王彩榮， 王璟琳， 李 敏， 王 丹

(長(zhǎng)治學(xué)院化學(xué)系，山西長(zhǎng)治 046011)

血清白蛋白(SA)是動(dòng)物體內(nèi)的輸送蛋白，具有貯運(yùn)內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源小分子等重要生理功能，能和許多內(nèi)源性和外源性的物質(zhì)可逆結(jié)合。利用各種方法從不同角度考察SA與外源小分子之間的相互作用，已經(jīng)引起了生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)科研工作者的普遍關(guān)注[1]。

酰胺基在自然界中廣泛存在，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不可缺少的組成部分。由于酰胺基既能作為氫鍵給體(-NH-)，又能作為氫鍵受體(-C=O)廣泛地形成氫鍵，因此許多酰胺類化合物被設(shè)計(jì)成為高選擇性的人工受體，廣泛地用于分子識(shí)別[2]，成為配位化學(xué)的一個(gè)重要的配體的構(gòu)造單元。將吡啶基與酰胺基組裝在同一配體中不僅能增加有機(jī)配體的功能性，而且通過(guò)各種氫鍵作用容易得到結(jié)構(gòu)新穎和特殊功能的配合物[3 - 5]，但將它們應(yīng)用到模擬生命體的研究報(bào)道并不多見(jiàn)。本文采用熒光光譜法，研究了酰胺類化合物N,N-二(2-羧基苯基)-2,6-吡啶二甲酰胺(BCPD)與牛血清白蛋白(BSA)在不同溫度時(shí)的相互作用。證明了兩者相互作用的機(jī)理，并進(jìn)一步求得猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等重要信息，為進(jìn)一步深入展開(kāi)BCPD在生物體內(nèi)的相關(guān)研究提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

F-4600型熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；U-3900型紫外分光光度儀(日本，日立公司)。

N,N-二(2-羧基苯基)-2,6-吡啶二甲酰胺參照文獻(xiàn)方法[6]合成；牛血清白蛋白(分子量68 000，北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，用pH=7.4 Tris-HCl緩沖溶液配成1.0×10-4mol·L-1儲(chǔ)備液；其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

BCPD的熒光光譜測(cè)定：在室溫條件下，以pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液為介質(zhì)，用1 cm吸收池，溶液濃度為8.0×10-5mol·L-1；熒光激發(fā)波長(zhǎng)λex=355 nm，激發(fā)狹縫寬Wex=5 nm，發(fā)射狹縫寬Wem=10 nm。

熒光滴定：固定激發(fā)波長(zhǎng)λex=280 nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬Wex=Wem=2.5 nm，水浴恒溫，在250～500 nm范圍內(nèi)用F-4600型熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 BCPD的光譜性質(zhì)

圖1為BCPD在pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液中的紫外吸收光譜。從圖可知BCPD在300 nm附近有一寬吸收峰，歸屬于分子中羰基(C=O)的n-π*的躍遷。圖2為在選定熒光光譜測(cè)定條件下，Tris-HCl緩沖溶液中BCPD的熒光發(fā)射光譜。從圖中可以看出BCPD的發(fā)射峰為一寬峰，相對(duì)熒光強(qiáng)度較弱，最大發(fā)射在405～425 nm之間，屬于芳環(huán)的π*-π躍遷。該發(fā)射峰的位置不會(huì)影響2.2節(jié)中BSA的熒光滴定結(jié)果。

圖2 室溫下pH=7.4 Tris-HCl中BCPD的熒光光譜

圖3 Tris-HCl體系中BCPD滴定BSA的熒光光譜

2.2 BCPD對(duì)BSA的熒光滴定光譜

在熒光池中加入1.0×10-4mol·L-1BSA溶液10 μL，并用0.5 mol·L-1的pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液稀釋至2 mL。在λex=280 nm，Wex=Wem=2.5 nm條件下，取一定體積BCPD(8.0×10-4mol·L-1)溶液對(duì)體系進(jìn)行滴定。熒光滴定結(jié)果如圖3。圖中BSA的熒光發(fā)射峰值位于320 nm處，隨著BCPD的不斷滴加，BSA的熒光發(fā)生規(guī)律性猝滅，且在BCPD濃度較高時(shí)發(fā)生輕微紅移，表明BSA的內(nèi)源熒光被BCPD猝滅，紅移的原因可能是BCPD的加入使蛋白質(zhì)的骨架更加伸展所致。

