劉麗青，儀慧蘭*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

SO2處理激活龍眼葡萄果實采后防御應(yīng)答

劉麗青，儀慧蘭*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

以龍眼葡萄為材料，研究果實貯藏中防腐保鮮劑SO2處理對果皮組織氧化還原平衡、次生代謝途徑的影響。結(jié)果表明：使用SO2保鮮劑可使龍眼果實貨架期延長，SO2處理組葡萄果實完好率明顯高于對照組，脫粒和腐爛率低于對照組。貯藏期間SO2處理組果皮組織抗氧化能力提高，次生代謝途徑關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶活性增強，總花色苷含量略有升高，H2O2含量和丙二醛含量高于對照組。結(jié)果表明，SO2保鮮劑可激活葡萄果實細(xì)胞內(nèi)活性氧升高，介導(dǎo)果實細(xì)胞抗氧化能力增強，與植保素合成相關(guān)的次生代謝活性增強，從而使細(xì)胞防御能力提高，果實保鮮期延長。

葡萄果實；采后貯藏；SO2保鮮；防御應(yīng)答；次生代謝

鮮食葡萄汁多味美，含有大量的糖及蛋白質(zhì)、有機酸、礦物質(zhì)、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟價值和食療價值，受到廣大消費者的喜愛［1］。但由于其果粒皮薄多汁，含糖量高，在貯藏過程中易發(fā)生腐爛、脫粒、干梗等現(xiàn)象，降低了葡萄的品質(zhì)和商品價值［2］。目前，商用葡萄保鮮技術(shù)多種多樣，較為廣泛的是二氧化硫（SO2）熏蒸處理。SO2是傳統(tǒng)的葡萄保鮮劑，能抑制貯藏期間病原菌的感染、延緩果實衰老［1-3］。有學(xué)者認(rèn)為SO2對病原微生物可產(chǎn)生直接的毒作用，抑制病原菌生長繁殖，而近期研究發(fā)現(xiàn)SO2保鮮處理可激發(fā)葡萄果實內(nèi)與氧化還原和生物防御反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄改變［3］。紫外線和過氧化氫（H2O2）同樣具有氧化損傷和抑菌效應(yīng)，但對葡萄果實的保鮮效果不及SO2，說明SO2保鮮過程具有復(fù)雜的作用機制［3］，葡萄果實細(xì)胞基因的差異表達(dá)可能在SO2防腐保鮮作用中發(fā)揮功能。但目前SO2保鮮機制尚不清楚。

次生代謝是植物在長期進(jìn)化過程中對生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，在受到環(huán)境刺激如病原菌侵襲或非生物脅迫時，植物產(chǎn)生并積累次生代謝產(chǎn)物，用以增強自身的抵抗力?；ㄉ帐且活悘V泛存在于高等植物中的酚類化合物，為植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物。作為保護(hù)性色素花色苷可被生物（病菌）或非生物脅迫（低溫、紫外線等）誘導(dǎo)積累［4］。鮮食葡萄在采后貯藏過程中花色苷的含量變化不僅影響果實外在品質(zhì)，還會影響葡萄的食用安全性。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）是次生代謝途徑的關(guān)鍵酶，催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，進(jìn)而產(chǎn)生一系列具有結(jié)構(gòu)和防御功能的物質(zhì)（如植保素、木質(zhì)素、生物堿、植物激素等）；在脅迫條件下，PAL激活被認(rèn)為是植物細(xì)胞防御機制的一部分［5］。但SO2保鮮作用是否與果實花色苷含量和次生代謝有關(guān)少有報道。因此本實驗選取了PAL活性、總花色苷含量及抗氧化性進(jìn)行測定，探討SO2處理對葡萄貯藏生理的作用，為尋求更加安全的貯藏保鮮劑提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

田間采摘后，剔除個別損傷顆粒，選色度較為一致的龍眼葡萄果穗。

SO2制劑 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、巰基乙醇、苯丙氨酸、鹽酸、甲醇、碘化鉀均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TGL-16G離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；SB-3200超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2000型紫外-可見分光光度計 龍尼柯（上海）儀器有限公司；電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3方法

