嚴(yán)拯宇， 黃 玉， 王 瑞， 廖聲華

(中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院,藥物質(zhì)量安全與預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 211198)

恩替卡韋(2-氨基-9-[(1S,3R,4S)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲基環(huán)戊基]-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮-水合物)是一種鳥嘌呤核苷類似物，能夠有效和選擇性地對(duì)抗乙肝病毒，比拉米夫定和阿德福韋能更快、更有效地抑制乙肝病毒的復(fù)制[1]。目前已有恩替卡韋原料藥含量及有關(guān)物質(zhì)測(cè)定[2,3]、恩替卡韋膠囊的含量測(cè)定[4]、恩替卡韋分散片及其有關(guān)物質(zhì)測(cè)定[5-7]等報(bào)道。但口服液劑型的恩替卡韋有關(guān)物質(zhì)的研究未見報(bào)道。由于口服液輔料和工藝的改變，可能會(huì)帶入一些雜質(zhì)，而藥品中的雜質(zhì)成分直接關(guān)系到藥品的安全性問題，因此控制藥品中雜質(zhì)含量是至關(guān)重要的。恩替卡韋原料藥中主要含有3種非對(duì)映異構(gòu)體，即雜質(zhì)A(2-氨基-9-[(1R，3R，4S)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲基環(huán)戊基]-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮)、雜質(zhì)B(2-氨基-9-[(1R，3R，4R)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲基環(huán)戊基]-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮)、雜質(zhì)C(2-氨基-9-[(1S，3R，4R)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲基環(huán)戊基]-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮)。主成分及雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 恩替卡韋及雜質(zhì)A、B和C的結(jié)構(gòu)式

本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)，建立了準(zhǔn)確、靈敏的梯度洗脫方法[8]，采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)的含量，保證制劑的安全性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀(日本，島津公司)，配有SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器(DAD)；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150×4.6 mm，3.5 μm)(美國(guó)，Agilent)；BT25S型電子天平(賽多利斯)。

恩替卡韋(93.7%，ID：NL8U-DR63)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，用于含量測(cè)定。雜質(zhì)A對(duì)照品(96.3%，批號(hào)：20140415)、雜質(zhì)B對(duì)照品(97.7%，批號(hào)：20140425)、雜質(zhì)C對(duì)照品(99.6%，批號(hào)：20140410)，均購(gòu)于海門慧聚藥業(yè)有限公司。乙腈(色譜純，德國(guó)Merk公司)，三氟乙酸(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)。

恩替卡韋原料藥、口服液(規(guī)格：50 μg/mL，批號(hào)：131022、131023、131024)及空白輔料由江蘇漢晨藥業(yè)提供。市售口服液(規(guī)格：50 μg/mL，批號(hào)： 3E76102)購(gòu)自百時(shí)美施貴寶公司。

1.2 溶液制備

1.2.1對(duì)照品溶液取恩替卡韋對(duì)照品10.0 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水超聲溶解后稀釋至刻度，移取5.00 mL于10 mL容量瓶中，加水定容、即得恩替卡韋對(duì)照品溶液。分別取雜質(zhì)A、B、C對(duì)照品各1.00 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，配制單個(gè)雜質(zhì)儲(chǔ)備液，移取0.125 mL,置于10 mL容量瓶中,加水定容、分別得雜質(zhì)A、B、C對(duì)照品溶液。再精密移取各儲(chǔ)備液適量，混合均勻，得系統(tǒng)適用性溶液(含主成分50.0 μg/mL和雜質(zhì)A、B、C各0.25 μg/mL)。

1.2.2供試品溶液口服液和空白輔料經(jīng)濾頭(0.45 μm)過(guò)濾后，直接進(jìn)樣測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱；以體積比為97∶3∶0.15的水-乙腈-三氟乙酸為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B；梯度洗脫條件:0～3.5 min,100%A;3.5～25 min,100%～94.0%A;25～26 min,94.0%～89.2%A;26～28 min,89.2%～76.0%A;28～48 min,76.0%～70.0%A;48～50 min,70.0%～100%A;50～60 min,100%A;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量:20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件考察

取系統(tǒng)適用性溶液、口服液和空白輔料各20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖(圖2)。系統(tǒng)適用性色譜圖中，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度RS為2.557，理論板數(shù)N以恩替卡韋峰計(jì)為21 832，分離效果與峰對(duì)稱性均較理想，能滿足有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的要求。

圖2 系統(tǒng)適用性溶液的HPLC圖

2.1.1流動(dòng)相的選擇參照文獻(xiàn)方法[8]，選用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，記錄的色譜圖顯示較大的梯度干擾峰，改變進(jìn)樣梯度、更換新的流動(dòng)相、色譜柱并沖洗管路后，梯度峰仍然存在。根據(jù)恩替卡韋片國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[9]，選用水-乙腈-三氟乙酸為流動(dòng)相A并調(diào)節(jié)體積比和洗脫程序，當(dāng)三者體積比為97∶3∶0.15時(shí)，主成分與雜質(zhì)B的分離度達(dá)2.0以上，符合系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。

2.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣，在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明恩替卡韋和雜質(zhì)A、B、C在254 nm處均有較大吸收，故選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3溶液濃度的選擇由于口服液本身濃度僅50.0 μg/mL，故口服液不經(jīng)稀釋直接作為供試液。若自身稀釋對(duì)照濃度為0.1%，則主成分峰面積太小，因此選擇自身稀釋對(duì)照溶液為0.25 μg/mL。