2.3 熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種，無(wú)論動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程還是靜態(tài)猝滅過(guò)程，加入猝滅劑前后的熒光強(qiáng)度的比值F0/F與猝滅劑的濃度[Q]均呈線性關(guān)系，隨溫度的升高動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)增大，而靜態(tài)猝滅常數(shù)減小，以此判斷熒光猝滅類型[7]。

測(cè)定了溫度分別為291 K、296 K、301 K和306 K時(shí)BCPD對(duì)BSA的熒光滴定光譜，根據(jù)Stern-Volmer方程，以F0/F對(duì)[Q]作圖，得到BCPD對(duì)BSA作用的Stern-Volmer曲線，以此求得對(duì)應(yīng)溫度下的Stern-Volmer方程及KSV、Kq值，列于表1中。結(jié)果表明，不同溫度下的曲線線性關(guān)系較好，而且隨著溫度的升高，直線的斜率(即猝滅常數(shù))增大，表明BCPD對(duì)BSA的熒光猝滅過(guò)程為動(dòng)態(tài)猝滅。由于生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1，生物大分子的熒光壽命約為10-8s[8]。在實(shí)驗(yàn)溫度下Kq數(shù)量級(jí)均為1012，由此判斷該體系的猝滅機(jī)理似乎應(yīng)歸為靜態(tài)猝滅，但實(shí)驗(yàn)體系為離子溶液，離子強(qiáng)度是影響猝滅系數(shù)的重要因素，推測(cè)猝滅常數(shù)的增大是由于體系離子強(qiáng)度影響的結(jié)果[9]。

表1 不同溫度下BCPD對(duì)BSA的線性及相關(guān)參數(shù)方程

2.4 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

在猝滅過(guò)程中，假如生物分子有n個(gè)相似的獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)，熒光物質(zhì)與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n間的關(guān)系可由下式[10]得到：log[(F0-F)/F]=logKA+nlog[Q]。式中，F(xiàn)0、F分別為猝滅劑加入前后體系的熒光強(qiáng)度，KA為結(jié)合常數(shù)，[Q]t為加入猝滅劑的總濃度，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

以log[(F0-F)/F] 對(duì)log[Q]作圖，由直線的斜率和截距求得不同溫度下的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)KA見(jiàn)表2。表2中結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n都接近于1，說(shuō)明體系中BCPD與BSA形成了1∶1的復(fù)合物。結(jié)合常數(shù)KA在105～106數(shù)量級(jí)，說(shuō)明兩者為一強(qiáng)相互作用。

2.5 BSA與BCPD結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用類型判斷

當(dāng)溫度變化不大時(shí)結(jié)合反應(yīng)的焓變△H可以看作一個(gè)常數(shù)，根據(jù)公式：lnK=-△H/RT+△S/R，△G=△H-T△S=-RTlnK，求出了在不同溫度下的熱力學(xué)常數(shù)，結(jié)果列于表2。

根據(jù)Rossn等[11]總結(jié)出的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)，及生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律，可以判斷BCPD與BSA之間的作用力以疏水作用為主。

表2 不同溫度下BCPD和BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)常數(shù)

3 結(jié)論

采用熒光光譜法，在不同溫度下研究了N,N-二(2-羧基苯基)-2,6-吡啶二甲酰胺(BCPD)與牛血清白蛋白(BSA)在pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液中的相互作用。熒光滴定結(jié)果表明，體系的猝滅常數(shù)KSV隨溫度的升高而增大，BCPD對(duì)BSA的內(nèi)源熒光猝滅機(jī)理為動(dòng)態(tài)猝滅，兩者間結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1；測(cè)得四個(gè)不同溫度下的平均結(jié)合常數(shù)為3.82×106L·mol-1；熱力學(xué)參數(shù)表明兩者之間結(jié)合的作用力主要為疏水作用。