1.3.1SO2處理與實驗分組

將龍眼葡萄按每箱5 kg分裝，在0 ℃預(yù)冷12 h后，處理組放入SO2制劑，每箱1/4張葡萄速釋保鮮紙（含Na2S2O5約1.2 g）+8包葡萄控釋保鮮片（含Na2S2O5約6.8 g），對照組不放藥物，扎緊塑料袋口，于低溫保鮮庫中-1～0 ℃貯藏。觀察統(tǒng)計貯藏期間葡萄果實的脫粒率和腐爛率，根據(jù)對照組果實外觀品質(zhì)的變化，選取貯藏初期（果實新鮮，果皮光亮，品質(zhì)完好，好果率大于98%）、感病初期（好果率大于80%）和感病晚期（好果率低于70%）3 個時期外觀完好的果實，及同期用SO2保鮮劑處理的果實，從不同果穗中取果粒，水沖洗后錫箔紙包裹，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2指標(biāo)測定

1.3.2.1H2O2的測定

取葡萄果皮，采用Bhatt等［6］的方法測定H2O2含量。

1.3.2.2PAL活性的測定

取葡萄果皮，采用Romero等［7］的方法測定PAL活性。以吸光度變化0.01為苯丙氨酸解氨酶PAL活性單位（1 U=0.01Δ A290nm/（h·g））。

1.3.2.3總花色苷含量的測定

果皮總花色苷含量采用pH值示差法測定［8］。按式（1）、（2）計算花色苷含量。

式中：Mw為錦葵色素-3-葡萄糖苷摩爾分子質(zhì)量（493.2 g/mol）；DF為稀釋倍數(shù)；1為光程/cm；ε為摩爾消光系數(shù)（28 000 L/（mol·cm））。

1.3.2.4抗氧化能力的測定

組織提取液制備方法同總花色苷提取方法，用清除ABTS+·能力的測定方法［9］測定抗氧化能力。

1.3.2.5丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定

MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法進(jìn)行測定［10］。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

取3次生物學(xué)重復(fù)的檢測值，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，用鄧肯氏多重比較方法進(jìn)行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2　結(jié)果與分析

2.1 SO2處理對龍眼葡萄果實外觀品質(zhì)的影響

貯藏初期龍眼果實SO2處理組與對照組的好果率均在98%以上，隨著貯藏時間的延長，好果率開始下降，但對照組的降速明顯高于SO2處理組（圖1）。在貯藏71 d時，對照組好果率為76.8%，SO2處理組好果率為94.87%；貯藏95 d時，對照組好果率降至28.7%，而處理組好果率為90.11%?？梢姡琒O2處理可以有效提高貯藏期間葡萄果實的好果率，延長果實貨架期。

圖1　SO 1 SO2處理對葡萄果實好果率的影響Fig.1 Effects of SO2on good fruit rate of grape berries

2.2SO2處理對龍眼葡萄果皮H2O2含量的影響

從圖2可看出，加入保鮮劑SO2可引發(fā)葡萄果皮中H2O2含量升高，在貯藏95 d內(nèi)SO2處理組H2O2含量維持較高水平，而同期果實完好率保持在90%以上，說明SO2處理誘導(dǎo)果皮H2O2含量升高可能在果實貯藏保鮮中具有一定作用。隨貯藏時間的延長，對照組果實逐漸衰老，并開始腐爛，果皮中H2O2含量隨之升高。在貯藏95 d時，對照組與SO2處理組果皮組織中H2O2含量接近，但可能由于產(chǎn)生的機制存在差異，果實表現(xiàn)出完全不同的外觀特征。

圖2　SO 2 SO2處理對葡萄果皮HH2O2含量的影響Fig.2 Effects of SO2on H2O2content in grape skins

圖3　SO 3 SO2處理對葡萄果皮PAL活性的影響Fig.3 Effects of SO2on PAL activity in grape skins

2.3SO2處理對龍眼葡萄果皮PAL活性的影響

貯藏期間SO2處理組葡萄果皮中PAL活性高于對照組（圖3），即SO2處理組果皮細(xì)胞中次生代謝途徑增強。在95 d貯藏期內(nèi)，對照組PAL活性先升后降，38 d和71d間無顯著差異，但95 d時顯著降低。SO2處理組PAL活性在95 d內(nèi)維持較高水平，158 d時顯著降低。植物PAL途徑能合成多種保護(hù)性物質(zhì)，PAL活性增強有益于這些保護(hù)性成分的合成。對照組貯藏95 d與SO2處理組貯藏158 d果實品質(zhì)下降時均伴隨著PAL活性的降低，說明PAL活性對保護(hù)果實品質(zhì)的重要性。