2.2 檢測(cè)限和定量限

取系統(tǒng)適用性溶液，按稀釋法測(cè)得雜質(zhì)A、B和C的檢測(cè)限分別為7.22、7.30、7.50 ng/mL，分別相當(dāng)于恩替卡韋濃度的0.014%、0.015%、0.015%；雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C的定量限分別為24.1、24.3、25.0 ng/mL，分別相當(dāng)于恩替卡韋濃度的0.048%、0.049%、0.050%。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以水為溶劑配制含恩替卡韋主成分和雜質(zhì)A、B、C各2.50 μg/mL的混合儲(chǔ)備液，再用水稀釋分別配制10%、50%、75%、100%、125%、150%限度濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。以濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，雜質(zhì)A、B、C及恩替卡韋在24.08～361.0、24.33～364.9、25.00～375.0、23.40～351.0 ng/mL范圍呈良好線性?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)和相對(duì)校正因子見表1。

表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和相對(duì)校正因子

2.4 精密度試驗(yàn)

取100%標(biāo)準(zhǔn)系列溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得雜質(zhì)A、B、C的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.62%、2.5%和2.6%，精密度良好，符合有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的要求。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取6份口服液(批號(hào)：131023)，分別精密移取口服液各0.500 mL于100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，為0.5%自身稀釋對(duì)照溶液。取各口服液和0.5%對(duì)照溶液進(jìn)行重復(fù)性考察。結(jié)果口服液中未檢測(cè)出雜質(zhì)B和C；雜質(zhì)A、最大單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)的平均百分含量分別為0.04%(RSD=14%)、0.11%(RSD=11%)、0.23%(RSD=9.0%)，表明此方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取單個(gè)雜質(zhì)儲(chǔ)備液適量，配制雜質(zhì)對(duì)照溶液(分別含雜質(zhì)A、B、C各0.25 μg/mL)，與口服液分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)行色譜分析。雜質(zhì)對(duì)照溶液中，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C峰面積的RSD(n=8)分別為3.5%、1.5%、2.2%，口服液中未檢測(cè)到雜質(zhì)B和C，雜質(zhì)A、最大單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)峰面積的RSD(n=8)分別為9.2%、7.8%和8.0%，表明雜質(zhì)對(duì)照溶液和口服液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密吸取混合儲(chǔ)備液適量，配制回收率儲(chǔ)備液(含恩替卡韋主成分和雜質(zhì)A、B、C各5.00 μg/mL)。再用水稀釋，分別配制50%、100%、150%的回收率測(cè)定供試液，每個(gè)濃度各三份。同2.6中的方法，配制50%、100%、150%的自身稀釋對(duì)照液?；厥章式Y(jié)果見表2，3個(gè)添加水平下雜質(zhì)A、B、C的回收率均在70%～130%之間，滿足有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)要求。

表2 雜質(zhì)A、B、C的回收率結(jié)果

2.8 耐用性試驗(yàn)

改變系統(tǒng)參數(shù)如流動(dòng)相A中水-乙腈-三氟乙酸體積比(97∶3∶0.10、97∶3∶0.15、97∶3∶0.20)、流速(±0.1 mL/min)和柱溫(±2 ℃)等，各成分的保留時(shí)間會(huì)略有改變，但主峰不受相鄰雜峰的影響。另外，該系統(tǒng)對(duì)色譜柱要求較苛刻，由于主成分恩替卡韋和雜質(zhì)B難以分離，適當(dāng)添加三氟乙酸能改善峰形，減少拖尾。但由于三氟乙酸濃度為0.15%，流動(dòng)相的pH在2.0以下，因此對(duì)于色譜柱的pH耐受性要求較高。色譜柱選用Agilent ZORBAX SB-C18時(shí)，主成分恩替卡韋的峰和輔料峰、有關(guān)物質(zhì)峰均能同時(shí)測(cè)定。

2.9 峰純度檢查

分別取恩替卡韋口服液、空白輔料及原料藥適量，分別經(jīng)酸破壞(0.1 mol/L HCl，50 ℃水浴，2 h)、堿破壞(0.1 mol/L NaOH，60 ℃水浴，80 min)、氧化破壞(10% H2O2，80 ℃水浴，1 h)、光破壞(強(qiáng)光照射24 h)、熱破壞(沸水浴加熱1 h)處理，其中酸破壞和堿破壞先加堿或酸中和至中性，分別用水稀釋成含恩替卡韋濃度約為25 μg/mL的破壞供試液。另取口服液、空白輔料及原料藥適量，用水溶解并稀釋成未破壞供試液，進(jìn)行HPLC-DAD測(cè)定(圖3)。在所建立的色譜系統(tǒng)之下，恩替卡韋的色譜峰與分解、降解產(chǎn)物的分離良好；用DAD檢測(cè)器對(duì)恩替卡韋主峰的峰純度作出進(jìn)一步判斷，恩替卡韋的色譜峰是純的。

圖3 恩替卡韋口服液強(qiáng)降解試驗(yàn)HPLC圖

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

2.10 含量測(cè)定

采用0.5%自身對(duì)照法分別對(duì)三批和一批市售口服液進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，結(jié)果見表3。三批口服液中均未檢出雜質(zhì)B和C，批號(hào)131023、131024、131025中雜質(zhì)A的含量分別為0.04%、0.04%和0.05%，最大單個(gè)雜質(zhì)的含量分別為0.1%、0.1%和0.1%，總雜質(zhì)含量分別為0.2%、0.2%和0.3%；市售口服液中未檢出雜質(zhì)A、B和C，最大單個(gè)雜質(zhì)的含量為0.1%，總雜質(zhì)含量為0.2%。將單個(gè)雜質(zhì)的限度暫定為0.2%，總雜質(zhì)的限度定為0.5%。

3 結(jié)論

本研究建立了用HPLC-DAD測(cè)定恩替卡韋口服液中有關(guān)物質(zhì)的分析方法，該方法以加校正因子的主成分自身對(duì)照定量，精密度高、重復(fù)性好，可用于恩替卡韋口服液中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。