薛艷鋒，羅毅皓，劉祥軍，謝鳳蓮，蔣國(guó)斌，孫萬(wàn)成，*

（1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

金屬硫蛋白基因表達(dá)水平評(píng)估青海不同地區(qū)的重金屬污染程度

薛艷鋒1，羅毅皓2，劉祥軍2，謝鳳蓮2，蔣國(guó)斌2，孫萬(wàn)成2，*

（1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

為揭示青海不同地區(qū)重金屬污染的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，從玉樹、果洛、海晏、剛察、共和5個(gè) 地區(qū)的牦牛肝臟樣品中提取總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的作用下生成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)牦牛金屬硫蛋白基因的表達(dá)水平。若將剛察地區(qū)牦牛肝臟金屬硫蛋白cDNA實(shí)時(shí)熒光定量值作為對(duì)照組，2-ΔΔCt值設(shè)定為1時(shí)，則玉樹、果洛、海晏、共和地區(qū)的牦牛肝臟金屬硫蛋白cDNA實(shí)時(shí)熒光定量值分別為0.669、0.624、0.529、1.320，并且通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)測(cè)定的牦牛體內(nèi)金屬硫蛋白的含量，相互印證，從而更加準(zhǔn)確地評(píng)估青海不同地區(qū)牦牛機(jī)體重金屬暴露水 平，以便對(duì)牦牛產(chǎn)品安全進(jìn)行評(píng)價(jià)?；虮磉_(dá)和酶聯(lián)免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明，共和與剛察地區(qū)的重金屬污染可能較為嚴(yán)重。

金屬硫蛋白；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；基因表達(dá)；牦牛；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快，青海各地區(qū)也受到了重金屬不同程度的污染，且重金屬具有親脂性、難降解性和高富集性［1-2］，嚴(yán)重威脅著食品安全。金屬硫蛋白（metallothionein，MT），分子質(zhì)量為6 000～7 000 D，每個(gè)MT分子含有61 個(gè)氨基酸，可以結(jié)合7～12 個(gè)金屬離子［3］，是一種分子質(zhì)量低，疏基含量高，能大量結(jié)合重金屬離子的蛋白質(zhì)。MT分子有2 個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域α和結(jié)構(gòu)域β［4-5］，整個(gè)分子呈啞鈴狀。MT最早是由Margoshes等從馬的腎臟中發(fā)現(xiàn)并且分離出來(lái)的［6］，隨后在高等植物、真核微生物、原核微生物當(dāng)中也發(fā)現(xiàn)并且分離得到了MT［7］，證明了MT是普遍存在于各種生物體中［8-9］，李令媛等［10-11］也在大鯢、刺猬中也分離得到了MT。MT的生物學(xué)功能：清除自由基，抵抗電離輻射［12-14］，解毒［15］，參與微量元素的代謝［16-18］，調(diào)控機(jī)體免疫能力和生長(zhǎng)發(fā)育［19］。MT基因的表達(dá)受到多種因素的影響［20］，重金屬是最強(qiáng)的誘導(dǎo)劑［21］，可以將MT表達(dá)量提高成百上千倍，因此，MT可以作為生物體內(nèi)重金屬污染的一個(gè)重要的生物學(xué)標(biāo)志［22］，通過檢測(cè)生物體內(nèi)MT的含量變化，來(lái)預(yù)測(cè)生物體受重金屬污染的情況，已經(jīng)成為了近些年研究的熱點(diǎn)。但多數(shù)是測(cè)定水生生物體內(nèi)MT的含量來(lái)反應(yīng)水質(zhì)污染程度［23-26］，還沒有人通過測(cè)定牦牛體內(nèi)MT含量和MT基因的表達(dá)量來(lái)評(píng)估不同牧場(chǎng)的重金屬污染程度。