2.4SO2處理對龍眼葡萄果皮總花色苷含量的影響

圖 44 SSOO2處理對葡萄果皮總花色苷含量的影響Fig.4 Effects of SO2on total anthocyanin content in grape skins

在整個貯藏期間，SO2處理組果皮中總花色苷含量高于對照組，并維持在較高水平（圖4）。貯藏初期對照組與SO2處理組果皮中總花色苷含量接近，但隨后對照組總花色苷含量逐漸下降，至71 d后顯著降低，而SO2處理組總花色苷含量維持穩(wěn)定并略有上升，因此隨著貯藏期延長，對照組與SO2處理組間總花色苷水平差異逐漸增大，產(chǎn)生顯著性差異。

2.5SO2處理對龍眼葡萄果皮抗氧化能力的影響貯藏期間SO2處理組葡萄果皮抗氧化能力（清除

圖5　SO 5 SO2處理對葡萄果皮清除ABTSABTS+·能力的影響Fig.5 Effects of SO2on antioxidant capacity in grape skins

ABTS+·）高于對照組（圖5）。在貯藏95 d內(nèi)，SO2處理組抗氧化能力相對平穩(wěn)，對照組抗氧化能力出現(xiàn)波動但沒有形成顯著差異。對照組貯藏71 d時可能因衰老或病原菌感染導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧水平升高（圖2），介導(dǎo)細(xì)胞抗氧化能力增強（圖5），但隨后因自身衰老或病原菌感染使細(xì)胞受損，抗氧化能力下降。

2.6SO2處理對龍眼葡萄果皮MDA含量的影響

圖 66 SSOO2處理對葡萄果皮MDA含量的影響Fig.6 Effects of SO2on malondialdehyde content in grape skins

龍眼葡萄果皮MDA含量檢測結(jié)果表明（圖6），貯藏期間SO2處理組果皮MDA含量高于對照組，貯藏95 d內(nèi)對照組和SO2處理組果皮MDA含量具有相似的變化趨勢。SO2處理組158 d與對照組95 d的MDA水平接近，可能與果實細(xì)胞生理衰老有關(guān)。

3　討 論

低溫和SO2保鮮劑的聯(lián)合使用，是目前廣泛使用、最為有效的葡萄貯藏保鮮手段。研究［11］表明，適宜的SO2濃度可有效抑制葡萄貯藏過程中病菌感染，降低果實呼吸強度，減少呼吸基質(zhì)消耗，抑制乙烯釋放，從而增加果實的耐貯藏性。葡萄在貯藏過程中會發(fā)生一系列的生理生化變化，也是葡萄果實成熟和衰老的重要表現(xiàn)。本實驗通過測定龍眼葡萄貯藏期間生理指標(biāo)的改變來探索SO2制劑對葡萄果實保鮮的生物學(xué)機制。

研究發(fā)現(xiàn)SO2處理組葡萄果實中H2O2水平、抗氧化能力、次生代謝途徑同期增強，可能在貯藏保鮮中發(fā)揮了重要作用。H2O2具有殺菌作用，SO2處理組細(xì)胞內(nèi)高水平的H2O2可穿過細(xì)胞膜作用于外部病原菌，抑制其生長繁殖或致死。胞內(nèi)一定水平的H2O2還可作為脅迫信號分子，誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生防御應(yīng)答，使抗氧化酶活性提高，還能刺激次生代謝途徑增強［12］。PAL是植物細(xì)胞次生代謝的第一個關(guān)鍵酶，連接初級代謝和苯丙烷類代謝，催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)，是合成植保素、木質(zhì)素等多種次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶［13］。次生代謝產(chǎn)物中，萜類、生物堿和酚類都是植保素，異黃酮類亦可作為真菌毒素，水楊酸、茉莉酸等可作為信號物質(zhì)參與植物生理。研究［14］發(fā)現(xiàn)，PAL對多種環(huán)境刺激應(yīng)答，啟動植物防御系統(tǒng)并產(chǎn)生異黃酮類和酚類等抗病物質(zhì)，如植保素對病原菌產(chǎn)生抑制作用，木質(zhì)素將病原菌隔絕使之無法侵犯植物體，在植物抗病中起化學(xué)屏障作用和植物抗毒素作用［15］。因此，本研究中SO2處理提高了葡萄果實中H2O2的水平，并可能通過活性氧信號分子激活了細(xì)胞防御系統(tǒng)，一方面激活抗氧化系統(tǒng)清除胞內(nèi)過量活性氧，另一方面誘發(fā)果皮PAL活性增強，使具有植保素作用的花色苷及其他次生代謝產(chǎn)物在貯藏期間保持較高水平，從而導(dǎo)致機體防御能力增強，果實生理衰老延緩。

