高 意，周光明*，陳軍華，秦紅英

（發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

高效液相色譜法同時(shí)測定仙鶴草中6 種黃酮

高 意，周光明*，陳軍華，秦紅英

（發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

目的：建立超聲輔助萃取-高效液相色譜法分離仙鶴草中蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素6 種黃酮及 其含量測定的方法。方法：采 用Phenomenex C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）分離6 種成分；流動(dòng)相為甲醇-0.1%醋酸溶液，梯度洗脫；流速0.8 mL/min，紫外檢測波長320 nm，柱溫35 ℃。結(jié)果：6 種成分在15 min內(nèi)均達(dá)到基線分離，線性關(guān)系良好（r不低于0.999 1，n=6），平均回收率均在97.78%～104.4%之間（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.20%，n=3）。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用超聲波法提取，方法簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、可靠，可用于仙鶴草的質(zhì)量監(jiān)控。

高效液相色譜；仙鶴草；超聲萃?。稽S酮；含量測定

仙鶴草（Agrimonia pilosa Ledeb），又名龍芽草、脫力草，系薔薇科多年生植物地上部分，全草入藥［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，仙鶴草具有收斂止血［2］、抗氧化［3］、抗菌［4］、抗炎［5］和抗癌［6］等藥理作用，在臨床上主要用于治療咳血、便血、尿血等出血癥狀［7］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，仙鶴草含有三萜皂苷［8-9］、鞣質(zhì)［10］、黃酮類［11］、有機(jī)酸［12］和揮發(fā)油［13］等多種成分，其中主要成分為鶴草酚，在臨床上常以鶴草酚的含量作為檢測仙鶴草質(zhì)量的主要依據(jù)［14］。近來年，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道仙鶴草中含有蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素等多種黃酮類成分［11-16］，此類成分具有抗心律失常、抑制乙酰膽堿酯酶、抗炎活性、降糖等多種藥理作用［17-20］，因此研究仙鶴草中黃酮類化合物對仙鶴草的深入研究開發(fā)和質(zhì)量控制具有重要意義。

目前對于仙鶴草的研究方法不一，有薄層掃描法［14，21］、紅外光譜［22］和電泳法［23］等，各方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)，如Gu等［21］利用薄層色譜法 測定仙鶴草中成分，雖時(shí)間較短，但操作過程中受環(huán)境影響較大，測定結(jié)果穩(wěn)定性、重復(fù)性較差；李強(qiáng)等［22］利用紅外光譜對仙鶴草原藥材及其提取物進(jìn)行分析與鑒定，但并未對其中具體成分含量進(jìn)行測定，亦有Jiang Qinghua［24］、Wang Yan［25］等分別利用高效液相色譜法-二極管陣列檢測-電噴霧離子化-串聯(lián)質(zhì)譜法和高速逆流色譜法對仙鶴草中多種活性成分進(jìn)行純化分析，但是利用高效液色譜相同時(shí)測定仙鶴草中的多種黃酮成分尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法建立對仙鶴草中多種黃酮同時(shí)分離和測定含量的方法，此方法簡單省時(shí)、測定快速且重復(fù)性好，為仙鶴草質(zhì)量控制和評估提供重要的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

仙鶴草購于當(dāng)?shù)厮幏?；蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚、芹菜素對照品（純度均不小于98.5%） 上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；甲醇（色譜純）、醋酸（分析純） 重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠；二次蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（包括SPD-20A紫外檢測器、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT泵） 日本島津公司；KH-3200B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SZ-2自動(dòng)雙重純化水蒸餾器 上海瀘西分析儀器；XY型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器有限公司。1.3 方法

1.3.1色譜條件

圖1　混合對照品（A）和樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard mixture （A） and sample （B）

Phenomenex C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相B，0.1%醋酸為流動(dòng)相A，選擇梯度洗脫（0～5 min，45%→65% B；5～10 min，65%→80%B；10～15 min，80%→75% B； 15～20 min，75%→45% B）；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長320 nm；柱溫35 ℃。樣品和對照品色譜圖見圖1。

1.3.2對照品溶液的制備

精確稱取蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素對照品適量分別置于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解稀釋、定容，制得對照品溶液，質(zhì)量濃度分別為740、690、870、600、320、490 μg/mL分別準(zhǔn)確量取6 種對照品溶液各0.1 mL于10 mL容量瓶中，稀釋甲醇至刻度，得到混合對照品溶液，置于冰箱（4 ℃）中避光保存。

1.3.3供試品溶液的制備

精確稱取干燥且已過60 目篩的仙鶴草粉末0.1 g，依次加入6 mL甲醇溶液和4 mL水，超聲（160 W，4 kHz）萃取40 min，取萃取液上層清液離心（6 000 r/min）10 min，取上層清液過濾（0.45 μm有機(jī)濾膜），制得供試溶液，混合對照品和樣品的色譜圖如圖1所示。

