齊丹萍，刁明明，陸兆新，呂鳳霞，別小妹，張 充，趙海珍*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的酶法合成工藝

齊丹萍，刁明明，陸兆新，呂鳳霞，別小妹，張 充，趙海珍*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

以實(shí)驗(yàn)室自制的單半乳糖基甘油和游離棕櫚酸為原料，在有機(jī)溶劑中以固定化脂肪酶Novozyme 435為催化劑，研究單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的合成條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率為響應(yīng)值，確定酶添加量、底物物質(zhì)的量比和反應(yīng)時(shí)間作為影響合成反應(yīng)的主要因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。獲得單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的最佳合成條件為：丙酮為反應(yīng)溶劑，脂肪酶Novozyme 435添加量12.93 mg/mL、底物物質(zhì)的量比（單半乳糖基甘油-棕櫚酸）1.00∶4.49、反應(yīng)溫度55 ℃、反應(yīng)時(shí)間27.60 h，此時(shí)單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率為90.17%。

單半乳糖基甘油棕櫚酸酯；酶法合成；丙酮；脂肪酶Novozyme 435；優(yōu)化

甘油糖脂是細(xì)胞膜的重要成分［1］，廣泛存在于植物、微生物和動(dòng)物的神經(jīng)組織，具有抗氧化［2］、抗腫瘤［3］、抗菌［4］、抗病毒［5］、抗炎［6］等作用，在化妝品、生物醫(yī)藥、食品等方面有著廣泛的應(yīng)用前景［7］。要深入研究甘油糖脂的生物活性構(gòu)效關(guān)系及其作用機(jī)理，必須有大量結(jié)構(gòu)單一的純品，但是市場售出的高純度甘油糖脂種類少、價(jià)格昂貴，天然提取的甘油糖脂數(shù)量有限，純度也難以滿足研究的需要。因此如何正確且高效地獲得所需要的甘油糖脂成為目前的研究熱點(diǎn)之一。

甘油糖脂的合成方法主要有化學(xué)合成和酶法合成。由于酯化反應(yīng)可逆，加上糖分子和甘油分子上的羥基較多，導(dǎo)致化學(xué)合成條件差［8］，選擇性低，副產(chǎn)物多，難以應(yīng)用在食品、醫(yī)藥等行業(yè)［9］。與化學(xué)合成法相比，酶催化合成具有反應(yīng)條件溫和、效率高、選擇性強(qiáng)、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢［10］，且綠色環(huán)保，符合可持續(xù)發(fā)展的要求［11］。由于在非水相中合成糖酯可以增大底物的溶解性，抑制可逆的副反應(yīng)，提高反應(yīng)的立體選擇性，并消除產(chǎn)物和底物的抑制作用。近年來，越來越多的研究人員利用非水相環(huán)境酶法合成糖酯，合成糖酯中所用糖基的種類多為葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和木糖醇等，以半乳糖基甘油作為糖基的研究很少［12］。

本實(shí)驗(yàn)以前期合成的單半乳糖基甘油［13］和棕櫚酸作為底物，對固定化脂肪酶Novozyme 435在有機(jī)溶劑中催化合成單半乳糖基甘油棕櫚酸酯進(jìn)行研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，以得到最大的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，為其酶法生產(chǎn)合成提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

單半乳糖基甘油（純度＞95%）由本實(shí)驗(yàn)室自制；棕櫚酸、丙酮（均為化學(xué)純） 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；4?型分子篩 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；固定化脂肪酶Novozyme 435（Candida antarctica） 丹麥Novozyme酶制劑公司；其他試劑和有機(jī)溶劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2儀器與設(shè)備

電子精密天平 北京賽多利斯天平有限公司；SHZ-88A往復(fù)式水浴恒溫振蕩器 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；1200高效液相色譜（high p erformance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；ELSD 2000蒸發(fā)光散射檢測器 美國Alltech公司。

1.3方法

1.3.1單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的合成

將一定量的單半乳糖基甘油、棕櫚酸、固定化脂肪酶Novozyme 435和5 mL丙酮置于30 mL具塞試管中，密封后放入55 ℃水浴振蕩器（轉(zhuǎn)速130 r/min）中反應(yīng)3 h，加入4?型分子篩約170 mg繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后，過濾除掉反應(yīng)液中的酶，取20 μL進(jìn)行液相檢測。所有反應(yīng)進(jìn)行3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，最終取其平均值。

1.3.2單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的定量分析

反應(yīng)結(jié)束后取20 μL反應(yīng)液進(jìn)行液相檢測。色譜柱為ZORBA SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫保持在30 ℃，流動(dòng)相為甲醇-水（體積比95∶5），流速0.5 mL/min，洗脫時(shí)間為25 min。檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD），漂移管溫度55 ℃，氣流量為2.0 L/min，增益值為1。

單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的定量采用外標(biāo)法。標(biāo)品由實(shí)驗(yàn)室自制并進(jìn)行分離純化制得，純度＞97%。將純品半乳糖基甘油棕櫚酸單酯和二酯溶解于一定量的色譜純甲醇中，配成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC-ELSD檢測后（圖1），繪制ln（峰面積）-ln（單半乳糖基甘油棕櫚酸酯濃度）標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程：y=1.648 7x+8.561 3（單半乳糖基甘油棕櫚酸單酯）和y=1.605 5x+6.453 6（單半乳糖基甘油棕櫚酸二酯）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算單酯和二酯物質(zhì)的量，最終根據(jù)下式計(jì)算單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率：

圖1　單半乳糖基甘油棕櫚酸酯反應(yīng)液（A）、單半乳糖基甘油棕櫚酸單酯（B）和單半乳糖基甘油棕櫚酸二酯（C）的HPLC圖譜PLCFig.1 HPLC profi les of palmitoyl-monogalactosylglycerol reaction mixture （A）， monopalmitoyl-monogalactosylglycerol （B） and dipalmitoylmonogalactosylglycerol （C）

1.3.3單因素試驗(yàn)

選取反應(yīng)溶劑（丙酮、正己烷、叔戊醇、叔丁醇、乙腈）、酶添加量（4～20 mg/mL）、底物物質(zhì)的量比（單半乳糖基甘油-棕櫚酸1∶1～1∶6）、反應(yīng)時(shí)間（5～84 h）和反應(yīng)溫度（40～55 ℃）5個(gè)因素，研究不同因素對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響，從而確定各因素的最適范圍。

1.3.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定丙酮為反應(yīng)溶劑，反應(yīng)溫度55 ℃，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇酶添加量8～16 mg/mL、底物物質(zhì)的量比1∶3～1∶5、反應(yīng)時(shí)間18～30 h，以單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)因素和水平見表1。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and codes of variables used in the experimental design

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1反應(yīng)溶劑種類的影響

合適的溶劑對于有機(jī)相中進(jìn)行的脂肪酶催化合成反應(yīng)必不可少。有機(jī)溶劑不僅會影響反應(yīng)底物的溶解度［14］，從而影響酯化率，還影響脂肪酶的穩(wěn)定性和催化活性［15］。有機(jī)溶劑可以直接破壞酶活性中心構(gòu)型的氫鍵、疏水作用等而使酶失活，還可以作用于酶的水化層間接影響酶活性［16］。因此選擇一種合適的有機(jī)溶劑作為反應(yīng)體系對酶促反應(yīng)的順利進(jìn)行起著至關(guān)重要的作用。不同的有機(jī)溶劑對同一個(gè)反應(yīng)體系中的底物溶解度和脂肪酶活性產(chǎn)生的影響效果不同，由此導(dǎo)致在不同有機(jī)溶劑中脂肪酶催化合成的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率不同。本實(shí)驗(yàn)分別以丙酮、正己烷、叔戊醇、叔丁醇和乙腈為反應(yīng)溶劑，加入單半乳糖基甘油0.1 mmol/5 mL、棕櫚酸0.2 mmol/5 mL、脂肪酶4 mg/mL，55 ℃水浴反應(yīng)48 h，考察溶劑種類對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2　有機(jī)溶劑對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of organic solvents on palmitoyl-monogalactosylglycerol yield

從圖2可以看出，以乙腈為溶劑時(shí)產(chǎn)率最高，與其他溶劑體系有著顯著性差異（P＜0.05），其次是丙酮和叔丁醇體系，正己烷體系中產(chǎn)物的量最少。以乙腈為溶劑時(shí)產(chǎn)物的產(chǎn)率雖然最高，但是乙腈毒性較強(qiáng)，不允許應(yīng)用于食品工業(yè)，而丙酮的沸點(diǎn)較低，易于產(chǎn)物分離，且被歐共體允許在食品或食品添加劑產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用［17］，安全性較高，故選用丙酮為單半乳糖基甘油棕櫚酸酯合成的反應(yīng)溶劑。

2.1.2酶添加量的影響

酶催化反應(yīng)中，酶質(zhì)量濃度的大小會影響反應(yīng)進(jìn)程的快慢，同時(shí)也會影響產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。酶添加量對酯合成轉(zhuǎn)化率在一定條件和質(zhì)量濃度范圍內(nèi)影響顯著，但質(zhì)量濃度過高會增加反應(yīng)成本［18］。因此在一定范圍內(nèi)增大酶的質(zhì)量濃度，可以縮短達(dá)到相同轉(zhuǎn)化率所需的反應(yīng)時(shí)間，提高轉(zhuǎn)化率。以丙酮為反應(yīng)溶劑，單半乳糖基甘油添加量0.1 mmol/5 mL、棕櫚酸添加量0.2 mmol/5 mL，分別添加不同質(zhì)量濃度的脂肪酶Novozyme 435：4、8、12、14、20 mg/mL，55 ℃水浴中進(jìn)行合成反應(yīng)，48 h后考察不同酶添加量對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響。

圖3　酶添加量對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on palmitoyl-monogalactosylglycerol yield

由圖3可知，隨著酶添加量的增多，單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產(chǎn)量逐漸增高，在酶添加量為12 mg/mL時(shí)單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產(chǎn)量最高，之后產(chǎn)量降低并趨于平衡。主要是由于加酶添加量超過一定范圍后，底物的量相對不足，且酶添加量過多使酶發(fā)生聚集而不能與底物充分接觸，從而降低了酶的催化效率［19］。故選取12 mg/mL為最佳酶添加量。

2.1.3底物物質(zhì)的量比的影響

脂肪酶催化的酯化反應(yīng)中，為提高其中一種底物的轉(zhuǎn)化率，使反應(yīng)向著正方向進(jìn)行，通常要增大另一種底物的量或在反應(yīng)中不斷除去某種反應(yīng)產(chǎn)物［20］。本實(shí)驗(yàn)固定單半乳糖基甘油物質(zhì)的量為0.1 mmol，分別在5 mL溶劑中添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol棕櫚酸，酶添加量12 mg/mL，55 ℃水浴反應(yīng)48 h，考察底物物質(zhì)的量比對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響。

圖4　底物物質(zhì)的量比對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of molar ratio between substrates on palmitoylmonogalactosylglycerol yield

從圖4可以看出，單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率隨底物物質(zhì)的量比的變化先升后降。當(dāng)單半乳糖基甘油與棕櫚酸的物質(zhì)的量比在1∶1～1∶4范圍內(nèi)時(shí)，底物的酯化產(chǎn)率隨之提高，底物物質(zhì)的量比為1∶4時(shí)產(chǎn)率達(dá)到最高。繼續(xù)增加棕櫚酸的濃度，產(chǎn)率不升反降，可能原因是游離棕櫚酸濃度過高，與產(chǎn)物混合增加了反應(yīng)體系的黏度，反應(yīng)體系的傳質(zhì)阻力增大，從而抑制反應(yīng)的進(jìn)行，造成原料的浪費(fèi)［21］。因此實(shí)驗(yàn)選取1∶4為最佳的底物物質(zhì)的量比。

2.1.4反應(yīng)時(shí)間的影響

在一定范圍內(nèi)延長反應(yīng)時(shí)間可以促進(jìn)底物的擴(kuò)散和產(chǎn)物的合成，但當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)之后，繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間也不會進(jìn)一步提高產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。本實(shí)驗(yàn)固定單半乳糖基甘油添加量0.1 mmol/5 mL、棕櫚酸添加量0.4 mmol/5 mL、脂肪酶添加量12 mg/mL，55 ℃水浴中進(jìn)行合成反應(yīng)，分別在5、12、24、36、48、60、72、84 h時(shí)取樣檢測，探討反應(yīng)時(shí)間對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響。

圖5　反應(yīng)時(shí)間對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯合成的影響Fig.5 Effect of reaction time on palmitoyl-galactosylglycerol yield

從圖5可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產(chǎn)量呈上升趨勢，在24 h時(shí)達(dá)到最大值并趨于平穩(wěn)。繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，超過60 h后產(chǎn)量開始降低，分析原因可能是經(jīng)過一段時(shí)間的反應(yīng)后，催化劑活性開始下降［22］，另一方面，酯化反應(yīng)存在逆反應(yīng)，隨著反應(yīng)的長時(shí)間進(jìn)行，反應(yīng)生成的酯可能被降解［23］。因此，選取24 h為適宜反應(yīng)時(shí)間。

2.1.5反應(yīng)溫度的影響

在酶促反應(yīng)過程中，適宜的溫度是反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵因素。一般情況下，隨著溫度的升高，反應(yīng)速率加快，但溫度超過酶的最適溫度后，酶的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象會受到影響，從而降低酶活和酶的使用壽命［24］。由于反應(yīng)溶劑丙酮的沸點(diǎn)為56.53 ℃，反應(yīng)溫度超過56 ℃會導(dǎo)致溶劑揮發(fā)，影響反應(yīng)進(jìn)行，故實(shí)驗(yàn)選取的最高溫度為55 ℃。本實(shí)驗(yàn)固定單半乳糖基甘油添加量0.1 mmol/5 mL、棕櫚酸添加量0.4 mmol/5 mL、脂肪酶添加量12 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間24 h，分別在40、45、50、53、55 ℃條件下利用脂肪酶催化單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的合成，探討反應(yīng)溫度對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響。

圖6　反應(yīng)溫度對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯合成的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on palmitoylmonogalactosylglycerol yield

從圖6可以看出，隨著反應(yīng)溫度的不斷升高，產(chǎn)物的產(chǎn)率也不斷升高，在反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)達(dá)到最大值，再繼續(xù)升高溫度反應(yīng)溶劑就會揮發(fā)，影響反應(yīng)的正常進(jìn)行。此外，溫度過高還會導(dǎo)致酶活力下降，不利于酯化反應(yīng)進(jìn)行［17］。故選取55 ℃為適宜反應(yīng)溫度，此時(shí)單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率為89.06%。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酶添加量、底物物質(zhì)的量比和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的中心組合設(shè)計(jì)，共20 組試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2所示。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，確定了單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率（Y）的最佳擬合二次回歸方程：

2.2.2模型擬合檢驗(yàn)及方差分析

由表3可知，本實(shí)驗(yàn)選用的模型回歸方程P值小于0.000 1，說明回歸方程極顯著，且失擬項(xiàng)不顯著（P=0.065 1＞0.05）。模型的相關(guān)系數(shù)（R2）為0.965 8，表明觀察值與預(yù)測值之間相關(guān)性較好。變異系數(shù)表明不同實(shí)驗(yàn)組之間的變異程度，本試驗(yàn)的變異系數(shù)為2.97%，處于較低水平，說明試驗(yàn)的重復(fù)性較好。由上述分析可知，該模型與試驗(yàn)情況擬合較好，可以在模型設(shè)定的范圍內(nèi)分析和預(yù)測單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產(chǎn)率?；貧w方程中底物物質(zhì)的量比（B）對模型的影響極顯著（P＜0.000 1），反應(yīng)時(shí)間（C）對模型的影響極顯著（P＜0.01）；此外，A2、B2和C2對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產(chǎn)率也有極顯著影響（P＜0.01）；酶添加量與反應(yīng)時(shí)間的交互作用（AC）極顯著（P＜0.01）。

表3　單半乳糖基甘油棕櫚酸酯轉(zhuǎn)化率二項(xiàng)式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance （ANOVA） for the experimental results of central composite design （CCD） （palmitoyl-galactosylglycerol yield）

2.2.3響應(yīng)面分析

圖7為脂肪酶催化單半乳糖基甘油棕櫚酸酯合成的響應(yīng)面，直觀反映了3個(gè)因素兩兩之間的交互作用對響應(yīng)值單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響。對其響應(yīng)面曲面以及等高線圖進(jìn)行分析可直觀看出最佳范圍，并可以在最佳范圍內(nèi)根據(jù)單半乳糖基甘油棕櫚酸酯合成過程中的實(shí)際需要調(diào)整各因素大小，從而得到較高的產(chǎn)率。

圖7　各因素交互影響單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的響應(yīng)面Fig.7 Response surface plots showing the interactive effects on independent variables the yield of palmitoyl-monogalactosylglycerol

從圖7a可以看出，反應(yīng)時(shí)間固定為24 h時(shí)，響應(yīng)面的坡度較平緩，表明響應(yīng)值（單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率）對酶添加量和底物物質(zhì)的量比的交互作用不敏感。從等高線可以看出，酶添加量的變化對響應(yīng)值的影響比底物物質(zhì)的量比的變化影響大，等高線較密。隨著酶添加量的增加，產(chǎn)率不斷升高，達(dá)到一定值后開始下降，在底物物質(zhì)的量比達(dá)到較高水平時(shí)，產(chǎn)率趨于平衡?？赡茉蚴钱?dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比率比較低時(shí)，底物量不足，脂肪酶的活性位點(diǎn)沒有被完全結(jié)合，造成酶的浪費(fèi)。底物物質(zhì)的量比率達(dá)到一定范圍后，酶的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，繼續(xù)增加底物反而會造成浪費(fèi)。圖7b顯示了底物物質(zhì)的量比為1∶4時(shí)，加酶添加量和反應(yīng)時(shí)間的交互作用對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響。從圖7b中可以看出，響應(yīng)面的坡度較陡，表明響應(yīng)值對酶添加量和反應(yīng)時(shí)間的交互作用敏感。等高線圖反映了酶添加量和反應(yīng)時(shí)間的變化對響應(yīng)值的影響不大。酶添加量較低時(shí)，反應(yīng)時(shí)間的延長對產(chǎn)率的影響不大，當(dāng)酶添加量在較高水平時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長產(chǎn)率不斷升高，并在27 h時(shí)達(dá)到平衡，可能是酶添加量已經(jīng)達(dá)到飽和的緣故。圖7c顯示了在酶添加量為12 mg/mL的條件下，底物物質(zhì)的量比和反應(yīng)時(shí)間的交互作用對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響。從圖7c可以看出，響應(yīng)面的坡度較平緩，表明響應(yīng)值對酶添加量和底物物質(zhì)的量比的交互作用不敏感。從等高線可以看出，底物物質(zhì)的量比和反應(yīng)時(shí)間的變化對響應(yīng)值的影響不大。反應(yīng)開始時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，增大底物物質(zhì)的量比會使產(chǎn)物產(chǎn)率呈上升趨勢，繼續(xù)增大底物物質(zhì)的量比率，底物已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，反應(yīng)趨于平衡，過高的底物物質(zhì)的量比率反而會造成反應(yīng)的抑制和原料的浪費(fèi)。

2.2.4最優(yōu)反應(yīng)條件的確定及模型驗(yàn)證

在選取的各因素范圍內(nèi)，利用Design-Expert統(tǒng)計(jì)分析軟件，根據(jù)回歸模型分析，得出丙酮中脂肪酶Novozyme 435催化合成單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的最佳反應(yīng)條件，當(dāng)酶添加量12.93 mg/mL、底物物質(zhì)的量比1.00∶4.49、55 ℃水浴反應(yīng)27.60 h時(shí)，單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產(chǎn)率可達(dá)到90.18%。采用上述最佳反應(yīng)條件，進(jìn)行3次合成反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)際平均產(chǎn)率為90.17%，與模型預(yù)測值基本一致，說明預(yù)測值與實(shí)際值之間有較好的擬合性，模型可信度高。

3　結(jié) 論

3本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室自制的單半乳糖基甘油和棕櫚酸為原料，在丙酮體系中，以固定化脂肪酶Novozyme 435為催化劑，通過酯化反應(yīng)合成單半乳糖基甘油棕櫚酸酯，確定了反應(yīng)溶劑、酶添加量、底物物質(zhì)的量比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度等因素對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率的影響。在此基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法建立了其統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化模型，并獲得了適宜的酶催化合成條件。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（90.17%）與模型預(yù)測值（90.18%）完全吻合，因此該實(shí)驗(yàn)中所建立的模型具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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Response Surface Optimization of Lipase-Catalyzed Synthesis of Palmitoyl-Monogalactosylglycerol in Organic Solvent

QI Danping， DIAO Mingming， LU Zhaoxin， Lü Fengxia， BIE Xiaomei， ZHANG Chong， ZHAO Haizhen*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

The enzymatic synthesis of palmitoyl-monogalactosylglycerol from monogalactosyl glycerol and free palmitic acid in organic solvent was investigated in present study. Novozyme 435， an immobilized lipase， was used as catalyst. The main factors that influence the yield of palmitoyl-monogalactosylglycerol， including lipase amount， and molar ratio of monogalactosyl glycerol to palmitic acid and reaction time， were selected and optimized by the combined use of single factor experiments and response surface methodology. The optimal synthesis conditions were determined as follows： reaction solvent， acetone； Novozyme 435 amount， 12.93 mg/mL； molar ratio monogalactosylglycero to palmitic acid， 1.00：4.49； reaction temperature， 55 ℃； and reaction time， 27.60 h. Under these conditions， the yield of palmitoylmonogalactosylglycerol was 90.17%.

palmitoyl-monogalactosylglycerol； enzymatic synthesis； acetone； Novozyme 435； optimization

TS202.3

A

1002-6630（2015）18-0001-06

10.7506/spkx1002-6630-201518001

2015-02-03

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301558）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（KJQN201427）

齊丹萍（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：2013108027@njau.edu.cn

趙海珍（1975—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zhaohz@njau.edu.cn