花色苷分子中的酚羥基是其抗氧化作用的主要活性基團。酚羥基可有效清除脂類自由基，中斷脂類氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而防止脂質(zhì)過氧化作用［16］。由于花色苷具有清除自由基的能力，所以本實驗同時采取ABTS+·方法相應(yīng)測定花色苷提取液的抗氧化能力。實驗中SO2處理組葡萄果皮總花色苷含量和抗氧化能力均高于對照組，表明SO2處理延緩了花色苷的消退，維持了組織的抗氧化活性，該結(jié)果與前人的結(jié)果［17］一致。此外，研究［18-19］發(fā)現(xiàn)，施加植物激素對藍(lán)莓和草莓保鮮處理后，果實花色苷含量積累并維持較高水平的抗氧化活性，說明花色苷積累在果實采后保鮮中經(jīng)常發(fā)生，而同期提高的抗氧化能力可能對果實抗衰老生理有益?；ㄉ站哂星宄杂苫岣呖寡趸芰Φ墓πВ虼薙O2處理組葡萄果皮內(nèi)總花色苷含量維持較高水平有利于清除體內(nèi)代謝產(chǎn)生的自由基，抵御衰老引起的損傷，發(fā)揮貯藏保鮮作用。

植物遭遇逆境時細(xì)胞內(nèi)部活性氧水平提高，活性氧積累可能誘發(fā)細(xì)胞膜脂過氧化作用，使膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量提高［20］。本研究中SO2處理組果實MDA含量高于對照組，可能是由于SO2脅迫引發(fā)胞內(nèi)H2O2等活性氧分子水平提高，誘發(fā)了MDA含量的上升。但本研究室檢測貯藏期間葡萄果實中的糖分、總酸、VC的含量發(fā)現(xiàn)，SO2處理組各營養(yǎng)成分含量相對穩(wěn)定，其降幅明顯低于對照組，說明果實食用品質(zhì)保持在較好的范圍內(nèi)，MDA含量升高沒有對果實品質(zhì)產(chǎn)生明顯不利影響。綜上所述，SO2處理葡萄果實能增強果實細(xì)胞次生代謝途徑，提高組織抗氧化能力，維持果實內(nèi)部花色苷含量及其他營養(yǎng)元素的穩(wěn)定，發(fā)揮保鮮防腐作用。本結(jié)果為探索SO2保鮮作用機制提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

［1］ 李明娟， 游向榮， 文仁德， 等. 葡萄果實采后生理及貯藏保鮮方法研究進(jìn)展［J］. 北方園藝， 2013， 37（20）： 173-178.

［2］ 賀光祖， 張才智， 晏宇， 等. 葡萄貯藏保鮮技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2009， 38（22）： 339-343.

［3］ GIRAUD E， IVANOVA A， GORDON C S， et al. Sulphur dioxide evokes a large scale reprogramming of the grape berry transcriptome associated with oxidative signalling and biotic defence responses［J］. Plant， Cell and Environment， 2012， 35（2）： 11-13.

［4］ WINKEL-SHIRLEY B. Flavonoid biosynthesis. A colourful model for genetics， biochemistry， cell biology， and biotechnology［J］. Plant Physiology， 2001， 126（2）： 485-493.

［5］ 張寬朝， 金青. 苯丙氨酸解氨酶與其在重要次生代謝產(chǎn)物調(diào)控中的作用研究進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2008， 24（12）： 59-62.

［6］ BHATT D， NEGI M， SHARMA P， et al. Responses to drought induced oxidative stress in fi ve fi nger millet varieties differing in their geographical distribution［J］. Physiology and Molecular Biology for Plants， 2011， 17（4）： 347-353.

［7］ ROMERO I， MALDONADO R， MERODIO C， et al. Anthocyanin，antioxidant activity and stress-induced gene expression in high CO2-treated table grapes stored at low temperature［J］. Journal of Plant Physiology， 2008， 165（5）： 522-530.