2　結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系考察

精確吸取混合對照品溶液（1.3.2節(jié)制得），以甲醇和水逐步稀釋為8 個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，由低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度依次進(jìn)樣3 次，并以1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行分析。最后以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，平均峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸。6 種被測成分的線性關(guān)系考察結(jié)果見表1。

表1　6 種被測成分的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equations with linear range and correlation coeffi cients for 6 compounds

2.2精密度

取混合對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定各個(gè)對照品的峰面積，結(jié)果蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素平均峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.87%、1.32%、1.90%、1.38%、0.93%、1.49%、1.77%，表明儀器精確度良好。

2.3重復(fù)性

稱取同一批樣品6 份制備供試品溶液（制備方法同1.3.3節(jié)），分別進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素的峰面積RSD（n=6）分別為1.02%、1.94%、1.64%、1.44%、1.40%、1.45%，證明儀器重復(fù)性良好。

2.4樣品含量的測定及回收率實(shí)驗(yàn)

取仙鶴草粉末制備供試品溶液3 份（以1.3.3節(jié)中的方法），每份樣品進(jìn)樣2 次測定分析，根據(jù)表1中得到的線性方程計(jì)算出樣品中各個(gè)成分的含量，見表2。稱取9 份同一批次仙鶴草粉末各0.1 g，每3 個(gè)為一組，每組按照低、中、高分別加入對應(yīng)含量的對照品溶液，再按照1.3.3節(jié)制備供試品，得到3 組9 個(gè)樣品溶液，從低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度進(jìn)樣測定分析，計(jì)算平均回收率。

表2　樣品含量測定及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)（n=3）Table 2 Analytical results of real samples and recovery of spiked standards （n= 3）

2.5分析條件優(yōu)化

2.5.1流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別比較了乙醇-水、甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果表明，用乙醇-水為流動(dòng)相時(shí)，花旗松素和香豆素分離效果差；以乙腈-水作為流動(dòng)相分離時(shí)，芹菜素和山奈酚相對應(yīng)的峰出現(xiàn)重疊，無法完全分離；以甲醇-水作為流動(dòng)相分離時(shí)，能實(shí)現(xiàn)基線分離，但各組分峰寬且不對稱。為實(shí)現(xiàn)各組分的基線分離并得到良好的峰形，本研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)了甲醇-醋酸溶液為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，并嘗試不同體積分?jǐn)?shù)醋酸溶液以達(dá)到最佳分離效果，結(jié)果表明，流動(dòng)相為甲醇-0.1%醋酸溶液時(shí)，各組分分離效果好，且峰形良好。在嘗試以不同比例的甲醇-醋酸溶液進(jìn)行等度洗脫，發(fā)現(xiàn)均不能實(shí)現(xiàn)基線良好分離；實(shí)驗(yàn)梯度選擇，并不斷改變甲醇比例，最后得到最佳梯度為：0～5 min，45%→65% B；5～10 min，65%→80% B；10～15 min，80%→75% B；15～20 min，75%→45% B。

2.5.2提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙醇和環(huán)己烷3 種提取溶劑的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙醇作為提取劑時(shí)，沒有提取得到花旗松素成分；以環(huán)己烷作為提取劑時(shí)，提取出的蘆丁、花旗松素的含量非常低；以甲醇作為提取劑時(shí)，提取率較乙醇和環(huán)己烷的提取率都高，故選擇甲醇作為提取劑。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了甲醇和水不同比例時(shí)6 種黃酮的提取率，發(fā)現(xiàn)在體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)提取的6 種黃酮總量最高，故選擇體積分?jǐn)?shù)60%甲醇-水溶液作為最終的提取劑，提取溶劑對6 種黃酮總量的影響見圖2。

圖2　提取溶劑對6 種黃酮總量的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on the total recovery of 6 fl avones

2.5.3萃取時(shí)間和萃取功率的影響

圖3　萃取時(shí)間（A）、萃取功率（B）對6 種黃酮總量的影響Fig.3 Effect of extraction time and ultrasonic power on the total recovery of 6 fl avones

比較了甲醇超聲時(shí)間分別為10、20、30、40 min和50 min時(shí)所測組分黃酮總量，結(jié)果表明樣品超聲40 min得到的所測組分的黃酮總量最高，故選擇40 min為萃取時(shí)間，萃取時(shí)間對6 種黃酮總量的影響見圖3A。同時(shí)進(jìn)一步比較了40%、50%、60%、70%、80%、100%功率條件下所測組分浸出率，結(jié)果表明在最大功率的80%（160 W）時(shí)提取出的6 種黃酮總量最高，故選擇最大功率的80%（160 W）為萃取功率，萃取功率對6 種黃酮總量的影響見圖3B。

