黃 飛， 張 哲， 魏先文， 陳國平， 楊富功， 楊可可

（1.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽　黃山　245041；2.安徽工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽　馬鞍山　243002）

Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取廢次煙葉中煙堿的工藝研究

黃 飛1， 張 哲1， 魏先文2， 陳國平1， 楊富功1， 楊可可1

（1.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽黃山245041；2.安徽工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽馬鞍山243002）

目的 Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取煙葉中煙堿工藝。方法 以煙堿的提取率為評價指標(biāo)，考察浸泡時間、固液比、微波功率、微波輻射時間4個因素對煙堿提取率的影響，采用Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取工藝，并進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果 浸泡時間、微波輻射時間、固液比、微波功率對煙堿的提取率具極顯著影響，確定微波輔助提取煙堿的最優(yōu)提取工藝為：浸泡時間為6 h，微波輻射時間7 min，固液比為0.1，微波功率為800W。結(jié)論 Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取煙葉中煙堿工藝，建立的數(shù)學(xué)模型和實驗觀察數(shù)據(jù)相符，該提取工藝合理，精確度高，可預(yù)測性好。

Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法；微波輔助；廢次煙葉；煙堿；提取

煙堿又稱尼古?。╪icotine，Nic），是煙草的主要成分之一。一般人們認(rèn)為煙堿是煙葉中的主要毒性物質(zhì)，其實這是一種誤解。流行病學(xué)研究報告表明，煙堿可以有效清除活性氧自由基，能夠抑制多巴胺自氧化，可以降低老年癡呆癥和帕金森氏綜合癥的發(fā)病率［1-2］，能治療精神分裂癥、抑郁癥等，對婦女子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等雌激素依賴性疾病有較好的療效［3］。煙堿還可以用于戒煙，提高戒煙的成功率，避免吸煙產(chǎn)生的有害物質(zhì)對身體的毒害［4-5］。

目前從煙葉中提取煙堿的常見方法有水蒸氣蒸餾法［6］、連續(xù)逆流提取法［7］、溶劑萃取法［8］、超臨界萃取法［9］、離子交換法［10］、超聲輔助酶法［11］等。以上方法設(shè)備成本、技術(shù)要求較高，萃取過程中可能有新的組分產(chǎn)生等缺點。微波輔助提取可以顯著加速傳質(zhì)過程，提高提取效率，容易實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用［12］。與傳統(tǒng)的提取方式相比較，具有明顯的優(yōu)勢。微波輔助提取大多是采用正交設(shè)計實驗對煙堿提取工藝進(jìn)行考察［11，13-14］，考慮正交設(shè)計的局限性，本研究以廢次煙草為原料，通過Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取廢次煙葉中煙堿的工藝，獲得了優(yōu)化的微波提取工藝條件，該方法尚未見報道。

1　儀器與試劑

1.1儀器 UV-2100紫外可見分光光度計（北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司）；NMS72SF型微波爐（上海微波爐有限公司）；FZ102型微量植物粉碎機（上海申光儀器儀表有限公司）；BT25S電子天平（賽多利斯）。

1.2試劑 廢次煙葉（Nicotiana tabacum L.，購自黃山市煙草收購站，批號20130824，經(jīng)黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院制藥工程教研室柯仲成鑒定為茄科煙草）；99%煙堿對照品（購于西安云芝生物科技有限責(zé)任公司，批號20130312），甲基橙、三氯甲烷、乙醇、檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖溶液均為分析純（中國國藥化學(xué)試劑有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取煙堿標(biāo)準(zhǔn)液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，分別注入60 mL分液漏斗中，加入檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖溶液2 mL、甲基橙溶液2 mL，混合均勻后加入三氯甲烷5 mL，萃取2 min，靜置分層，取三氯甲烷層加入1 cm比色皿中，測其波長420 nm處的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，煙堿濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作出回歸方程y=-0.022 42+5.462 35x，相關(guān)系數(shù)為r=0.997 7［15］。

2.2提取液中煙堿的測定 取10.00 g廢次煙葉，用微型植物粉碎機粉碎，以一定的固液比加入乙醇，浸泡一定時間后，以一定功率的微波處理一定時間，冷卻后于3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液1 mL，加入2 mL檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液和2 mL飽和的甲基橙溶液，搖勻后加入5 mL三氯甲烷，震蕩2.5 min，靜置分層。取三氯甲烷層加入1 cm比色皿中，測其420 nm處吸光度［13，16］。根據(jù)測得的吸光度，用回歸方程計算出對應(yīng)的濃度，計算煙堿提取率。

2.3Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化微波提取工藝條件

2.3.1試驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，煙堿微波輔助提取較為顯著的影響因素有浸泡時間、微波輻射時間、固液比、微波功率和提取次數(shù)等?？紤]到提取次數(shù)為非連續(xù)變量因素，回歸方程處理較為復(fù)雜，故根據(jù)實際情況，將其固定為1次。根據(jù)星點設(shè)計的研究思路和Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，對各因素進(jìn)行3水平試驗設(shè)計，用代碼值-1、0、1來表示。代碼值所代表的實際值見表1，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1　Box-Behnken試驗因素與水平

表2　Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

多元線性回歸：Y=87.67+2.50X1+4.24X2+1.99X3+ 5.56X4（r2=0.831 7）

由表3回歸方程的方差分析結(jié)果可知，在本實驗設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi)，浸泡時間、微波輻射時間、固液比、微波功率對煙堿的提取率有極顯著的影響，浸泡時間和固液比、固液比和微波功率的相互作用具有非常顯著影響，浸泡時間和微波輻射時間的相互作用具有顯著影響。浸泡時間和微波功率、微波輻射時間和固液比、微波輻射時間和微波功率的相互作用沒有顯著影響?；貧w方程失擬檢驗不顯著，說明其他未知因素對該試驗干擾比較小。擬合檢驗極顯著，說明該二項式方程與實際提取情況擬合很好，較好地反映了煙堿提取率和浸泡時間、微波輻射時間、固液比、微波功率的關(guān)系。因此，該二項式方程較好地描述了煙堿提取率隨各個因素的變化規(guī)律，具有良好的預(yù)測指導(dǎo)性［17-21］。

表3　回歸方程的方差分析

2.3.3效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測 根據(jù)二次多項式數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件，繪制考察指標(biāo)與影響較顯著的兩個自變量的三維效應(yīng)曲面圖及等高線圖，如圖1所示。利用回歸模型進(jìn)行分析，預(yù)測煙堿的提取率最大值為98.43%，最優(yōu)提取工藝條件為：浸泡時間為6 h，微波輻射時間7 min，固液比為0.1，微波功率為800W。

2.3.4驗證試驗 根據(jù)預(yù)測得出的最優(yōu)提取工藝條件，平行進(jìn)行3次驗證試驗，煙堿的提取率分別為97.23%、96.58%、97.35%，平均值為97.05%，RSD為1.5%，偏差率=（97.05%-98.43%）/98.43%=-1.40%，表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有準(zhǔn)確的預(yù)測性，所選工藝條件具有較好重復(fù)性。

3　討論

在多數(shù)的情況下，各因素對效應(yīng)的影響并非是線性的，國內(nèi)一般采用正交試驗設(shè)計和均勻試驗設(shè)計優(yōu)化工藝、篩選處方，即用線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，雖然試驗次數(shù)較少，但是精確度較低，預(yù)測性較差。選擇適合于非線性擬合的實驗設(shè)計方法，可以提高優(yōu)化效果，Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法就是一種較為成熟的方法。本實驗采用這種方法，可以評價指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系，充分考慮了各因素之間的交互作用，提高了實驗準(zhǔn)確性和預(yù)測性，已被較多地應(yīng)用于化學(xué)合成過程、生物過程等優(yōu)化，具有較好的應(yīng)用價值前景。

圖1　各因素對響應(yīng)值影響的三維效應(yīng)曲面圖和二維等高線圖

效應(yīng)面優(yōu)化法在藥物制劑中應(yīng)用較為廣泛［22-25］，但還沒有很好地應(yīng)用于現(xiàn)代中草藥行業(yè)中。本研究采用Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法對微波輔助提取煙堿的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行驗證試驗，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)合理的理論和實驗依據(jù)。

［1］ 趙保路.尼古丁預(yù)防帕金森氏綜合癥和老年癡呆癥的分子機理研究［J］.生物物理學(xué)報，2007，23（2）：81-91.

［2］ 謝渝湘，劉 強，張 杰，等.煙堿預(yù)防帕金森氏綜合癥和老年癡呆癥的分子機理［J］.中國煙草學(xué)報，2006，12（4）：25-30.

［3］ 魏榮寶.煙草植物在有機醫(yī)藥和農(nóng)藥中的應(yīng)用［J］.化學(xué)教育，2009，30（7）：1-4.

