品瓶中，進(jìn)行GC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

氯霉素易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙睛等有機溶劑。本實驗用乙酸乙酯對氯霉素進(jìn)行加標(biāo)回收實驗(n=6)，加標(biāo)10 ng的絕對回收率為80.1%，而乙睛為50.7%，因此用乙酸乙酯作為提取溶劑。用正己烷除去與氯霉素同時被提取的脂類物質(zhì)，若有乳化現(xiàn)象，可進(jìn)行離心使分層明顯，棄去正己烷層。無需經(jīng)過固相萃取柱凈化，前處理過程簡便有效快速，同時得到較高的回收率和重現(xiàn)性。

2.2 質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

圖1為氯霉素衍生物全掃描質(zhì)譜圖，選擇基峰m/z225為母離子，其子離子分別為m/z208、178，將碰撞能量設(shè)定為5、10、15、20、25、30 eV進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果最佳碰撞能量分別為5、10 eV。圖2為D5-氯霉素衍生物全掃描質(zhì)譜圖，選擇基峰m/z230為母離子，同樣方法優(yōu)化出最佳碰撞能量分別為5、15 eV。

圖1 氯霉素衍生物的全掃描質(zhì)譜圖

圖2 D5-氯霉素衍生物的全掃描質(zhì)譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別吸取0.25 μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、10、20、40、100 μL于3 mL離心管中作為標(biāo)準(zhǔn)系列，相當(dāng)于測定液中氯霉素的質(zhì)量分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0 ng，分別加入25 μL內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)行測定；以氯霉素衍生物m/z225→208峰面積與D5-氯霉素衍生物m/z230→213峰面積比值(y)對氯霉素質(zhì)量(x,ng)進(jìn)行線性回歸計算，回歸方程為：y=7.79×10-3x+3.15×10-3(r=0.9991)。方法檢出限(S/N≥3)為0.1 μg/kg。

2.4 回收實驗與精密度

用未檢出氯霉素殘留的空白蝦仁樣品做加標(biāo)回收實驗(n=6)，內(nèi)標(biāo)加入量為25 ng,結(jié)果見表2

表2 氯霉素的加標(biāo)回收率及精密度

2.5 凈化效果比較

同一樣品分別取二組(n=6)進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，均加標(biāo)10 ng，一組采用本文建立的方法提取后未凈化衍生測定，另外一組采用提取后C18固相萃取柱凈化后衍生測定，兩組的回收率無顯著差異，對二組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，t=0.0725，查t界值表得t0.001，5(雙側(cè))=6.869，因t0.001,在α=0.05水平處，兩組無明顯差異。

2.6 反吹的應(yīng)用

采用反吹技術(shù)可以從色譜柱中除去高沸點物質(zhì)，在目標(biāo)化合物出峰后，將后流出的組分從進(jìn)樣口的分流放空口中反吹出去，使其不進(jìn)入質(zhì)譜檢測器，反吹可降低化學(xué)噪音和分析時間，提高檢測效率。實驗連續(xù)測定120余份蝦仁樣品后，檢測器等整個系統(tǒng)靈敏度未下降。

3 結(jié)論

采用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜，以多反應(yīng)監(jiān)測模式測定氯霉素，降低了復(fù)雜本底對檢測結(jié)果的干擾。方法樣品處理簡便、內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確，適合氯霉素的測定,采用反吹技術(shù)可降低化學(xué)噪音，有效保護(hù)質(zhì)譜檢測器。