2.5.4波長和液固比的選擇

蘆丁、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素在波長360 nm處均有較強(qiáng)的紫外吸收，花旗松素在波長290 nm處有較強(qiáng)的紫外吸收。本實(shí)驗(yàn)比較了波長290、300、310、320、330、340、360 nm對樣品的檢測，結(jié)果表明，當(dāng)波長大于320 nm后，無法檢測到花旗松素，而當(dāng)波長小于310 nm以后，蘆丁、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素紫外吸收很低，導(dǎo)致出峰不明顯，由此選擇波長320 nm作為檢測波長。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還比較了液固比分別為20∶1、30∶1、50∶1、60∶1、80∶1和100∶1（mL/g）的提取效果，結(jié)果表明當(dāng)液固比為100∶1時(shí)，所測組分黃酮總量最高，故選擇液固比為100∶1作為最終的提取液固比。

2.6穩(wěn)定性

吸取同一供試溶液2 d內(nèi)每隔3 h進(jìn)樣測分析，結(jié)果表明蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素峰面積RSD分別為1.73%、1.33%、1.43%、1.77%、1.53%、1.97%，由此表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)討論了萃取時(shí)間和萃取功率對6 種黃酮總量的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)，隨著萃取時(shí)間的延長，黃酮總量不增反減，從經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等多方面綜合考慮，最終選擇40 min為萃取最佳時(shí)間。查閱已報(bào)道的關(guān)于高效液相測試自然產(chǎn)物的文獻(xiàn)，在優(yōu)化分析條件方面主要是針對萃取溶劑和流動(dòng)相的優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)針對萃取功率進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在最大功率時(shí)并不能到達(dá)最大提取率，而在最大功率的80%時(shí)6 種黃酮總量最高，故以此作為最佳萃取功率。

相關(guān)仙鶴草中黃酮成分含量測定的文獻(xiàn)報(bào)道很多，如劉磊等［26］用反相-高效液相色譜法以甲醇-乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相測定仙鶴草藥材中槲皮素的含量，亦有趙艷霞等［27］以高效液相色譜法測定仙鶴草中山奈酚-3-O-（6-p-香豆?；?β-D-吡喃葡萄糖苷的含量，但尚未有對仙鶴草中蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、芹菜素和山奈酚6 種黃酮含量同時(shí)測定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用甲醇輔助超聲萃取條件下高效液相色譜法測定仙鶴草中蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素6 種黃酮成分的含量，15 min所有組分完全出峰，6 種黃酮含量測定結(jié)果分別為237.3、618.3、374.6、36.0、21.5、48.1 μg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿意且重復(fù)性良好，實(shí)驗(yàn)操作簡單快捷，可以用于藥用仙鶴草中黃酮的測定。

臨床應(yīng)用中，仙鶴草主要的有效成分是鶴草酚，本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果表明仙鶴草里面的黃酮總含量也較高，且黃酮成分本身藥用價(jià)值高，因此在臨床應(yīng)用時(shí)不應(yīng)僅以鶴草酚含量作為仙鶴草質(zhì)量監(jiān)控指標(biāo)，其中黃酮類含量也不容忽視。本實(shí)驗(yàn)建立的以甲醇輔助萃取條件下利用高效液相測定仙鶴草中6 種黃酮的含量，為仙鶴草的深入開發(fā)和質(zhì)量控制提供新的參考。

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Determination of Six Flavonoids in Agrimonia pilosa Ledeb by HPLC

GAO Yi， ZHOU Guangming*， CHEN Junhua， QIN Hongying
（Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis， Ministry of Education， School of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest University， Chongqing 400715， China）

Objective： To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for separation and quantifi cation of rutin， taxifolin， coumarin， luteolin， kaempferol and apigenin in Agrimonia pilosa Ledeb by ultrasonic-assisted extraction. Methods： The separation of six flavonoids was performed on Phenomenex C18column （150 mm × 4.6 mm，5 μm） using step gradient elution. The mobile phase was composed of methanol and 0.1% acetic acid at a fl ow rate of 0.8 mL/min. The UV detection wavelength was 320 nm and the column temperature was set at 35 ℃. Results： Good separation of rutin， taxifolin， coumarin， luteolin， apigenin and kaempferol was achieved within 15 min. Calibration curves of all the six components showed an excellent linear relationship （r ≥ 0.999 1， n = 6）. The average recoveries were between 97.78% and 104.4% with a relative standard deviation （RSD） of ＜ 1.20%. Conclusion： This method， based on ultrasonic-assisted extraction， is simple， fast， economical and reliable.

high performance liquid chromatography （HPLC）； Agrimonia pilosa Ledeb； ultrasonic-assisted extraction；fl avonoids； quantitation

O652.62

A

1002-6630（2015）18-0093-04

10.7506/spkx1002-6630-201518017

2015-01-26

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21277110）

高意（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯V分析。E-mail：raining@swu.edu.cn

周光明（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯V及其聯(lián)用技術(shù)。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn