代婷婷， 林華萍， 董 曉， 刁雅潔， 石紅梅

(河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，河北石家莊 050017)

皮質(zhì)醇(Cortisol,Cor)又稱氫化可的松，它是一種主要由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌產(chǎn)生的糖皮質(zhì)激素，為一種應激激素，當機體受到感染、手術、麻醉、疼痛等各種刺激時，機體會產(chǎn)生應激反應，人體體液中的皮質(zhì)醇含量可作為觀察應激水平的指標。臨床上常將皮質(zhì)醇用作抗炎甾體類激素藥物，其藥理作用主要有抗炎、抗過敏和免疫抑制、抗核分裂等。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

IFFM-E型流動注射化學發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限責任公司)；1810-BC型石英自動雙重純水蒸餾器(江蘇省金壇市白塔石英玻儀廠)；FA1104型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)。

皮質(zhì)醇標準儲備液：準確稱取0.0125 g皮質(zhì)醇標準品(中國藥品生物制品檢定所)，溶于少量甲醇，用高純水定容至25 mL，濃度為1.38×10-3mol·L-1。魯米諾儲備液：準確稱取魯米諾標準品(Sigma公司)0.8860 g，溶于7 mL 1.0 mol·L-1NaOH溶液中，用高純水定容至250 mL，濃度為0.02 mol·L-1。Ni(Ⅳ)儲備液：按文獻方法[11]制備,儲備液濃度依據(jù)配合物在波長410 nm處的吸光度值及其摩爾吸光系數(shù)(ε=1.06×105L·mol-1·cm-1)，由公式A=εbc計算得到，濃度為2.23×10-3mol·L-1。Ni(Ⅳ)配合物應用液用高純水當天配制。實驗用水為高純水。

1.2 樣品處理

1.2.1皮質(zhì)醇注射液準確吸取皮質(zhì)醇注射液(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責任公司，標示量5 mg·mL-1300 μL于100 mL容量瓶中，用高純水定容，其有效成分濃度為15 μg·mL-1。

1.2.2尿樣處理取5 mL空白尿樣，加入PbO2攪拌10 min以去除尿酸、硫脲等，然后以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用C18固相萃取柱凈化后，取1 mL尿樣稀釋至100 mL，待測。

圖1 流動注射化學發(fā)光流路示意圖

用C18固相萃取柱分離富集待測尿液中皮質(zhì)醇的含量步驟如下：(1)活化：取1.5 mL水和1.5 mL甲醇依次滴加到固相萃取柱上，滴干，重復一次，進行固相萃取柱的活化；(2)上樣：取1 mL尿樣處理液滴加到固相萃取柱上；(3)洗滌：2 mL水，1 mL 10%甲醇，2 mL 20%丙酮依次洗滌；(4)洗脫：1 mL甲醇溶液洗脫；(5)洗脫液于45 ℃下氮氣吹干，溶于0.1 mL甲醇，用水定容于100 mL容量瓶中。

1.3 實驗方法

實驗流路如圖1所示。Ni(Ⅳ)溶液首先與魯米諾溶液經(jīng)三通管混合均勻并充分反應，產(chǎn)生發(fā)光信號，待基線穩(wěn)定后，通過進樣閥將皮質(zhì)醇溶液注入到Ni(Ⅳ)與魯米諾的混合液流中，記錄皮質(zhì)醇對Ni(Ⅳ)-魯米諾化學發(fā)光體系增敏的信號強度，以峰高定量。每次實驗前后均需用高純水將各流路的管道沖洗干凈，待用。

2 結果與討論

2.1 反應介質(zhì)及其濃度的影響

2.1.1魯米諾溶液濃度及pH的選擇考察了魯米諾溶液濃度在6.0×10-8～4.0×10-6mol·L-1(含0.01 mol·L-1NaOH)時皮質(zhì)醇對體系化學發(fā)光強度的影響。結果如圖2所示：隨著魯米諾濃度增大，皮質(zhì)醇溶液對體系的增敏作用增強。當魯米諾濃度達到6.0×10-7mol·L-1時，增敏作用最強。故選擇魯米諾的最佳濃度為6.0×10-7mol·L-1。

在NaOH溶液濃度為0.0001～0.02 mol·L-1范圍內(nèi)，考察了魯米諾溶液的pH值對體系發(fā)光強度的影響。結果如圖3所示：當魯米諾溶液中NaOH溶液的濃度為0.01 mol·L-1，即溶液pH=12.0時，體系的靈敏度最高。