青海各個(gè)地區(qū)的牧場(chǎng)受到了重金屬不同程度地污染，從而使牦牛的肉和乳重金屬含量出現(xiàn)不同程度超標(biāo)，因此本實(shí)驗(yàn)通過MT基因?qū)崟r(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）表達(dá)差異分析，評(píng)估不同地區(qū)牦牛體內(nèi)重金屬的暴露水平。利用PCR技術(shù)研究MT基因的相對(duì)定量表達(dá)水平，即利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量測(cè)定牦牛肝臟中的MT。首先，從不同地區(qū)的牦牛肝臟中提取總RNA，然后在逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的作用下生成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，實(shí)施RT-PCR檢測(cè)MT基因的表達(dá)水平。同時(shí)，通過酶聯(lián)免疫（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）反應(yīng)，直接測(cè)定青海不同地區(qū)牦牛肝臟樣品中的MT含量，與前面通過實(shí)時(shí)定量測(cè)得的MT基因的表達(dá)水平對(duì)比，再次印證，從而保證得到MT含量的正確性。然后，根據(jù)MT含量，正確評(píng)估青海不同地區(qū)牦牛肉與乳的重金屬暴露水平，以便對(duì)牦牛肉乳品質(zhì)評(píng)價(jià)、食品安全及環(huán)境保護(hù)提出指導(dǎo)性的建議。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

分別從青海省的玉樹、果洛、海晏、剛察、共和這5 個(gè)地區(qū)，采集現(xiàn)殺的不同牦牛的肝臟組織（采集樣品所用的手術(shù)刀、鑷子等嚴(yán)格滅菌），迅速裝于冷凍管中，保存在液氮罐中，帶回實(shí)驗(yàn)室后，將樣品從液氮罐中取出，保存于-80 ℃冰箱中，備用。

氯仿、異丙醇、乙醇 上海友盛化工科技有限公司；RNase-free water、RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量染料 日本TaKaRa公司；MT ELISA試劑盒、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸鈉、聚丁二酸丁二醇酯緩沖液（pH 7.4） 上海江萊生物科技有限公司。

利用GenBank中介紹的牦牛（Bos grunniens）MT基因GenBank Accession No：AY513744，通過核心序列設(shè)計(jì)5'和3'端特異性引物利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1　牦牛MT基因cDNA克隆引物Table 1 cDNA cloning primers of yak metallothionein gene

1.2儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀、RT-PCR儀、核酸電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司；移液槍 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取

將超低溫凍結(jié)的RNA提取樣品（牦牛肝臟樣品）迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷過的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮冷卻，直至將樣品研磨成粉末狀；向研缽中加入1.5 mL的RNAiso Plus勻漿，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋；室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀；使用移液槍將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5 min；在12 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min；小心吸取上清液，使用移液槍轉(zhuǎn)移到新的離心管中（切勿觸及、吸取沉淀）；向上述勻漿裂解液中加入氯仿300 μL（RNAiso Plus的1/5體積量），用手劇烈振蕩15 s，待溶液充分乳化后，再室溫靜置5 min；在12 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min；吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切忌吸出白色中間層）；向上清液中加入等體積提前預(yù)冷過的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15～30 ℃條件下靜置10 min；12 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min；棄去上清液，緩慢地沿離心管壁加入提前預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液l mL（切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒，洗滌離心管管壁；在12 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min；使用移液槍小心棄去乙醇，切勿觸及沉淀，剩下的少量乙醇，讓其自然揮發(fā)除去。室溫干燥沉淀2～5 min，加入適量的RNA-free water溶解沉淀后，-80 ℃條件下保存。

1.3.2cDNA的合成

將提取到的牦牛肝臟樣品的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，主要參考TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，采用10 μL反轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37 ℃，15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）；85 ℃，5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。

1.3.3RT-PCR反應(yīng)

以合成的牦牛肝臟樣品的cDNA為模板，按TaKaRa試劑盒推薦方法在冰盒上進(jìn)行操作。加入引物MT1F1-MT1R1進(jìn)行RT-PCR，同時(shí)選擇內(nèi)參β-actinF1-β-actinR1進(jìn)行RT-PCR作為對(duì)照。兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：循環(huán) 1：預(yù)變性，95 ℃，30 s；循環(huán)40：PCR反應(yīng)，95 ℃，5 s，60 ℃，30 s。