［4］ 黃 琳，殷 彤，董振香.戒煙新藥尼古丁透皮貼劑的臨床應(yīng)用和評價［J］.中國新藥雜志，2009，18（20）：1926-1929，1934.

［5］ 徐光奇，吳金虎.尼古丁透皮貼片和戒煙作用［J］.中國藥學(xué)雜志，1997，32（5）：268-270.

［6］ 衛(wèi) 青，劉維涓，蔡 卿，等.煙堿蒸餾簡易裝置及實驗條件研究［J］.云南化工，2004，31（2）：47-50.

［7］ 韓 麗，謝秀瓊，楊 明，等.丹參動態(tài)階段連續(xù)逆流提取工藝研究［J］.中成藥，2009，31（5）：721-724.

［8］ 黃蘭芳，胡 偉，謝建偉，等.加速溶劑萃取法提取煙葉揮發(fā)性成分條件的優(yōu)化［J］.光譜實驗室，2010，27（4）：1406-1410.

［9］ Alagic S，Stanic I.Chemical composition of the supercritical CO2extracts of the Yaka，Peilep and otlja tobaccos［J］.JEssent Oil Res，2006，18（8）：185-188.

［10］ 明寧寧，郭俊成，劉 強，等.煙草中生物堿的提取和分析方法研究進(jìn)展［J］.中國煙草學(xué)報，2003，13（3）：64-69.

［11］ 朱 松，婁在祥，陳尚衛(wèi)，等.超聲輔助酶法提取廢次煙葉中綠原酸、煙堿工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（5）：181-184.

［12］ Zhang B，Yang R，Liu C Z.Microwave-assisted extraction of chlorogenic acid from flower buds of Lonicera japonica Thunb［J］.Separat Purifi Technol，2008，62（2）：480-483.

［13］ 王亞紅，王亞麗，曲小姝.廢次煙葉中煙堿微波提取工藝研究［J］.河北化工，2010，33（7）：19-21.

［14］ 梁柏林，張 娜.低次煙葉超聲波提取煙堿工藝及數(shù)學(xué)模擬［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（21）：6457-6458.

［15］ 張立杰.煙堿的快速分析［J］.湖南化工，1999，29（3）：43-44.

［16］ Leslie D，Millen C，Raymond Murphy W.Countercurrent extraction of nicotine from tobacco juice［J］.Industrial and Engineering Chemistry Research，1993，32（12）：3056-3060.

［17］ 柯仲成，程子洋，陳 龍.Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化貫葉金絲桃中金絲桃苷的提取工藝［J］.中成藥，2012，34（10）：2023-2025.

［18］ 田寶成，賈昌平，楊軍濤.Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化紅旱蓮總黃酮提取工藝的研究［J］.中成藥，2010，32（3）：389-392.

［19］ 邱 遠(yuǎn)，芮 昕，謝翌冬.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取葛根素工藝［J］.食品科學(xué)，2014，35（6）：1-5.

［20］ 沈成英，王 冶，徐 和.Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化波棱甲素新型納米混懸速溶膜［J］.中草藥，2014，45（1）：37-41.

［21］ 董迪迪，王鴻飛，周增群.響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取楊梅籽油工藝條件的研究［J］.中國糧油學(xué)報，2014，29（2）：30-35.

［22］ 林小玲，田成旺，張鐵軍.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選參芪消巖顆粒滲漉提取工藝［J］.中草藥，2013，44（4）：430-433.

［23］ 張洪兵，朱雪瑜，張鐵軍.星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)選復(fù)方止痛巴布劑基質(zhì)處方［J］.中草藥，2013，44（8）：985-988.

［24］ 邢建國，王新春，張永軍，等.正交實驗聯(lián)用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化紫草素脂質(zhì)體處方［J］.中成藥，2010，32（3）：392-395.

［25］ 葉 蕾，胡容峰，王曉華，等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化葛根素自微乳工藝［J］.中成藥，2014，36（3）：514-519.

R284.2

B

1001-1528（2015）03-0670-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.049

2014-05-09

國家自然科學(xué)基金項目（21271006）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（AH201310375027）；安徽省優(yōu)秀青年人才基金重點項目（2013SQRL088ZD）；黃山學(xué)院自然科學(xué)研究項目（2012xkj006）

黃 飛（1983—），男，碩士，助教，主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究。Tel：（0559）2546625， E-mail：huangfei@hsu. edu.cn