圖2 魯米諾溶液濃度對體系化學發(fā)光強度的影響

圖3 魯米諾溶液pH值對化學發(fā)光強度的影響

2.1.2Ni(Ⅳ)溶液濃度及pH的選擇考察了Ni(Ⅳ)溶液濃度在1.0×10-8～2.0×10-5mol·L-1(含0.01 mol·L-1NaOH)范圍內(nèi)對該體系化學發(fā)光強度的影響(圖4)。結果表明：Ni(Ⅳ)溶液的最佳濃度為4.0×10-6mol·L-1。同時考察了NaOH濃度在0.0001～0.03 mol·L-1范圍內(nèi)Ni(Ⅳ)溶液pH對體系發(fā)光強度的影響(圖5)，隨著Ni(Ⅳ)溶液pH的增高，體系的化學發(fā)光強度迅速增強。實驗中發(fā)現(xiàn)Ni(Ⅳ)溶液pH在12.0～12.3范圍時，化學發(fā)光信號雖增強明顯，但基線噪聲較大，信號不穩(wěn)定。選擇Ni(Ⅳ)溶液中NaOH的濃度為0.008 mol·L-1即溶液pH=11.9時，皮質(zhì)醇對體系的增敏效果好且信噪比最好。

圖4 Ni(Ⅳ)溶液濃度對發(fā)光強度的影響

圖5 Ni(Ⅳ)溶液pH值對化學發(fā)光強度的影響

2.2 工作曲線、精密度與檢出限

在優(yōu)化條件下，對濃度為20 ng·mL-1的皮質(zhì)醇標準溶液平行測定11次，根據(jù)每次測定的相對化學發(fā)光強度，計算得到其相對標準偏差(RSD)為0.56%。

2.3 樣品分析

在優(yōu)化的條件下，即魯米諾濃度為6.0×10-7mol·L-1(含0.01 mol·L-1NaOH)，Ni(Ⅳ)濃度為4.0×10-6mol·L-1(含0.008 mol·L-1NaOH)時，對皮質(zhì)醇注射液溶液、已處理稀釋過的尿樣(尿樣取自三甲醫(yī)院中患有腎上腺皮質(zhì)功能減退癥病人。早8點靜脈滴入50 mg后2 h取其尿液，4 ℃保存，處理后測定)進行檢測，根據(jù)標準曲線線性方程計算得到：注射液中皮質(zhì)醇的含量為4.98 mg·mL-1；尿樣中皮質(zhì)醇的含量為8.36×10-7μg·mL-1。

2.4 回收率實驗

取9份皮質(zhì)醇注射液樣品溶液，每份0.1 mL，分別定容至100 mL。在其中依次加入皮質(zhì)醇標準品，制得低、中、高3個濃度水平的加標樣品，每個濃度平行測定3次，計算得回收率，回收率在86.7%～107.5%之間。結果見表2。

表2 樣品中皮質(zhì)醇加標回收率測定(n=3)

2.5 化學發(fā)光反應機理探討

實驗證明，魯米諾在pH=11左右有最佳發(fā)光效率。本研究采用Ni(Ⅳ)配合物做氧化劑，與魯米諾組成新的化學發(fā)光體系，該體系中Ni(Ⅳ)配合物既可氧化魯米諾產(chǎn)生發(fā)光(基線信號)，又可氧化皮質(zhì)醇，且與皮質(zhì)醇的氧化速度快于魯米諾，使體系化學發(fā)光強度顯著增強。Ni(Ⅳ)配合物的氧化能力與其濃度、pH在一定范圍內(nèi)呈正相關(濃度過大，配合物可能聚集；pH過高，配合物在溶液中的平衡可能改變，均可能使配合物氧化能力下降)。

從對該體系前期的研究[11]推斷，可能的化學發(fā)光反應機理為：Ni(Ⅳ)和魯米諾及皮質(zhì)醇的反應均為自由基反應，且皮質(zhì)醇與Ni(Ⅳ)反應較魯米諾與Ni(Ⅳ)的反應快的多，反應過程中皮質(zhì)醇產(chǎn)生的自由基轉(zhuǎn)移給魯米諾一部分，從而使魯米諾自由基增多，發(fā)光體的量增多，使得體系的發(fā)光強度增強。

3 結論

建立了Ni(Ⅳ)配合物流動注射化學發(fā)光新體系測定皮質(zhì)醇的新方法，對注射液和人體尿樣中的皮質(zhì)醇進行了測定，并對該體系可能的化學發(fā)光機理進行了分析。該方法簡單、靈敏、快速，可用于實際樣品中痕量皮質(zhì)醇的測定。