黎海濤，王魯峰，潘思軼*

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，環(huán)境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

響應面試驗優(yōu)化超聲波輔助合成地奧司明工藝

黎海濤，王魯峰，潘思軼*

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，環(huán)境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

以橙皮苷為原料，采用超聲波技術，探究地奧司明新型合成路線。在單因素試驗基礎上，選取超聲功率、超聲時間、反應時間、反應溫度為影響因素，地奧司明得率為響應值，利用Box-Behnken設計原理和響應面試驗分析法，研究各因素及其相互作用對得率的影響，模擬得到二次多項式回歸方程的預測模型，確定最佳反應條件為：超聲功率700 W、超聲時間25 min、反應時間5.6 h、反應溫度120 ℃。在此條件下，地奧司明合成的得率為21.35%，與理論預測值得率21.78%相比，其相對誤差為1.97%，并通過多種波譜方式驗證了合成物為目標產(chǎn)物地奧司明。說明通過響應面優(yōu)化后得到的回歸方程具有一定的實踐指導意義，同時本實驗也為地奧司明的超聲波輔助合成提供一定的思路。

地奧司明；合成；超聲波；響應面分析

地奧司明又名香葉木苷，是一種天然的黃酮類化合物。地奧司明具有改善靜脈張力、增強淋巴回流、保護毛細血管微循環(huán)、阻斷炎癥反應和降低毛細血管通透性的作用［1-2］；地奧司明對慢性靜脈功能不全有明顯的治療作用；大規(guī)模的臨床試驗已經(jīng)證明地奧司明能夠控制急性或者慢性痔瘡癥狀［3-4］；聯(lián)合物理治療，能夠有效改善腰椎間盤突出癥［5］。近年研究表明，其在抗腫瘤、治療糖尿病、抗炎等方面也表現(xiàn)出很好的活性［6-8］。

由于天然植物中地奧司明含量非常低，無法滿足醫(yī)療的大量需求，所以現(xiàn)在藥用的地奧司明都是以橙皮苷為原料經(jīng)過化學合成而來的。章思規(guī)等［9］以吡啶為溶劑，以碘為氧化劑，工藝過程簡單，得率超過90%，但純度不詳；楊愛玲［10］合成的地奧司明得率約56%，但要用到醋酐、吡啶、溴氣、二氯甲烷等，試劑較多，操作復雜，廢棄物多；馮宣等［11］的合成中用氫氧化鈉和碳酸鉀等強堿性物質(zhì)替代了吡啶，減少了有毒試劑的危害，但需要經(jīng)過多步反應，收率為70%，純度不詳；駱萌［12］采用了溴和碘2 種方式脫氫，碘脫氫得率69%、純度99%，溴脫氫得率58%、含量89%。根據(jù)專利文獻查找到的方法，目前多以吡啶、醋酐、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等有毒有害的有機試劑為溶劑，對人體和環(huán)境都造成極大的危害。近年來超聲波技術在食品添加劑合成、微生物代謝、酒類發(fā)酵、食品檢測、控制結(jié)晶等方面有了許多新的應用［13-16］，且由于超聲波在液體媒介中的空化機制［17］能加快粒子的運動速率，破壞粒子力的形成，從而使許多物理化學和化學過程急劇加速，所以本實驗擬采用超聲波技術，并以碳酸鈉溶液為溶劑，通過響應面法來探究一條地奧司明的超聲波輔助合成工藝。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

橙皮苷 西安開來生物工程有限公司；碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈、冰醋酸（均為色譜純）賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2儀器與設備

1100VL液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司；e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；UV-1800紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；Bruker 400MHz固體核磁儀 德國布魯克公司；JY92-2D超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-WD反應釜 上海一凱儀器設備有限公司。

1.3方法

1.3.1合成地奧司明的工藝流程

圖1　合成地奧司明的反應方程式Fig.1 Reaction mechanism for synthesizing diosmin

參考馮宣等［11］地奧司明的合成方法，選取無機堿溶液作為反應溶劑，但采用超聲波技術簡化反應過程。合成路線如圖1所示，準確稱取經(jīng)過超微粉碎的橙皮苷10 g，與20 g無水碳酸鈉混合，一起溶解在150 mL蒸餾水中，然后置于超聲波細胞粉碎機下進行超聲，形成溶液a；同時，將碘化鈉2 g與碘6 g溶解在150 mL無水乙醇中，形成溶液b；將溶液b倒入反應釜中加熱，調(diào)節(jié)反應溫度；待溶液a超聲完畢，迅速倒入反應釜中與溶液b混合，一起加熱反應，反應完畢加入3.75 mol/L氫氧化鈉乙醇溶液40 mL，保持70 ℃繼續(xù)反應1 h后停止加熱，用3.75 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH 5，析出土黃色沉淀，抽濾，洗滌，得到地奧司明粗品。

1.3.2合成工藝單因素試驗

1.3.2.1超聲功率對地奧司明合成的影響

固定反應過程的超聲時間20 min、反應時間5.5 h、反應溫度130 ℃，分別考察了400、480、560、640、720、800 W 6 個超聲功率條件下的合成過程，測定不同產(chǎn)物的得率和純度，確定最優(yōu)的超聲功率。

1.3.2.2超聲時間對地奧司明合成的影響

固定反應過程的超聲功率600 W、反應時間5.5 h、反應溫度130 ℃，分別考察了10、14、18、22、26、30 min 6個超聲時間條件下的合成過程，測定不同產(chǎn)物的得率和純度，確定最優(yōu)的超聲時間。

1.3.2.3反應時間對地奧司明合成的影響

固定反應過程的超聲功率600 W、超聲時間20 min、反應溫度130 ℃，分別考察了4、4.6、5.2、5.8、6.4、7 h 6個反應時間條件下的合成過程，測定不同產(chǎn)物的得率和純度，確定最優(yōu)的反應時間。

1.3.2.4反應溫度對地奧司明合成的影響

固定反應過程的超聲功率600 W、超聲時間20 min、反應時間5.5 h，分別考察了110、118、126、134、142、150 ℃ 6個反應溫度條件下的合成過程，測定不同的產(chǎn)物的得率和純度，確定最優(yōu)的反應溫度。

1.3.3合成地奧司明工藝條件優(yōu)化

按照Box-Behnken設計原理，在單因素試驗基礎上，以地奧司明得率和純度作為響應值，選取超聲功率、超聲時間、反應時間和反應溫度4 個單因素進行響應面試驗，來優(yōu)化地奧司明合成的工藝條件。試驗設計中的因素與水平見表1。

表1　響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.4地奧司明得率和純度的計算

式中：610為橙皮苷相對分子質(zhì)量；608為地奧司明相對分子質(zhì)量。

地奧司明純度的測定：采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［18］：色譜柱，Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm）；流動相，水-甲醇-冰醋酸-乙腈（66∶28∶6∶2，V/V）；流速，1 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。得到地奧司明標準曲線的回歸方程y=107x-91 150（R2=0.999 4，y為地奧司明標準液濃度，x為峰面積），地奧司明的純度為HPLC測得合成粗品中地奧司明的質(zhì)量百分比。

1.3.5檢測方法

按照歐洲藥典藥品標準EP 7.0的標準檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1超聲功率對地奧司明合成的影響

圖2　超聲功率對地奧司明合成的影響Fig.2 Infl uence of ultrasonic power on diosmin yield

從圖2可以看出，隨著超聲功率的增加，地奧司明的合成得率呈先上升后下降的趨勢，在640 W左右達到最高。這是因為對一定頻率和一定發(fā)生面的超聲波，功率增大，聲強也隨之增大。單位時間內(nèi)超聲產(chǎn)生的空化事件增多，從而有利于反應的進行，但太高聲強產(chǎn)生的大量空泡通過反射波可能減少能力的傳遞，并且與聲強的增加呈非線性［19］。以得率作為參考值，選取500、600、700 W繼續(xù)對地奧司明的合成做響應面分析，以確定最佳的超聲功率。

2.1.2超聲時間對地奧司明合成的影響

圖3　超聲時間對地奧司明合成的影響Fig.3 Infl uence of ultrasonic irradiation time on diosmin yield

由圖3可知，超聲時間對地奧司明的合成有明顯影響。隨著超聲時間的延長，地奧司明合成得率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，大約在18 min處得率達到一個最高點，超聲時間繼續(xù)延長，得率下降。超聲時間太短，對橙皮苷的助溶效果不明顯，溶解不充分，超聲時間過長，又會引起橙皮苷結(jié)構的變化從而影響合成效果［20］。以得率作為參考值，選取15、20、25 min繼續(xù)對地奧司明的合成做響應面分析，以確定最佳的超聲時間。

2.1.3反應時間對地奧司明合成的影響

如圖4所示，當反應時間延長時，地奧司明的得率不斷上升，在反應5.6 h左右達到最大值，反應時間繼續(xù)延長，得率下降，這說明在不斷反應的過程中伴隨著副反應的發(fā)生，且時間越長，副反應越多，雜質(zhì)越多［21］。以得率作為參考值，決定選取反應時間4.5、5.5、6.5 h繼續(xù)對地奧司明的合成做響應面分析以確定最佳反應時間。

2.1.4反應溫度對地奧司明合成的影響

圖5　反應溫度對地奧司明合成的影響Fig.5 Infl uence of reaction temperature on diosmin yield

如圖5所示，隨著反應溫度的升高，地奧司明合成的得率呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，下降趨勢較大，在128 ℃處達到最大值。溫度升高，分子碰撞的幾率增大，有利于正反應，隨著溫度的不斷升高，溶液黏度增加，副反應增加，雜質(zhì)增多，產(chǎn)品得率下降［22］。以得率作為參考值，選取115、125 、135 ℃ 3 個水平對地奧司明的合成繼續(xù)做響應面分析以確定最佳的反應溫度。

2.2響應面提取條件的優(yōu)化

2.2.1響應面試驗設計及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，綜合分析單因素試驗，選取了超聲功率（A）、超聲時間（B）、反應時間（C）和反應溫度（D）4 個對地奧司明合成有影響的因素，設計了四因素三水平的響應面分析試驗，見表2。

表2　Box-Behnken試驗設計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experiment results

使用Design-Expert 8.0軟件，以超聲功率、超聲時間、反應時間、反應溫度為影響因素，以地奧司明得率為響應值對表2的數(shù)據(jù)進行處理，得到表3回歸方程方差分析表，利用軟件進行非線性回歸的二次多項式擬合，得到預測模型如下：

如表3所示，回歸方差分析顯著性檢驗表明，此模型回歸顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著。得率模型0.944 1，=0.888 1，說明模型與實際試驗擬合滿足要求，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于地奧司明合成工藝的預測。

從得率的方差分析結(jié)果可以看出，方程的一次項A、D對響應值的影響顯著，交互項AB、AC、BC、BD、CD對響應值的影響顯著，二次項對響應值的影響均顯著。由此可見，各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

表3　得率回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model for diosmin yield

F值可以反映各試驗因素對試驗指標的重要性，F(xiàn)值越大，表明對試驗指標的影響越大。從表3可見，各因素對地奧司明合成得率的的影響程度大小為：反應溫度＞超聲功率＞反應時間＞超聲時間。

2.2.2響應面分析

根據(jù)回歸方程可以得到相應的響應面圖，考察所擬合的響應面曲面形狀，分析超聲功率、超聲時間、反應時間、反應溫度相互作用對地奧司明合成反應的影響。

圖6　各因素交互作用對合成得率的影響Fig.6 Reponse surface graphs showing the effects of independent variables on diosmin yield

由圖6可知，反應溫度對地奧司明合成得率的影響極為顯著，其繪制的曲線最為陡峭；超聲功率對得率的影響次之，曲線較為陡峭，而影響最小的為超聲時間，相較于其他因素，它的曲線較為平滑一些。通過響應面法預測得到的模型分析，在模型范圍內(nèi)，選擇得率最大化，得到地奧司明最佳合成工藝條件為：超聲功率700 W、超聲時間25 min、反應時間5.65 h、反應溫度120.17 ℃。預測的工藝條件下，地奧司明合成反應得率為21.78%。

2.2.3模型驗證

為檢驗響應面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述條件進行地奧司明合成反應，考慮到實際操作的便利，將工藝條件修正為反應時間5.6 h、反應溫度120 ℃。以上述條件進行驗證實驗，重復3 次實際測得的反應得率平均值為21.35%。說明通過響應面優(yōu)化后得出的回歸方程具有一定的實踐指導意義。

2.3地奧司明結(jié)構表征

根據(jù)上述反應條件進行地奧司明合成反應，將所得到的地奧司明進行結(jié)構解析，通過HPLC、電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic responance，NMR）等方法，對該化合物的結(jié)構及波譜數(shù)據(jù)進行詳細解析。

移取地奧司明標準對照品和合成產(chǎn)品進行HPLC分析，結(jié)果見圖7。

圖7　地奧司明標準品（A）和產(chǎn)品（B）的HPLC圖譜Fig.7 HPLC chromatograms of diosmin standards （A） and synthetic diosmin （B）

圖7A為地奧司明標準品的HPLC圖譜，地奧司明保留時間為18.662 min。圖7B為合成產(chǎn)品的HPLC圖譜，結(jié)果得到了較好的分離，地奧司明保留時間為18.513 min，與標準品對應。同時，圖7B的13.074 min是未完全反應的橙皮苷的保留時間。