1.3.4ELISA反應(yīng)

按照ELISA試劑盒，采用雙抗體夾心法測(cè)定樣品中MT水平。用純化的MT抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入MT，再與HRP標(biāo)記的MT抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化條件下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MT呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中MT含量。

2　結(jié)果與分析

2.1提取的RNA檢測(cè)

圖1　不同地區(qū)牦牛肝臟樣品RNA電泳圖Fig.1 RNA electrophoretogram of yak liver samples from different regions

提取出的不同地區(qū)牦牛肝臟樣品的總RNA在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果。由圖1可以清楚地看到28S、18S、5S三條亮帶，且28S條帶亮度大概是18S條帶亮度的2 倍。

2.2牦牛肝臟MT基因cDNA的合成

圖2　cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增成DNA的電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of DNA fragment amplifi ed from cDNA by PCR

圖2由提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，再通過普通PCR擴(kuò)增成DNA得到的電泳圖。利用在編碼區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)的牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ通用引物擴(kuò)增目的DNA，獲得約190 bp的DNA片段［27］，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DL5 000的Marker可以看出在100～250 bp之間。

2.3MT基因PCR熒光定量

表2　不同地區(qū)牦牛MT基因熒光定量PCRTable 2 Fluorescence quantitative PCR of metallothionein gene of yaks from different regions

表3　不同地區(qū)牦牛MT基因的Ct值對(duì)比（x±s）Table 3 Comparison of the Ct values of metallothiof yaks from different regions（x±s）

表3　不同地區(qū)牦牛MT基因的Ct值對(duì)比（x±s）Table 3 Comparison of the Ct values of metallothiof yaks from different regions（x±s）

地區(qū)玉樹果洛海晏剛察共和引物MT反應(yīng)Ct18.87±4.1321.80±4.9821.45±6.4715.63±0.3115.05±0.41內(nèi)參β-actin反應(yīng)Ct22.74±3.1925.58±4.0424.98±3.3420.10±0.3819.91±0.36

通過比較閾值法（2-ΔΔCt）進(jìn)行相對(duì)定量［22］。循環(huán)次數(shù)（cycle times，Ct）為樣品中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。以剛察地區(qū)的牦牛肝臟樣品作為對(duì)照樣，并將其2-ΔΔCt值設(shè)為1進(jìn)行閾值比較，如表2、3所示。

計(jì)算得出：玉樹：2-（-3.88+4.46）=0.669；果洛：2-（-3.78+4.46）=0.624；海晏：2-（-3.54+4.46）=0.529；共和：2-（-4.86+4.46）=1.320。

由上述公式計(jì)算得到的結(jié)果可以看到MT相對(duì)定量的拷貝數(shù)（圖3）。

本實(shí)驗(yàn)以青海省的玉樹、果洛、海晏、剛察、共和這5 個(gè)地區(qū)的牦牛肝臟為樣品，通過對(duì)MT的DNA重復(fù)3 次進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)法，測(cè)出它們的平均ΔCt值，再根據(jù)比較閾值法進(jìn)行相對(duì)定量得到最后的結(jié)果。

由圖3可以看出，共和地區(qū)的牦牛樣肝臟品中的MT相對(duì)定量的拷貝數(shù)最高，接下來(lái)依次是剛察、玉樹、果洛、海晏。由此可以得到，青海不同地區(qū)牦牛肝臟樣品中的MT含量從高到低依次為共和、剛察、玉樹、果洛、海晏。

圖3　MT相對(duì)定量拷貝數(shù)Fig.3 Relative quantitative copy number of metallothionein gene

根據(jù)測(cè)定的各個(gè)地區(qū)的Ct值，利用SPSS 16.0分析軟件計(jì)算得出5 個(gè)地區(qū)MT含量的差異顯著性如表4所示。