［8］ 翦祎， 韓舜愈. 單一pH法、pH示差法和差減法快速測定干紅葡萄酒中總花色苷含量的比較［J］. 食品工業(yè)科技， 2012， 33（23）： 323-325.

［9］ 孟慶煥， 王化， 王洪政， 等. 牡丹種皮黃酮提取及對ABTS自由基清除作用［J］. 植物研究， 2013， 33（4）： 504-507.

［10］ 張志良. 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］. 北京： 高等教育出版社， 2009：227-228.

［11］ SANDUHU S S， JOHNSTON D E. Effects of package and storage conditions on the keeping quality of Perletle grapes［J］. Vitis， 1982， 29：97-107.

［12］ SUZUKI N， KOUSSEVITZKY S， MITTLER R， et al. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress［J］. Plant， Cell and Environment， 2012， 35： 259-270.

［13］ 馬俊彥， 楊汝德， 敖利剛. 植物苯丙氨酸解氨酶的生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代食品科技， 2007， 27（7）： 71-74.

［14］ WANG Lijun， MA Ling， DUAN Wei， et al. Individual and combined effects of CaCl2and UV-C on the biosynthesis of resveratrols in grape leaves and berry skins［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013， 61（29）： 7135-7141.

［15］ 林素英， 陳宇， 童麗華， 等. 羧甲基殼聚糖對枇杷果實保鮮效果的影響［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（18）： 312-316. doi： 10.7506/spkx/1002-6630-201318064.

［16］ 薛紅瑋， 陳向民， 牟德華. 花色苷類色素抗氧化活性研究進(jìn)展［J］. 食品研究與開發(fā)， 2009， 30（7）： 190-192.

［17］ 吳斌， 張玉麗， 程琳琳， 等. 鮮食葡萄花色苷的研究進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2012， 28（4）： 441-444.

［18］ HUANG Xiaojie， LI Jing， SHANG Hongli， et al. Effect of methyl jasmonate on the anthocyanin content and antioxidant activity of blue berries during cold storage［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2015， 95（2）： 337-343.

［19］ LI Dongdong， LUO Zisheng， MOU Wangshu， et al. ABA and UV-C effects on quality， antioxidant capacity and anthocyanin contents of strawberry fruit （Fragaria ananassa Duch.）［J］. Postharvest Biology and Technology， 2014， 90： 56-62.

［20］ 李志文， 張平， 劉翔， 等. 1-MCP結(jié)合冰溫貯藏對葡萄采后品質(zhì)及相關(guān)生理代謝的調(diào)控［J］. 食品科學(xué)， 2011， 32（20）： 300-306.

Sulfur Dioxide Induces Defense Response of Longan Grape Berries during Storage

LIU Liqing， YI Huilan*（School of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

The effect of preservative SO2on oxidation-reduction equilibrium capacity and secondary metabolism in grape berries of Longan cultivar during storage was explored. The results showed that application of preservative SO2extended the shelf life of grape berries. Their intactness was signifi cantly higher than that of the control grapes， and threshing and decay rate were also lower relatively. During SO2-fumigated storage， antioxidant capacity of grape skins was increased， the activity of phenylalanine ammonialyase （PAL）， a key enzyme involved in secondary metabolic pathways， was enhanced， and total anthocyanin content was elevated slightly. In addition， the contents of H2O2and malondialdehyde （MDA） in SO2-fumigated grape skin tissue were higher than those of the control group. These fi ndings indicated that reactive oxygen species （ROS）signals were activated in grape skin cells. Antioxidant capacity and the secondary metabolism associated with the synthesis of phytoalexin were increased by preservative SO2， thereby enhancing defense capabilities and leading to an extended shelf life of grape berries.

grape berries； postharvest storage； SO2storage； defense response； secondary metabolism

TS255.3

A

1002-6630（2015）18-0209-04

10.7506/spkx1002-6630-201518039

2015-01-04

國家自然科學(xué)基金面上項目（30870454；30470318；31371868）

劉麗青（1989—），女，碩士研究生，研究方向為果實保鮮。E-mail：1142292448@qq.com

儀慧蘭（1963—），女，教授，博士，研究方向為果實保鮮。E-mail：yihl@sxu.edu.cn