移取地奧司明溶液進行ESI-MS分析，結(jié)果見圖8。

圖8　地奧司明ESI負離子一級質(zhì)譜圖Fig.8 ESI- MS primary spectrum of diosmin

圖8中m/z 607是ESI-準分子離子峰信號，為［M—H］-峰即（608-1），較強的m/z 299碎片離子峰結(jié)構為［MC12H21O9］-，m/z 256碎片離子峰結(jié)構為［M-C12H21O9-C2H3O］-，與地奧司明應有的質(zhì)譜信息一致［23］。

使用氘代二甲基亞砜溶解試樣，四甲基硅烷作內(nèi)標，測定地奧司明的1H NMR和13C NMR圖譜，結(jié)果見圖9。

圖9　地奧司明樣品的1H NMR（AA）和1133C NMR（BB）圖譜Fig.91H NMR and13C NMR spectra of diosmin

對地奧司明樣品的NMR圖譜進行分析，并參照李文杰等［23］對地奧司明的波譜特征的分析，認為地奧司明符合預定化學結(jié)構。

綜上所述，本工作利用HPLC、MS和NMR技術對合成的樣品結(jié)構進行了驗證，證明合成所得物正是我們的目標產(chǎn)物地奧司明。

3　結(jié) 論

本實驗采用超聲波輔助的方法合成地奧司明，通過單因素試驗和Box-Behnken設計原理以及響應面分析法對合成工藝進行優(yōu)化，擬合了超聲功率、超聲時間、反應時間和反應溫度4 個因素對地奧司明合成得率的回歸模型，經(jīng)檢驗證明該模型合理可靠，能較好地預測出地奧司明合成的得率。由該模型確定的最佳合成條件為超聲功率700 W、超聲時間25 min、反應時間5.6 h、反應溫度120 ℃。在此條件下，合成的地奧司明得率為21.35%。

由于橙皮苷特殊的溶解性，現(xiàn)在最常用的是采用吡啶作為溶劑，吡啶的氮雜原子有一對未共享電子，因此具有堿性［24］。橙皮苷易溶于吡啶，在地奧司明的合成過程中不僅作為溶劑，同時與碘反應生成鹵代吡啶，作為反應中間體參與反應，有利于碘代地奧司明的生成［25］。相比之前文獻中提到過的地奧司明合成方法，本實驗采用超聲波輔助技術，加速橙皮苷在稀堿溶液中的溶解，但溶解性遠遜于吡啶，且無法形成類似于鹵代吡啶的中間體，所以產(chǎn)品得率不高。但本實驗旨在探索使用無毒無害的無機溶劑聯(lián)合物理方法的方式來合成地奧司明的效果，從方法上提供了一定的依據(jù)和可行性。同時也為今后地奧司明合成方法的更新提供一個方向，以此來滿足無毒無害、低污染生產(chǎn)。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Synthesis Process of Diosmin by Response Surface Methodology

LI Haitao， WANG Lufeng， PAN Siyi*
（Key Laboratory of Environment Correlative Dietology， Ministry of Education， College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

This study aimed to develop a new ultrasonic-assisted procedure for the synthesis of diosmin from hesperidin. Four factors including ultrasonic power， irradiation time， reaction time and reaction temperature were optimized using Box-Behnken design and response surface methodology based on single factor investigations for achieving maximum yield of diosmin. The optimization was performed by examining the infl uence of the four independent variables and their interactions on diosmin yield. A quadratic polynomial regression model equation was set up. By analyzing the response surface model， the optimum synthesis conditions were determined as follows： ultrasonic power， 700 W； irradiation time， 25 min； reaction time， 5.6 h， and reaction temperature， 120 ℃. Experiments carried out under these conditions gave a diosmin yield of 21.35%， showing a relative error of 1.97% compared to the predicted value （21.78%）. The product was identifi ed as diosmin by applying various spectroscopic methods. The presented response surface regression equation is of some practical signifi cance for optimizing the ultrasonic-assisted synthesis of diosmin.

diosmin； synthesis； ultrasound； response surface analysis

R914.5

A

1002-6630（2015）18-0047-06

10.7506/spkx1002-6630-201518008

2015-01-25

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)柑橘產(chǎn)業(yè)技術體系崗位科學家項目（CARS-27-05B）

黎海濤（1 989—），男，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：356340517@qq.com

潘思軼（1964—），男，教授，博士，研究方向為植物性農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：siyipan@aliyun.com