表4　不同地區(qū)牦牛MT含量差異顯著性分析Table 4 Signifi cance analysis on the difference in metallothionein contents of yak livers from different regions

表5　ELISA反應(yīng)測(cè)定的不同地區(qū)牦牛MT含量Table 5 Metallothionein contents of yak livers from different regions determined by ELISA

圖4　ELISA反應(yīng)測(cè)定的不同地區(qū)牦牛MT含量Fig.4 Metallothionein contents of yak livers from different regions determined by ELISA

由表5和圖4可知，ELISA反應(yīng)所測(cè)定MT的含量從高到低依次是：共和、剛察、果洛、海晏、玉樹，但是5個(gè)地區(qū)的含量差異都不顯著（P＞0.05）。

ELISA反應(yīng)測(cè)得的不同地區(qū)的牦牛樣品中MT的含量（圖4），也可以明顯看出，共和地區(qū)的牦牛樣品中MT含量比對(duì)照組高，而玉樹、果洛、海晏3 個(gè)地區(qū)牦牛MT的含量比對(duì)照組低，這也正好印證了通過相對(duì)定量法測(cè)定的不同地區(qū)牦牛體內(nèi)MT含量的差異對(duì)比?；虮磉_(dá)和ELISA反應(yīng)2 種方法的測(cè)定結(jié)果基本相符，提高了所測(cè)定MT含量結(jié)果的正確性和可信度。由于MT可以作為潛在的新型生物標(biāo)志物，用來(lái)評(píng)價(jià)重金屬對(duì)環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)的生物效應(yīng)，可以判斷出共和地區(qū)牦牛重金屬污染嚴(yán)重。而造成污染的原因可能有：工業(yè)化進(jìn)程加快及礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用；礦產(chǎn)企業(yè)多為小企業(yè)，缺乏必要的技術(shù)管理及生產(chǎn)設(shè)備，出現(xiàn)隨意排放污水及礦業(yè)廢渣的情況；青海的畜產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)評(píng)估與預(yù)警工作基礎(chǔ)薄弱，對(duì)有害因素的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與評(píng)估尚處起步階段。

3　結(jié) 論

根據(jù)MT基因的表達(dá)水平可知，玉樹、果洛、海晏、剛察、共和5 個(gè)地區(qū)的樣品ΔCt的平均值分別為-3.88、-3.78、-3.54、-4.46、-4.86。利用2-ΔΔCt進(jìn)行比較，將剛察樣品的2-ΔΔCt設(shè)定為1，再通過計(jì)算得到玉樹、果洛、海晏、剛察、共和5 個(gè)地區(qū)樣品的2-ΔΔCt分別為0.669、0.624、0.529、1.000、1.320。根據(jù)ELISA反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果可知，玉樹、果洛、海晏、剛察、共和5 個(gè)地區(qū)的樣品MT含量分別為732.82、746.97、739.61、776.96、778.66 ng/L。

共和地區(qū)牦牛MT基因表達(dá)量比對(duì)照組高，表明共和地區(qū)牦牛肝臟含有的MT比對(duì)照組多。玉樹、果洛、海晏3 個(gè)地區(qū)牦牛MT表達(dá)量比對(duì)照組低，表明玉樹、果洛、海晏3 個(gè)地區(qū)牦牛肝臟含有的MT比對(duì)照組低。并且，ELISA反應(yīng)測(cè)定的結(jié)果也是共和MT含量高于對(duì)照組，而玉樹、果洛、海晏MT含量低于對(duì)照組。因此，可以判定青海省共和、剛察2個(gè)牧場(chǎng)的重金屬污染程度較重，而玉樹、果洛、海晏的重金屬污染程度較輕。對(duì)于重金屬污染程度較重的共和、剛察地區(qū)必須嚴(yán)格規(guī)范礦產(chǎn)資源的開發(fā)和利用，嚴(yán)防工業(yè)污水和礦產(chǎn)廢渣的隨意排放，另外，必須加強(qiáng)這2 個(gè)地區(qū)畜產(chǎn)品的安全評(píng)估，確保食品質(zhì)量安全。

［1］ WANG Wenxiong， KE Caihuan. Dominance of dietary intake of cadmium and zinc by two marine predatory gastropods［J］. Aquatic Toxicology， 2002， 56（3）： 153-165.

［2］ 畢春娟， 陳振樓， 許世遠(yuǎn)， 等. 長(zhǎng)江口潮灘大型底棲動(dòng)物對(duì)重金屬的累積特征［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2006， 17（2）： 309-314.

［3］ 蔡震峰， 任鳳蓮. 金屬硫蛋白的研究進(jìn)展［J］. 應(yīng)用化工， 2007， 36（2）：187-190.

［4］ 茹炳根. 一種新型食品添加劑： 金屬硫蛋白［J］. 精細(xì)與專用化學(xué)品，2002， 10（8）： 15-16.

［5］ ZHOU Yuanjiao， LI Lingyuan， RU Binggen. Expression purifi cation and characterization of β domain and β domain dimmer of metallothionein［J］. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-General Subjects， 2000， 1524（2）： 87-93.

［6］ 劉志勇， 魏國(guó)林. 金屬硫蛋白研究進(jìn)展［J］. 江西科學(xué)， 2004， 22（6）：105-109.

［7］ 劉安玲， 朱必鳳. 金屬硫蛋白的研究進(jìn)展［J］. 韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 2001， 22（3）： 86-91.

［8］ MARGOSHES M， VALLEE B L. A cadmium protein from equine kidney cortex［J］. Journal of the American Chemical Society， 1957，79（17）： 4813-4814.

［9］ COBBETT C， GOLDSBROUGH P. Phytochelatins and metallothioneins：roles in heavy metal detoxifi cation and homeostasis［J］. Annual Review of Plant Biology， 2002， 53（1）： 159-182.

［10］ 李令媛， 馬宏安， 安鈺， 等. 鎘誘導(dǎo)大鯢肝臟與腸金屬硫蛋白的分離純化與鑒定［J］. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 1996， 32（4）： 534-541.

［11］ 李令媛， 馬宏安， 呂迎春， 等. 金屬誘導(dǎo)條件下刺猬各組織器官金屬硫蛋白含量比較分析［J］. 獸類學(xué)報(bào)， 1995， 15（1）： 65-70.

［12］ 田曉麗， 郭軍華. 金屬硫蛋白的研究進(jìn)展［J］. 國(guó)外醫(yī)學(xué)： 藥學(xué)分冊(cè)，2005， 32（2）： 119-124.

［13］ 郝守進(jìn)， 茹炳根. 金屬硫蛋白及其在食品工業(yè)應(yīng)用中的研究進(jìn)展［J］.食品 與發(fā)酵工業(yè)， 2002， 28（8）： 62-67.

［14］ CAI L， SATOH M， TOHYAMA C， et al. Metallothionein in radiation exposure： its induction and protective role［J］. Toxicology， 1999，132（2）： 85-98.

［15］ PARK J D， LIU Y， KLAASSEN C D. Protective effect of metallothionein against the toxicity of cadmium and other metals［J］. Toxicology， 2001， 163（2）： 93-100.

［16］ 閆海亮， 張晶， 丁洪浩， 等. 金屬硫蛋白及其誘導(dǎo)、分離純化研究進(jìn)展［J］. 飼料工業(yè)， 2007， 28（24）： 52-54.

［17］ SCHMIDT C， BEYERSMANN D. Transient peaks in zinc and metallothionein levels during differentiation of 3T3L1 cells［J］. Archive of Biochemistry and Biophysics， 1999， 364（1）： 91-98.

［18］ COYLE P， PHILCOX J C， ROFE A M. Metallothionein null mice absorb less Zn from an egg white diet， but a similar amount from solutions， although with altered inter tissue Zn distribution［J］. The Journal of Nutrition， 1999， 129（2）： 372-379.

［19］ PRASAD A S. Role of metallothioneins in human health［J］. Journal of Laboratory and Clinical Medicine， 1992， 120（3）： 357-358.

［20］ 陳春， 周啟星. 金屬硫蛋白作為重金屬污染生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 28（3）： 425-432.

［21］ 陳春， 周啟星. 蚯蚓金屬硫蛋白定量PCR檢測(cè)方法及其分子診斷［J］.中國(guó)環(huán)境科學(xué)， 2011， 31（8）： 1377-1382.

［22］ ROMERO-ISART N， VASAK M. Advances in the structure and chemistry of metallothioneins［J］. Journal of Inorganic Biochemistry，2002， 88（3）： 388-396.

［23］ CHAN K M. Concentrations of copper， zinc， cadmium and lead in rabbit fish （Siganus oramin） collected in Victoria Harbour， Hong Kong［J］. Marine Pollution Bulletin， 1995， 31（4）： 277-280.

［24］ PEDERSEN S N， LUNDEBYE A K， DEPLEDGE M H. Field application of metallothionein and stress protein biomarkers in the shore crab （Carcinus maenas） exposed to trace metals［J］. Aquatic Toxicology， 1997， 37（2）： 183-200.

［25］ QUIRóS L， PI?A B， SOLé M， et al. Environmental monitoring by gene expression biomarkers in barbus graellsii： laboratory and field studies［J］. Chemosphere， 2007， 67（6）： 1144-1154.

［26］ NIKPOUR Y， ZOLGHARNEIN H， SINAEI M， et al. Evaluation of metallothionein expression as a biomarker of mercury exposure in Scatophagus argus［J］. Pakistan Journal of Biological Sciences， 2008，11（18）： 2269-2273.

［27］ 馬彬云， 任宏偉， 吳建平， 等. 牦牛MT-Ⅰ/-ⅡcDNA分子克隆及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析［J］. 中國(guó)生物工程雜志， 2005， 25（4）： 62-68.

Assessment of Heavy Metal Pollution by Expression of Yak Metallothionein Gene in Qinghai

XUE Yanfeng1， LUO Yihao2， LIU Xiangjun2， XIE Fenglian2， JIANG Guobin2， SUN Wancheng2，*
（1. Academy of Animal Science and Veterinary Medicine， Qinghai University， Xining 810016， China；2. College of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining 810016， China）

In order to study the potential risk of heavy metal contamination in Qinghai， total RNA was extracted from yak liver samples from fi ve regions， Yushu， Guoluo， Haiyan， Gangcha and Gonghe， and then cDNA was generated under the action of reverse transcription polymerase. The product of reverse transcription reaction was fi nally used to carry out RTPCR and detect the expression levels of metallothionein （MT） gene. The results showed that when yak liver sample from Gangcha was taken as the control group and the value of 2-ΔΔCtwas set to be 1， the fl uorescence quantitative values of yak livers from Yushu， Guoluo， Haiyan and Gonghe were 0.669， 0.624， 0.529 and 1.320， respectively. Meanwhile， these results were confi rmed by comparison with those of ELISA reaction. The exposure levels of heavy metal in yak body from different regions in Qinghai were evaluated， so that we could come up with assessment to yak production safety. Both the results of gene expression （mRNA level） and ELISA reaction （protein level） displayed that the most serious pollution regions of heavy metal were Gonghe and Gangcha.

metallothionein； real-time polymerase chain reaction； gene expression； yak； enzyme-linked immuno sorbent assay

TS201.2

A

1002-6630（2015）18-0177-05

10.7506/spkx1002-6630-201518032

2015-01-16

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（31160125）

薛艷鋒（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail：945982845@qq.com

孫萬(wàn)成（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：sun.wancheng0108@aliyun.com